细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

摘要

细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。

摘要

目前亟需实用的检测方法来可视化并定量细胞对外泌体（EV）的摄取。EV摄取在多个研究领域中均发挥着细胞间通讯的重要作用，包括癌症生物学、神经科学和药物递送。尽管已有大量文献报道了多种EV摄取检测方法，但仍缺乏实用且详细的实验操作流程。可通过荧光标记EV来检测其在细胞内的定位，从而评估EV的摄取情况。然而，准确测定EV摄取的关键在于区分细胞内化（internalized）的EV与附着在细胞表面的浅表EV，这一区分虽具挑战性却至关重要。因此，本研究提出一种通过三维（3D）荧光共聚焦显微镜高效定量EV摄取的检测方法。本方法利用基于纳米过滤的微流控装置制备荧光标记的EV，通过3D共聚焦显微镜进行可视化，并结合先进的图像处理软件进行分析。该实验方案为在细胞水平上分析EV提供了可靠的实验方法，同时也为高效分析EV摄取提供了切实可行的技术路径。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类纳米级的脂质膜包裹颗粒，根据其大小可分为微囊泡（ectosomes，100–500 nm）和外泌体（exosomes，50–150 nm）。¹细胞外囊泡（EVs）含有多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质。这些生物分子来源于细胞，在被包裹为内容物并释放到细胞外空间之前即已存在。 通过 细胞外囊泡^1,2,3.

由于携带多种物质，细胞外囊泡（EVs）被认为在细胞间通讯中发挥着积极作用。细胞释放和摄取EVs的过程可实现生物分子在细胞间的转移^4,5。EVs所携带的物质进入受体细胞后，可能改变该细胞的功能和稳态^4,5,6。EVs可通过多种途径被细胞内化，但其确切机制尚未被准确阐明。

大多数细胞外囊泡（EV）摄取检测方法，例如基因标记法，均采用荧光标记单个EV⁷。所产生的信号可通过微孔板光度计、流式细胞术或显微镜进行检测，但每种技术均存在显著局限性。微孔板光度计、流式细胞术或常规二维（2D）显微镜均无法区分被细胞内化的EV与表面附着的EV^8,9。此外，这些技术所需样本制备步骤可能为EV摄取评估引入额外问题。例如，在EV摄取分析前使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，可能会裂解部分附着于细胞表面的EV^10,11。胰蛋白酶还可能与细胞表面相互作用，影响细胞及EV的表型。此外，胰蛋白酶可能无法完全去除表面附着的EV，从而导致分离出的细胞群体出现偏差。

为了用荧光染料准确标记细胞外囊泡（EVs），需要额外的洗涤步骤以去除残留染料⁷。公认的一些分离技术也可能因EVs分离过程中发生的共沉淀现象而导致假阳性信号。例如，连续超速离心法（UC）被广泛用于EVs的分离以及去除未结合的染料。然而，UC可能导致EVs共沉淀，而残留染料可能引发假阳性信号^12,13。其他纳米过滤方法，如基于层析柱的过滤，也常用于去除未结合的染料。由于EVs与染料在层析柱基质中相互作用的复杂性，输入样品的复杂组成可能改变层析柱的分子截留阈值，从而导致残留染料无法完全去除^14,15,16。

本方案提出了一种基于纳米过滤的微流控装置，用于分离和洗涤荧光标记的分离EV。该基于纳米过滤的微流控装置可通过流体辅助分离技术（FAST）实现高效过滤via^17,18。FAST可降低滤膜两侧的压力降，从而减少EV与染料之间可能发生的聚集。通过高效去除残留染料，可提高荧光标记EV的质量及检测的特异性。

共聚焦显微镜能够区分细胞表面内化和浅表附着的细胞外囊泡（EVs），并以时空分辨率全面研究EVs摄取的细胞机制^{19,20,21,22,23,24,25}。例如，Sung 等人利用其开发的活细胞报告系统，实现了外泌体生命周期的可视化。通过共聚焦显微镜结合三维（3D）成像及后期图像处理工具，可检测并分析内化EVs的位置²⁰。尽管小EVs的尺寸（40–200 nm）低于光学显微镜的分辨率极限，但由于光电探测器能够检测到增强的荧光发射信号，因此仍可通过共聚焦显微镜检测荧光标记的EVs。因此，通过获取EVs及其周围细胞器的多个z轴层扫图像，可精确定位荧光标记EVs在细胞内的亚细胞分布。

此外，三维重建和数据后处理可进一步揭示内化、浅表及游离的细胞外囊泡（EV）的定位情况。将这些方法与共聚焦显微镜提供的延时活细胞成像相结合，可精确评估EV的摄取水平，并实现对EV摄取过程的实时追踪。进一步地，可通过共聚焦显微镜评估EV与细胞器的共定位情况，开展EV运输轨迹分析，这是确定内化后的EV如何参与细胞内功能的第一步。本方案描述了利用基于纳米过滤的微流控装置^17,26、共聚焦显微镜及图像后期分析技术进行EV摄取实验的方法学。

方案

1. 细胞外囊泡的分离及芯片内免疫荧光标记

1. 细胞培养基的收集及用于细胞外囊泡分离的培养基预处理
   1. 以30%汇合度在75 cm²培养瓶中接种PC3细胞² 细胞培养瓶。将对照细胞在标准培养基和细胞系特异性添加剂中培养至约90%汇合度（约48小时）。
      注意：为防止含有细胞外囊泡（EV）的成分影响细胞摄取（例如胎牛血清），请使用无外泌体培养基及配套补充剂。
   2. 收集条件培养基。
   3. 以 1000 x g 离心 CCM g 室温（RT）下离心10分钟，以沉淀随培养基收集的未贴壁细胞和大块碎片。将上清液转移至新的锥形管中。
   4. 在新试管中，将上清液以 10,000 x g 在4 °C下离心20分钟，以沉淀培养基中残留的较小碎片和凋亡小体。部分较大的细胞外囊泡会沉淀。将上清液转移至新管中。
   5. 通过0.45 µm亲水性聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器过滤上清液。
      注意：若不立即进行CCM的EV分离，应将预处理后的CCM储存于-80 °C，直至进行分离操作。若已冷冻，冻融循环次数应限制为一次。
2. 使用基于纳米过滤的微流控装置从条件培养基中分离细胞外囊泡
   1. 若为冷冻保存，需在步骤1.2.2之前将CCM完全解冻，并涡旋振荡30秒。
   2. 注入1 mL预处理的CCM（步骤1.1）至基于纳米过滤的微流控装置的样品室（参见 材料表)^17,26.
      注意：遵循基于纳米过滤的微流控装置的标准操作程序^17,26.
   3. 在台式离心机中以3000 rpm离心10分钟（参见 材料表）以操作微流控装置。
      注意：如果初始运行后仍有 CCM 残留在样品室中，需进行额外离心，直至所有 CCM 完全从样品室排出。
   4. 用移液器移除废液室中的液体，并重复步骤1.2.1、1.2.2和1.2.3两次。
      注意：总共将处理 3 mL 的 CCM 用于 EV 分离。
   5. 向样品室中注入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以洗涤分离的细胞外囊泡（EVs）。按照步骤1.2.3所述，将装置放入台式旋转机中运行微流控设备。在装置的膜上定位纯化的EVs。
      注意：此前的研究已通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、结构照明显微镜、酶联免疫吸附测定以及实时PCR，对基于纳米过滤的微流控装置分离的EVs质量进行了确认，并与传统的超速离心（UC）方法进行了比较^17,26.
3. 基于纳米过滤微流控装置的细胞外囊泡免疫荧光标记图1)
   1. 根据实验目的选择一种EV特异性抗体（参见 材料表).
      注意：某些抗体可能会干扰与细胞外囊泡（EV）摄取途径（即内吞作用）特异性相关的配体结合位点。
   2. 向含有100 µL分离EV的装置洗脱孔中注入1 µg/mL的EV特异性抗体。
   3. 在室温下避光孵育1小时，同时使用平板摇床振荡，以确保抗体在样品中均匀分布。
   4. 将粘性胶带贴在洗脱孔上。向样本室中注入1 mL PBS，以冲洗残留的抗体。
   5. 以3000 rpm的转速离心，直至样本室排空。用移液器吸除废液室中的液体。向样本室注入1 mL PBS。
      注意：荧光标记的EVs将位于膜室中。
   6. 移液加入荧光标记的EVs（图2) 从膜室转移至棕色管中。避光保存直至使用。

2. 细胞与荧光标记的细胞外囊泡共孵育以进行细胞外囊泡摄取检测

1. 靶细胞接种及在细胞培养兼容培养皿中的培养。
   1. 将 1 × 10⁴ 个 PC3 细胞接种至含 0.2 mL 培养基的 8 孔微孔板（每孔尺寸：9.4 × 10.7 mm），或将 4 × 10⁴ 个 PC3 细胞接种至含 1 mL 培养基的 35 mm 培养皿中。将细胞接种于由薄盖玻片（厚度：0.18 mm）构成的细胞培养兼容培养皿中。
      注：薄盖玻片可最大限度减少光的散射干扰。
   2. 在最佳细胞培养条件下（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）孵育细胞过夜，使其贴壁。
   3. 用外泌体耗尽培养基（见步骤 1.1.1）洗涤贴壁细胞两次。
2. 用荧光标记的细胞外囊泡（EVs）孵育细胞。
   1. 通过纳米颗粒追踪分析（NTA，补充图 1）测定荧光标记 EVs 的浓度（步骤 1.3.5）。确定应加入培养细胞中的荧光标记 EVs 的最佳浓度（见步骤 2.1.2）。
   2. 用外泌体耗尽培养基稀释荧光标记的 EVs，使其达到步骤 2.2.1 中测定的目标浓度（例如，在 200 µL 外泌体耗尽培养基中加入 7.80 × 10⁹ 个 EVs（NTA 测定值））。
   3. 将稀释后的 EVs（步骤 2.2.2）加入步骤 2.1.2 中准备好的贴壁靶细胞中，孵育设定的实验时间（例如，4、8 或 12 小时）。
   4. 用无外泌体培养基洗涤细胞三次，以去除未被内化的 EVs。
      注：可选步骤：洗涤后可对细胞进行固定。
   5. 用 1 µg/mL 的 CMTMR（(5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基) 胼甲基罗丹明）对贴壁细胞的细胞质进行标记（见 材料表），并在最佳细胞培养条件下（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）孵育。
      注：细胞区域染料的荧光发射应与标记 EVs 的荧光分离，以便在 EV 摄取实验中判断添加 EVs 的空间位置（是否内化或仅位于表面）。
   6. 用外泌体耗尽培养基洗涤标记细胞两次，以去除残留染料。向细胞中加入新鲜的外泌体耗尽培养基，准备进行活细胞共聚焦成像。

3. 共聚焦显微镜

1. 进行活细胞成像时，使用载物台培养箱以维持最佳的细胞培养条件（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）。
2. 将准备好的细胞放入载物台培养箱中。
3. 根据对照样品设置成像参数。
   注意：建议的对照样品包括：仅带荧光标记的细胞外囊泡（EVs）、带荧光标记的细胞、无标记的细胞外囊泡以及无标记的细胞。
4. 确定目标细胞的深度以及Z方向上的堆叠范围，以获取三维共聚焦图像。
   注意：Z堆叠的厚度为1 µm。共聚焦三维图像采集持续2分34秒（每个Z平面图像采集约需8秒；共采集二十个Z堆叠图像）。
5. 同时设置针对细胞特异性染料（即红色）和细胞外囊泡特异性染料（即绿色）的多Z层堆叠图像采集（图3 和 图4A）。

4. 图像处理

1. 使用自动图像处理软件分析原始的 z 轴堆叠共聚焦图像，以确定细胞对细胞外囊泡（EV）的摄取情况（参见材料表）。
2. 设置细胞和 EV 特异性染料的荧光信号阈值参数，构建细胞的虚拟表面（图 4A、B）。
   1. 要构建细胞的虚拟表面，请点击 添加新表面（Add new Surfaces） 按钮。
   2. 选择 最短距离计算（Shortest Distance Calculation） 作为 "算法设置（Algorithm Settings）"，以使用软件提供的算法，然后点击 下一步：源通道（Next: Source Channel）。
   3. 在本实验中，选择 通道 2 - CMTMR（Channel 2 - CMTMR） 作为 "源通道（Source Channel）"。
   4. 选择 平滑（Smooth），并在 "表面细节（Surfaces Detail）" 中输入适当的数值以进行表面平滑。
      注：本实验中为 0.57 µm，因为原始成像数据中 1 像素代表 0.57 µm。
   5. 选择 绝对强度（Absolute Intensity） 作为 "阈值设定（Thresholding）"。
   6. 要使用软件提供的算法自动对荧光图像进行阈值分割，请点击 阈值（绝对强度）：数值将自动设定（Threshold (Absolute Intensity): The value is automatically set）。
   7. 选择 启用（Enable） 作为 "分割接触对象（区域生长法）（Split touching Objects (Region Growing)）"，并在 "种子点直径（Seed Points Diameter）" 中输入估计的细胞大小，本实验中为 10.0 µm。然后点击 下一步：过滤种子点（Next: Filter Seed Points）。
   8. 要配置虚拟细胞表面，请点击 + 添加（+ Add） 按钮，然后选择 质量（Quality） 作为 "过滤类型（Filter Type）"。通过目视检查设定合适的下限值（本实验中为 210）和上限最大值（1485），然后点击 完成（Finish） 按钮。
      注：目视检查是指研究人员能够从原始荧光图像中区分出细胞区域。
   9. 接下来，要构建 EV 的虚拟点，请点击 添加新点（Add new Spots） 按钮。
   10. 选择 不同点大小（区域生长法）（Different Spot Sizes (Region Growing)） 和 最短距离计算（Shortest Distance Calculation） 作为 "算法设置（Algorithm Settings）"，然后点击 下一步：源通道（Next: Source Channel）。
   11. 在本实验中，选择 通道 1 - Alexa Fluor 488（Channel 1 - Alexa Fluor 488） 作为 "源通道（Source Channel）"。
   12. 在 "估计的 XY 直径（Estimated XY Diameter）" 中输入适当的数值以进行点检测，本实验中为 1 µm。然后点击 下一步：过滤点（Next: Filter Spots）。
   13. 要配置虚拟 EV 点，请点击 + 添加（+ Add） 按钮，选择 质量（Quality） 作为 "过滤类型（Filter Type）"，并通过目视检查设定 "下限阈值（Lower Threshold）"，本实验中为 100。然后点击 下一步：点区域类型（Next: Spot Region Type） 按钮。
   14. 选择 绝对强度（Absolute Intensity） 作为 "点区域类型（Spot Regions Type）"，然后点击 下一步：点区域（Next: Spot Regions）。
   15. 为对 EV 点区域进行阈值分割，通过目视检查在 "区域阈值（Region Threshold）" 中输入适当的数值，本实验中 "区域阈值（Region Threshold）" 设为 100。
       注：目视检查是指研究人员能够从原始荧光图像中区分出 EV 区域。
   16. 选择 区域体积（Region Volume） 作为 "直径来源（Diameter from）"，然后点击 完成（Finish）。
3. 使用软件提供的算法，将第 4.2 步构建的表面内部聚集的点进行分割（图 4C、i-iv）。
   1. 点击已构建的 点（Spots），然后进入 过滤器（Filters）。
   2. 点击 + 添加（+ Add） 按钮，然后选择 到表面的最短距离 表面 = 表面 1（Shortest Distance to Surfaces Surfaces = Surface 1） 作为 过滤类型（Filter Type），然后点击 复制选中内容至新点（Duplicate Selection to new Spots） 按钮。下限阈值设为最低值（本实验中为 -7.0），上限设为适当值（-0.5）。
      注：上限应根据 点（Spots） 的估计半径设定。本实验中，点（Spots）（即 EV 点）的估计直径在第 4.2.11 步中设为 1 µm，因此上限可设为 0.5。
4. 自动统计细胞内部的 EV 数量
   注：软件将自动统计细胞内部的 EV 数量，该数值表示靶细胞内化的 EV 数量。
   1. 点击已构建的 点 1 选中项 [到表面的最短距离 表面 = 表面 1 介于 -7.00 与 -0.500 之间]（Spots 1 selection [Shortest Distance to Surfaces Surfaces = Surfaces 1 between -7.00 and -0.500]）。
   2. 进入 统计（Statistics），并从 "点的总数（Total Number of Spots）" 导出数值。
      注：软件提供的算法将自动计算细胞的数量和体积。
5. 根据上述计算结果，确定每个孵育时间段内 EV 摄取的产量（图 5）。
   1. 为获得细胞数量，请点击已构建的 表面 1（Surfaces 1），然后进入 统计（Statistics），并从 总体（Overall） 导出 "表面总数（Total Number of Surfaces）" 的数值。
   2. 进入 统计（Statistics） 中的 详细（Detailed） 项，以从 详细（Detailed） 中导出 体积（Volume）。

结果

利用基于纳米过滤的微流控装置，从PC3细胞条件培养基（CCM）中分离出细胞外囊泡（EVs），并用荧光标记的EV特异性抗体（CD63）进行标记（图1）。通过三维共聚焦显微镜成功观察到标记的EVs（图2）。将标记的EVs在无外泌体培养基中与细胞共孵育数小时。孵育后，用无外泌体培养基洗涤细胞。在此期间，残留的EVs被细胞内化或附着于细胞表面。对细胞区域进行标记。内化的EVs表现为点状结构^19,20,24,27，可观察到单个EV（图3 和 图4A）。对这些图像进行后期处理，可实现对EV内化进入细胞的过程进行可视化和定量分析（

讨论

基于三维荧光成像的细胞外囊泡摄取检测方法 通过 共聚焦显微镜提供了一种高效且灵敏的分析方法。这种荧光标记EV的技术有助于EV的可视化，并成功实现了精确的EV摄取检测。既往报道的EV标记及去除残留染料的方法主要通过超速离心（UC）去除沉淀物；然而，UC可能导致EV共沉淀，且固定在样品上的染料可能产生假阳性信号^12,13基于纳米过滤的微流控装置可消除外泌体（EVs）与染料的共沉淀，从而提升荧光标记EVs的质量及检测的特异性。通过体积分析法测量EV摄取量，可区分并定量细胞内化EVs与附着于细胞表面的浅表EVs。EV摄取的体积分析可依据细胞大小对EV摄取量进行归一化处理。利用载物台式共聚焦显微镜培养箱实现了活细胞EV摄取检测。该方案适用于需要活细胞培养与EVs的研究。可在三维视野中进行实时细胞内EV追踪。此外，通过该方案还可实现对EV运输过程的空间-时间分辨率分析，以及EV与亚细胞器共定位的分析。补充图2）。本文所述方案是用于细胞外囊泡（EVs）细胞学分析的有力工具。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 抗人 CD63 抗体	Biolegend	353038	偶联荧光染料的外泌体特异性抗体
CellTracker Orange CMTMR 染料	Thermo Fisher Scientific	C2927	活细胞（细胞质）荧光标记试剂
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	共聚焦成像物镜，NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	共聚焦成像物镜，NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	基于纳米过滤的微流控外泌体分离装置
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Exodisc 操作设备
去外泌体胎牛血清（Exosome-depleted FBS）	Thermo Fisher Scientific	A2720801	用于 PC3 细胞系外泌体收集的细胞培养基营养成分
胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）	VWR	1500-500	细胞培养营养成分
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	用于外泌体标记阴性对照的小鼠 IgG 抗体
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	用于共聚焦成像的培养皿
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	图像后处理软件
Incubator System+ CO2/O2/N2 气体混合器	Live Cell Instrument	TU-O-20	用于活细胞成像的培养箱系统
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 相机	Nikon	NA	共聚焦成像相机
Nikon Eclipse Ti 显微镜	Nikon	NA	用于共聚焦成像的倒置显微镜
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Nikon 显微镜图像处理软件
NTA，NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	外泌体浓度检测设备
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	绘图软件
青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）	Thermo Fisher Scientific	15140122	细胞培养用抗生素
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	用于 PC3 细胞系培养的细胞培养基
SYTO RNASelect Green Fluorescent 细胞染色剂 - DMSO 中的 5 mM 溶液	Thermo Fisher Scientific	S32703	用于外泌体标记的 RNA 荧光染色染料