细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。
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摘要
摘要
目前亟需实用的检测方法来可视化并定量细胞对外泌体（EV）的摄取。EV摄取在多个研究领域中均发挥着细胞间通讯的重要作用，包括癌症生物学、神经科学和药物递送。尽管已有大量文献报道了多种EV摄取检测方法，但仍缺乏实用且详细的实验操作流程。可通过荧光标记EV来检测其在细胞内的定位，从而评估EV的摄取情况。然而，准确测定EV摄取的关键在于区分细胞内化（internalized）的EV与附着在细胞表面的浅表EV，这一区分虽具挑战性却至关重要。因此，本研究提出一种通过三维（3D）荧光共聚焦显微镜高效定量EV摄取的检测方法。本方法利用基于纳米过滤的微流控装置制备荧光标记的EV，通过3D共聚焦显微镜进行可视化，并结合先进的图像处理软件进行分析。该实验方案为在细胞水平上分析EV提供了可靠的实验方法，同时也为高效分析EV摄取提供了切实可行的技术路径。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类纳米级的脂质膜包裹颗粒，根据其大小可分为微囊泡（ectosomes，100–500 nm）和外泌体（exosomes，50–150 nm）。1细胞外囊泡（EVs）含有多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质。这些生物分子来源于细胞，在被包裹为内容物并释放到细胞外空间之前即已存在。 通过 细胞外囊泡1,2,3.
由于携带多种物质，细胞外囊泡（EVs）被认为在细胞间通讯中发挥着积极作用。细胞释放和摄取EVs的过程可实现生物分子在细胞间的转移4,5。EVs所携带的物质进入受体细胞后，可能改变该细胞的功能和稳态4,5,6。EVs可通过多种途径被细胞内化，但其确切机制尚未被准确阐明。
大多数细胞外囊泡（EV）摄取检测方法，例如基因标记法，均采用荧光标记单个EV<....
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方案
1. 细胞外囊泡的分离及芯片内免疫荧光标记
- 细胞培养基的收集及用于细胞外囊泡分离的培养基预处理
- 以30%汇合度在75 cm²培养瓶中接种PC3细胞2 细胞培养瓶。将对照细胞在标准培养基和细胞系特异性添加剂中培养至约90%汇合度（约48小时）。
注意：为防止含有细胞外囊泡（EV）的成分影响细胞摄取（例如胎牛血清），请使用无外泌体培养基及配套补充剂。 - 收集条件培养基。
- 以 1000 x g 离心 CCM g 室温（RT）下离心10分钟，以沉淀随培养基收集的未贴壁细胞和大块碎片。将上清液转移至新的锥形管中。
- 在新试管中，将上清液以 10,000 x g 在4 °C下离心20分钟，以沉淀培养基中残留的较小碎片和凋亡小体。部分较大的细胞外囊泡会沉淀。将上清液转移至新管中。
- 通过0.45 µm亲水性聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器过滤上清液。
注意：若不立即进行CCM的EV分离，应将预处理后的CCM储存于-80 °C，直至进行分离操作。若已冷冻，冻融循环次数应限制为一次。
- 以30%汇合度在75 cm²培养瓶中接种PC3细胞2 细胞培养瓶。将对照细胞在标准培养基和细胞系特异性添加剂中培养至约90%汇合度（约48小时）。
- 使用基于纳米过滤的微流控装置从条件培养基中分离细胞外囊泡
- 若为冷冻保存，需在步骤1.2.2之前将CCM完全解冻，并涡旋振荡30秒。
- 注入1 mL预处理的C....
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结果
采用基于纳米过滤的微流控装置，从PC3细胞条件培养基（CCM）中分离出细胞外囊泡（EVs），并使用荧光标记的EV特异性抗体（CD63）进行标记（图1）。通过三维共聚焦显微镜成功观察到标记后的EVs（图2）。将标记的EVs在无外泌体培养基中与细胞共孵育数小时。孵育结束后，用无外泌体培养基洗涤细胞。在此期间，残留的EVs被细胞内化或黏附于细胞表面。对细胞区域进行标记。内化的EVs表现为点状结构19,20,24,27，可观察到单个EV（图3 和 图4A）。对这些图像进行后期处理，可实现对EV内化过程的可视化及定量分析（
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讨论
基于三维荧光成像的细胞外囊泡摄取检测方法 通过 共聚焦显微镜提供了一种高效且灵敏的分析方法。这种荧光标记EV的技术有助于EV的可视化，并成功实现了精确的EV摄取检测。既往报道的EV标记及去除残留染料的方法主要通过超速离心（UC）去除沉淀物；然而，UC可能导致EV共沉淀，且固定在样品上的染料可能产生假阳性信号12,13基于纳米过滤的微流控装置可消除外泌体（EVs）与染料的共沉淀，从而提升荧光标记EVs的质量及检测的特异性。通过体积分析法测量EV摄取量，可区分并定量细胞内化EVs与附着于细胞表面的浅表EVs。EV摄取的体积分析可依据细胞大小对EV摄取量进行归一化处理。利用载物台式共聚焦显微镜培养箱实现了活细胞EV摄取检测。该方案适用于需要活细胞培养与EVs的研究。可在三维视野中进行实时细胞内EV追踪。此外，通过该方案还可实现对EV运输过程的空间-时间分辨率分析，以及EV与亚细胞器共定位的分析。补充图2）。本文所述方案是用于细胞外囊泡（EVs）细胞学分析的有力工具。
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披露
Y.-K. Cho 是基于纳米过滤的微流控装置 Exodisc 相关专利的发明人，这些专利已授权给 Labspinner（韩国蔚山）。其余所有作者均无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国家癌症研究所（NCI）基金项目 U54CA143803、CA163124、CA093900 和 CA143055（授予 K. J. P.）的支持。本研究还得到了韩国卫生技术研究开发项目（Korea Health Technology R&D项目，由韩国健康产业开发院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 &韩国卫生福利部（资助编号：HI19C1122）。J. Kim 和 Y.-K. Cho 的工作由韩国基础科学研究所（IBS-R020-D1）资助，资金来自韩国政府。作者感谢布雷迪泌尿学研究所现任及前任成员，特别是Pienta-Amend实验室成员对本文稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 抗人 CD63 抗体 | Biolegend | 353038 | 偶联荧光染料的外泌体特异性抗体 |
| CellTracker Orange CMTMR 染料 | Thermo Fisher Scientific | C2927 | 活细胞（细胞质）荧光标记试剂 |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | 共聚焦成像物镜，NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | 共聚焦成像物镜，NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | 基于纳米过滤的微流控外泌体分离装置 |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Exodisc 操作设备 |
| 去外泌体胎牛血清（Exosome-depleted FBS） | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | 用于 PC3 细胞系外泌体收集的细胞培养基营养成分 |
| 胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS） | VWR | 1500-500 | 细胞培养营养成分 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | 用于外泌体标记阴性对照的小鼠 IgG 抗体 |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | 用于共聚焦成像的培养皿 |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | 图像后处理软件 |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 气体混合器 | Live Cell Instrument | TU-O-20 | 用于活细胞成像的培养箱系统 |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 相机 | Nikon | NA | 共聚焦成像相机 |
| Nikon Eclipse Ti 显微镜 | Nikon | NA | 用于共聚焦成像的倒置显微镜 |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Nikon 显微镜图像处理软件 |
| NTA，NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | 外泌体浓度检测设备 |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | 绘图软件 |
| 青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 细胞培养用抗生素 |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | 用于 PC3 细胞系培养的细胞培养基 |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent 细胞染色剂 - DMSO 中的 5 mM 溶液 | Thermo Fisher Scientific | S32703 | 用于外泌体标记的 RNA 荧光染色染料 |
参考文献
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
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重印与许可
