测量CD95死亡诱导信号传导复合物的组成和该复合物中Procaspase-8的处理

Summary

在这里，提出了一种实验工作流程，可以直接在死亡诱导信号复合物（DISC）上检测caspase-8处理并确定该复合物的组成。这种方法具有广泛的应用，从解开细胞死亡途径的分子机制到细胞凋亡网络的动态建模。

Abstract

外源性细胞凋亡由死亡受体（DR）的激活介导，例如CD95 / Fas / APO-1或肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）受体1 /受体2（TRAIL-R1 / R2）。这些受体及其同源配体的刺激导致死亡诱导信号复合物（DISC）的组装。DISC包括DR，具有死亡结构域的适应蛋白Fas相关蛋白（FADD），procaspases-8/-10和细胞FAD样白细胞介素（IL）-1β-转化酶抑制蛋白（c-FLIP）。DISC用作procaspase-8处理和激活的平台。后者 通过其 在DISC上组装的死亡效应域（DED）细丝中的二聚/寡聚化发生。

procaspase-8的激活之后是其处理，其分几个步骤进行。在这项工作中，描述了一个已建立的实验工作流程，该工作流程允许测量DISC形成和处理该复合物中的procaspase-8。该工作流程基于免疫沉淀技术，并辅以蛋白质印迹分析。该工作流程允许仔细监测PROCASPASE-8募集到DISC及其处理的不同步骤，并且与研究外源性凋亡的分子机制高度相关。

Introduction

研究最好的死亡受体（DRs）之一是CD95（Fas，APO-1）。外源性凋亡途径始于DR与其同源配体的相互作用，即CD95L与CD95相互作用或TRAIL与TRAIL-Rs结合。这导致在相应的DR处形成DISC，DISC由CD95，FADD，procaspase-8 / -10和c-FLIP蛋白^1，2组成。此外，DISC是通过含死亡域（DD）的蛋白质（例如CD95和FADD）与含DED的蛋白质（例如FAD，procaspase-8 / -10和c-FLIP）之间的相互作用组装的（图1）。Procaspase-8通过其DED的结合经历寡聚化，导致DED细丝的形成，然后Procaspase-8的激活和处理。这触发了半胱天冬酶级联反应，导致细胞死亡（图1）3、4。因此，procaspase-8是由CD95或TRAIL-Rs介导的外源性凋亡途径的中枢引发子半胱天冬酶，在相应的大分子平台DISC上激活。

已知Procaspase-8的两种亚型，即procaspase-8a（p55）和-8b（p53），....

Protocol

T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。

1. 为实验准备细胞

注意:这种免疫沉淀的平均细胞数为1×10⁷_。 贴壁细胞必须在实验前一天接种，以便在实验当天有1×10^个7 个细胞。

1. 为实验准备贴壁细胞
   1. 在实验开始前一天，将10⁶ 个贴壁细胞×10个6个贴壁细胞在20 mL培养基中（参见成分 材料表 ），用于14.5cm培养皿中的每种条件。
   2. 在实验当天，确保细胞80-90%汇合并粘附在培养皿上。丢弃培养基并将新鲜培养基加入贴壁细胞中。
2. 为实验准备悬浮细胞
   1. 在实验开始之前，将1×10⁷ 个悬浮细胞小心地置于10 mL培养基（参见成分 的材料表 ）中，立即放入14.5cm培养皿中。
   2. 如果使用原代细胞，则根据先前描述的程序²¹分离原代T细胞。用1μg/ mL植物血凝素处理原代T细胞24小时，然后用25 U / mL IL2处理6天。
   3. 在实验开始之前，将1×10⁸ 个原代T细胞小心地置于10 mL培养基....

Results

为了分析CASPASE-8募集到DISC及其在CD95 DISC上的处理，本文描述了一种经典的工作流程，该工作流程将CD95 DISC的IP与蛋白质印迹分析相结合。这允许在DISC上检测半胱天冬酶-8激活的几个关键特征:半胱天冬酶-8激活大分子平台的组装，Procaspase-8向DISC的募集，以及该引发子半胱天冬酶的处理（图1和图2）。该工作流程涉及以时间依赖性方式用CD95L处理敏感细胞，然后裂解，使用抗CD95（抗APO-1）抗体进行免疫沉淀，以及随后的蛋白质印迹分析（图3）。

以宫颈癌HeLa-CD95细胞为例分析DISC的形成^26。用CD95L刺激这些细胞导致高水平的CD95 DISC形成， 通过 CD95免疫沉淀监测（图4）。在这些CD95免疫沉淀中观察到CD95，F.......

Discussion

这种方法首先由Kischkel等人²⁷ 描述，并从那时起由几个小组成功开发。为了在该复合物中进行有效的DISC免疫沉淀和监测半胱天冬酶-8处理，必须考虑几个重要问题。

首先，在免疫沉淀期间必须遵循所有洗涤步骤。特别重要的是琼脂糖珠的最终洗涤步骤和蜂蜡珠的干燥。必须正确完成此操作以增加免疫沉淀的信噪比，从而允许在DISC上检测caspase-8募集和处理。重要的是，对于非常灵敏的分析技术，例如质谱，"预清除步骤"，包括仅用琼脂糖珠或同种型对照抗体孵育裂解物，在降低噪声方面也很重要。然而，一些研究表明，这个预清除步骤对于通过蛋白质印迹检测CASPASE-8募集到DISC中并不是必需的^7，23。然而，如前所述，在免疫沉淀结束时洗涤珠子对于获得可靠的结果至关重要。丰富的细胞蛋白与海芋微珠的非特异性结合基本上可以减少核心DISC组分的特定信号。作为不存在非特异性结合的重要对照，可以对据报道在DISC中不存在的蛋白质进行蛋白质的蛋.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS 凝胶	自制		，用于两块分离凝胶： 3.28 mL 蒸馏 H2O 2.5 mL Tris;pH 值 8.8;1.5 M 4.06 mL 丙烯酰胺 100 &微量;L 10% SDS 100 &微量;L 10% APS 7.5 µ用于两块收集凝胶的 L TEMED ： 3.1 mL 蒸馏 H2O 1.25 mL Tris;pH 值 6.8;1.5 M 0.5 mL 丙烯酰胺 50 µL 10% SDS 25 &微量;L 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm 细胞培养皿	Greiner	639160
丙烯酰胺	Carl Roth	A124.1
气溶胶过滤器移液器吸头，带高回收率过滤器和广口	VWR	46620-664（北美）或 732-0559（欧洲）	用于将微珠移液至裂解物
抗肌动蛋白抗体	Sigma Aldrich	A2103	稀释度：PBST 中 1：4000 + 1：100 NaN3
抗 APO-1 抗体	在这些实验中由 P. Krammer 教授提供，也可由 Enzo	ALX-805-038-C100	仅用于免疫沉淀
抗半胱天冬酶-10 抗体	Biozol	MBL-M059-3	稀释度：PBST 中 1：1000 + 1：100 NaN3
抗半胱天冬酶-3 抗体	细胞信号传导	9662 S	稀释度：PBST 中 1：2000 + 1：100 NaN3
. Krammer 教授在这些实验中提供的	抗 caspase-8 抗体 C15	ALX-804-242-C100	度：PBST 中 1：20 + 1：100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	稀释度：PBST 中 1：2000 + P. Krammer 教授在这些实验中提供的 1：100 NaN3
抗 c-FLIP NF6 抗体	或通过 ENZO	ALX-804-961-0100	购买稀释度：PBST 中 1：10 + 1：100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	P. Krammer 教授在这些实验中提供，或通过 ENZO	ADI-AAM-212-E	稀释度：PBST 中 1：10 + 1：100 NaN3
anti-PARP Ab	细胞信号转导	9542	稀释度：PBST 中 1：1000 + 1：100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
&β;-巯基乙醇	Carl Roth	4227.2
Bradford 溶液 蛋白质测定染料试剂浓缩液 450ml	Bio Rad	500-0006	根据制造商的说明使用
CD95L	P. Krammer 教授在这些实验中提供，或者可以通过 ENZO	ALX-522-020-C005
发光检测器购买 化学文档 XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese 抑制剂混合物 （PIC）	Sigma Aldrich	11 836 145 001	根据制造商的说明制备
DPBS （10x） 不含钙、Mg	PAN Biotech	P04-53500	：10 含 H2O，储存在冰箱
泳缓冲液	中自制		10x 电泳缓冲液： 60.6 g Tris 288 g 甘氨酸 20 g SDS ad 2 L H2O 使用前 1：10 稀释
甘氨酸 甘氨酸	Carl Roth	3908.3
山羊抗小鼠 IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	稀释 1：10.000 在 PBST + 5% 牛奶
山羊抗小鼠 IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	稀释 1：10.000 inPBST + 5% 牛奶
山羊抗兔 IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	在 PBST 中以 1：10.000 的比例稀释 + 5% 牛奶
白细胞介素-2 人 （hIL-2）	默克集团/罗氏	11011456001	用于激活 T 细胞
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
上样缓冲液 4x Laemmli 样品缓冲液，10 mL	Bio Rad	161-0747	根据制造商的说明制备
Luminata Forte Western HRP 底	Millipore	WBLUFO500
裂解缓冲液	自制		13.3 mL Tris-HCl;pH 7.4;1.5 M 27.5 mL NaCl;5 M 10 mL EDTA;2 mM 100 mL Triton X-100 添加 960 mL H2O
用于 adhaderent 细胞的培养基 DMEM F12 （1：1） w 稳定的谷氨酰胺，  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	培养基中添加 10% FCS、1% 青霉素-链霉素和 0.0001% 嘌
	by	Life Technologie 21875034
中添加 10% FCS 和 1% 青霉素-链霉素Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl	Roth 3957.2
PBST	自制		20x PBST： 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL 吐温-20 ad 2 L H2O 使用前 1：20 稀释
PBST + 5% 牛奶	自制		50 克奶粉 + 1 L PBST
PHA	用于激活 T 细胞	赛默飞世尔科技	R30852801
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus 蛋白质标准品 所有	Bio Rad	161-0373	在 3-5 和 micro 之间使用;L
蛋白 A 琼脂糖凝胶 CL-4B 珠子	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	亲和树脂珠，根据制造商的说明制备
刮刀	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
摇床	Heidolph
叠氮化钠	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo 小型转印膜组	Bio Rad	170-4270	根据制造商说明使用
TransBlot Turbo 5x 转印缓冲液	Bio Rad	10026938	根据制造商说明制备
TransBlot Turbo 小型碳纤维素膜	Bio Rad	170-4270	根据制造商的说明使用
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem溶质	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000