测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

摘要

本文介绍了一种实验流程，可直接在死亡诱导信号复合物（DISC）处检测caspase-8的加工过程，并确定该复合物的组成。该方法具有广泛的应用，从揭示细胞死亡通路的分子机制到凋亡网络的动态建模均可适用。

摘要

外源性凋亡由死亡受体（DRs）的激活介导，例如 CD95/Fas/APO-1 或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体1/受体2（TRAIL-R1/R2）。这些受体与其相应配体结合后，可诱导死亡诱导信号复合物（DISC）的组装。DISC 包括死亡受体（DR）、含死亡结构域的 Fas 相关蛋白（FADD）、前体半胱天冬酶-8/-10（procaspases-8/-10）以及细胞内 FADD 样白细胞介素（IL）-1β 转化酶抑制蛋白（c-FLIPs）。DISC 作为前体半胱天冬酶-8 加工和活化的平台。后者的发生过程如下 通过 其在死亡效应结构域（DED）丝状结构中的二聚化/寡聚化，该丝状结构组装于DISC。

前体caspase-8的活化随后是其加工过程，该过程分为多个步骤。本文描述了一种成熟的实验流程，可用于检测死亡诱导信号复合物（DISC）的形成以及前体caspase-8在该复合物中的加工。该流程基于免疫共沉淀技术，并结合蛋白质印迹分析。此方法可精确监测前体caspase-8招募至DISC的不同阶段及其后续加工过程，对于研究外源性凋亡的分子机制具有重要意义。

引言

研究最为深入的死亡受体（DRs）之一是CD95（Fas，APO-1）。外源性凋亡通路始于死亡受体与其同源配体的相互作用， 即， CD95L 与 CD95 相互作用，或 TRAIL 与 TRAIL-Rs 结合，导致在相应死亡受体（DR）处形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC 由 CD95、FADD、前体半胱天冬酶-8/-10（procaspase-8/-10）和 c-FLIP 蛋白组成。^1,2此外，死亡诱导信号复合物（DISC）由含有死亡结构域（DD）的蛋白质（如CD95和FADD）与含有死亡效应结构域（DED）的蛋白质（如FADD、前体caspase-8/-10和c-FLIP）之间的相互作用组装而成。图1。前体caspase-8发生寡聚化 通过 其DED结构域的结合，导致DED纤维的形成，随后激活并剪切前体caspase-8。这会触发caspase级联反应，最终导致细胞死亡（图1)^3,4因此，前体caspase-8是CD95或TRAIL-R介导的外源性凋亡通路中的关键起始caspase，可在相应的大型分子复合平台DISC上被激活。

已知有两种procaspase-8的同工型，即procaspase-8a（p55）和procaspase-8b（p53），可被招募至DISC⁵。这两种同工型均包含两个DED结构域。DED1和DED2位于procaspase-8a/b的N端区域，其后依次为催化亚基p18和p10结构域。对procaspase-8的DED结构域进行的高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析揭示，procaspase-8蛋白可组装成称为DED纤维的丝状结构^4,6。最初研究认为，线性排列的procaspase-8链通过二聚化参与并在DISC处激活procaspase-8。然而目前研究表明，这些线性链仅是procaspase-8 DED纤维的亚结构，完整的DED纤维由三条链组装成三螺旋结构^3,4,6,7。

在DED纤维上发生二聚化后，前体半胱天冬酶-8a/b发生构象变化，导致前体半胱天冬酶-8活性中心的形成及其激活^3,8随后是由介导的procaspase-8加工处理 通过 两条通路：第一条通路走向 通过 p43/p41切割产物的生成以及第二个产物 通过 p30切割产物的初始生成。p43/p41通路由procaspase-8a/b在Asp374位点的切割启动，产生p43/p41和p12切割产物（图2。此外，这些片段在 Asp384 以及 Asp210/216 位点发生自催化裂解，从而形成具有活性的半胱天冬酶-8 异源四聚体 p10₂/p18₂^9,10,11此外，研究显示，在p43/p41加工途径的同时，procaspase-8a/b也在Asp216位点被切割，产生C末端切割产物p30，随后该产物进一步发生蛋白水解，生成p10和p18¹⁰ (图2).

DED 丝状结构中 procaspase-8a/b 的激活受到一类名为 c-FLIPs 的蛋白质的严格调控¹²。c-FLIP 蛋白存在三种异构体：c-FLIP_Long（c-FLIP_L）、c-FLIP_Short（c-FLIP_S）和 c-FLIP_Raji（c-FLIP_R）。这三种异构体的 N 末端区域均含有两个 DED 结构域。c-FLIP_L 还具有一个 C 末端的催化失活的类半胱天冬酶结构域^12,13。两种短型异构体 c-FLIP_S 和 c-FLIP_R 通过破坏 DISC 处的 DED 丝状结构形成，发挥抗凋亡作用^6,14,15。此外，c-FLIP_L 能够以浓度依赖的方式调控 caspase-8 的激活，从而产生促凋亡或抗凋亡效应^16,17,18。通过形成具有催化活性的 procaspase-8/c-FLIP_L 异源二聚体，c-FLIP_L 可促进 procaspase-8 活性中心的稳定及其激活。c-FLIP_L 的促凋亡或抗凋亡功能直接取决于其在 DED 丝状结构中的含量以及所形成的 procaspase-8/c-FLIP_L 异源二聚体的数量¹⁹。在 DISC 中，低或中等浓度的 c-FLIP_L 可在 DED 丝状结构上形成足够数量的 procaspase-8/c-FLIP_L 异源二聚体，从而促进 caspase-8 的激活；相反，c-FLIP_L 含量升高则直接导致其在 DISC 处发挥抗凋亡作用²⁰。

综上所述，前体caspase-8a/b在DISC上的活化和加工是一个涉及多个步骤的高度调控过程。本文讨论了直接在DISC上检测前体caspase-8加工的方法，以及对该复合物组成成分的分析。本文将以CD95 DISC作为死亡受体复合物的典型示例进行阐述。

方案

​T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。

1. 实验前细胞的准备

注意：本免疫沉淀实验的细胞平均数量为 1 × 10⁷_。 贴壁细胞需在实验前一天接种，以确保实验当天细胞数量达到 1 × 10⁷ 个 。

1. 准备实验用贴壁细胞
   1. 实验开始前一天，将每种条件下 5-8 × 10⁶ 个贴壁细胞接种于 20 mL 培养基（培养基成分见材料表）中，置于 14.5 cm 培养皿中。
   2. 实验当天，确保细胞贴壁良好且融合度达到 80-90%。弃去原培养基，为贴壁细胞更换新鲜培养基。
2. 准备实验用悬浮细胞
   1. 实验开始前立即在每种条件下，将 1 × 10⁷ 个悬浮细胞小心加入含 10 mL 培养基（培养基成分见材料表）的 14.5 cm 培养皿中。
   2. 若使用原代细胞，按照先前描述的方法²¹分离原代 T 细胞。用 1 µg/mL 植物血凝素处理原代 T 细胞 24 小时，随后用 25 U/mL IL2 处理 6 天。
   3. 实验开始前立即在每种条件下，将 1 × 10⁸ 个原代 T 细胞小心加入含 10 mL 培养基（培养基成分见材料表）的 14.5 cm 培养皿中。
      ​注意：建议使用较高数量的原代 T 细胞，因为这些细胞体积较小。

2. CD95L 刺激

1. 用CD95L刺激细胞（CD95L可按先前所述方法制备²⁰，或使用 commercially available 产品（参见材料表））。
   ​注意：CD95L的浓度和刺激时间取决于细胞类型^{13,15,22,23,24,25}。每种刺激条件需设置两个重复，以平行制备“磁珠对照”样本。
   1. 用选定浓度的CD95L刺激贴壁细胞。将培养板倾斜，用移液器将配体加入培养基中，避免接触贴壁细胞。
   2. 通过将配体溶液加入细胞悬液中，用CD95L刺激悬浮细胞。

3. 细胞收获与裂解

1. 将细胞培养皿置于冰上。
   注意：不要丢弃培养基。死亡的细胞会漂浮在培养基中，对后续分析至关重要。
2. 向细胞悬液中加入 10 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS），刮下贴壁细胞，并将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。
3. 用 10 mL 冷的 PBS 洗涤细胞培养皿两次，将洗涤液一并加入同一 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，用 1 mL 冷的 PBS 重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。
5. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 冷的 PBS 重悬细胞沉淀。
6. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 裂解缓冲液（含 4% 蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。冰上孵育 30 分钟。
7. 在 4 °C 条件下，以最大转速（约 17,000 × g）离心裂解液 15 分钟。
8. 将上清液（裂解液）转移至洁净离心管中，弃去沉淀。另取 50 µL 裂解液至新管中，通过 Bradford 法测定蛋白浓度，并取相当于 25 µg 蛋白的裂解液体积置于一离心管中。加入上样缓冲液（组成见材料表），作为裂解液对照，于 -20 °C 保存。

4. 免疫沉淀（IP）

1. 向裂解液中加入 2 µL anti-APO-1 抗体和 10 µL protein A sepharose beads（按制造商推荐方法制备）。另取一管含有裂解液的样品（刺激样品），仅加入 10 µL beads，作为“bead control”。
   注意：在操作 protein A sepharose beads 时，应使用宽口移液枪头，可通过剪切枪头末端或购买专用于免疫沉淀的特殊枪头实现。
2. 将裂解液与抗体/protein A sepharose beads 混合物在 4 °C 轻柔混匀条件下孵育过夜。在 4 °C、500 × g 条件下离心 4 分钟，分离裂解液中的抗体/protein A sepharose beads 复合物。弃去上清液，向沉淀中的 beads 加入 1 mL 冷 PBS，重复洗涤至少三次。
3. 弃去上清液。建议使用 50 µL Hamilton 注射器吸取 beads。

5. 蛋白质印迹

1. 向珠子中加入 20 µL 4x 上样缓冲液（缓冲液成分见材料表），在 95 °C 加热 10 分钟。将裂解液对照样品在 95 °C 加热 5 分钟。
2. 将裂解液、免疫沉淀样品（IP）以及蛋白标准品上样至 12.5% 十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶（凝胶制备方法见材料表），以 80 V 恒定电压电泳运行。
3. 将 SDS 凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。
   注意：此处采用针对目标蛋白优化的半干转印法，转印时间为 12 分钟（25 V；2.5 A，恒流）。在进行 Western 印迹前，将硝酸纤维素膜和两组小型转印夹心结构浸泡于电泳缓冲液中数分钟（缓冲液成分见材料表，按生产商说明书配制）。
4. 将转印后的膜放入盒中，用封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 PBST 缓冲液（即含 0.1% Tween-20 的 PBS））在室温下封闭 1 小时，并在轻微振荡条件下孵育。
5. 用 PBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 5 分钟。

6. 蛋白质印迹检测

1. 按照指定稀释比例（参见材料表）将第一种一抗加入膜中，并在 4 °C 条件下轻柔振荡孵育过夜。
2. 用 PBST 洗涤膜三次，每次洗涤 5 分钟。
3. 将膜与 20 mL 二抗（按 1:10,000 比例稀释于 PBST + 5% 脱脂奶粉中）在室温下轻柔振荡孵育 1 小时。
4. 用 PBST 洗涤膜三次，每次洗涤 5 分钟。
5. 弃去 PBST，向膜上加入约 1 mL 辣根过氧化物酶底物。
6. 检测化学发光信号（参见材料表）。
   注意：曝光时间和采集图像的数量取决于细胞中蛋白的含量以及所用抗体的特异性。需针对每种用于检测的抗体通过实验经验确定。

结果

为了分析caspase-8在DISC上的募集及其在CD95 DISC中的加工过程，本文描述了一种经典的工作流程，该流程结合了CD95 DISC的免疫沉淀（IP）与蛋白质印迹（western blot）分析。该方法可用于检测caspase-8在DISC处活化的多个关键特征：caspase-8活化大分子平台的组装、前体caspase-8（procaspase-8）向DISC的募集，以及这一起始caspase的加工过程（图1 和 图2）。该工作流程包括以时间依赖的方式用CD95配体（CD95L）处理敏感细胞，随后进行细胞裂解、使用抗CD95（抗APO-1）抗体进行免疫沉淀，以及后续的蛋白质印迹分析（图3）。

以宫颈癌HeLa-CD95细胞为例分析DISC的形成²⁶. 用CD95L刺激这些细胞导致高水平的CD95 DISC形成，对此进行监测 通过 ...

讨论

该方法最初由 Kischkel 等人描述²⁷，此后已由多个研究团队成功完善。为高效进行 DISC 免疫沉淀并监测该复合物中 caspase-8 的加工过程，需考虑若干关键问题。

首先，在免疫共沉淀过程中必须严格遵循所有洗涤步骤。其中，Sepharose珠的最后洗涤步骤以及珠子的干燥尤为关键。正确执行这些步骤可提高免疫共沉淀的信噪比，从而能够检测到caspase-8在DISC上的募集和加工过程。值得注意的是，对于质谱等高度敏感的分析技术，加入一个"预清除步骤"（即在仅含Sepharose珠或同型对照抗体的条件下孵育裂解液）也可能有助于降低背景噪声。然而，已有多个研究表明，该预清除步骤对于通过Western blot检测caspase-8向DISC的募集并非必需^7,23。但如前所述，免疫共沉淀结束时对珠子的充分洗涤对于获得可靠结果至关重要。细胞中高丰度蛋白与Sepharose珠的非特异性结合会显著削弱核心D...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12.5% SDS 凝胶	自制		用于两块分离胶： 3.28 mL 蒸馏水2O 2.5 mL Tris；pH 8.8；1.5 M 4.06 mL 丙烯酰胺 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED 用于两块收集胶： 3.1 mL 蒸馏水 H2O 1.25 mL Tris；pH 6.8；1.5 M 0.5 mL 丙烯酰胺 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm 细胞培养皿	Greiner	639160
丙烯酰胺	Carl Roth	A124.1
带高回收率滤芯和宽孔径的气溶胶滤芯吸头	VWR	46620-664（北美）或 732-0559（欧洲）	用于将珠子移液至裂解液
抗肌动蛋白抗体	Sigma Aldrich	A2103	稀释比例：PBST 中 1:4000，加 NaN 1:1003
抗APO-1抗体	由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 Enzo 购买	ALX-805-038-C100	仅用于免疫沉淀
抗-caspase-10 抗体	Biozol	MBL-M059-3	稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN 1:1003
抗-caspase-3 抗体	细胞信号转导	9662 S	稀释比例：PBST 中 1:2000，NaN 1:1003
抗-caspase-8 抗体 C15	由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买	ALX-804-242-C100	稀释比例：PBST 中 1:20，加 NaN 1:1003
抗CD95抗体	Santa Cruz	sc-715	稀释比例：PBST 中 1:2000，加 NaN 1:1003
抗-c-FLIP NF6 抗体	由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购买	ALX-804-961-0100	稀释：PBST 中 1:10 稀释 + NaN 1:1003
抗FADD 1C4抗体	由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购得	ADI-AAM-212-E	稀释：PBST 中 1:10 稀释 + NaN 1:1003
抗PARP抗体	细胞信号转导	9542	稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN 1:1003
APS	Carl Roth	9592.3
β-巯基乙醇	Carl Roth	4227.2
Bradford 溶液 蛋白测定染料试剂浓缩液 450ml	伯乐（Bio Rad）	500-0006	按照制造商说明书使用
CD95L	由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购得	ALX-522-020-C005
化学发光检测器 Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC）	Sigma Aldrich	11 836 145 001	按照制造商说明进行制备
不含 Ca、Mg 的 DPBS (10x)	PAN Biotech	P04-53500	稀释比例 1:10，使用 H2O，置于冰箱中保存
电泳缓冲液	自制		10×电泳缓冲液： 60.6 g Tris 288 g 甘氨酸 20 g SDS 加至 2 L H2O 使用前按1:10稀释
甘氨酸	Carl Roth	3908.3
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG1	SouthernBiotech	1070-05	PBST + 5% 脱脂牛奶中1:10,000稀释
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG2b	SouthernBiotech	1090-05	PBST + 5% 脱脂奶粉中1:10,000稀释
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	PBST + 5% 脱脂奶粉中1:10,000稀释
人白细胞介素-2（hIL-2）	默克集团 / 罗氏	11011456001	用于T细胞的活化
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
上样缓冲液 4x Laemmli 样品缓冲液，10 mL	伯乐（Bio Rad）	161-0747	按照制造商说明进行制备
Luminata Forte Western HRP 底物	Millipore	WBLUFO500
裂解缓冲液	自制		13.3 mL Tris-HCl；pH 7.4；1.5 M 27.5 mL NaCl；5 M 10 mL EDTA；2 mM 100 mL Triton X-100 加入 960 mL H2O
用于贴壁细胞的培养基 DMEM F12 (1:1) 含稳定型谷氨酰胺，  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	向培养基中添加10% FCS、1%青霉素-链霉素和0.0001%嘌呤霉素
原代T细胞培养基	gibco by Life Technologies	21875034	在培养基中加入10% FCS和1%青霉素-链霉素
脱脂奶粉	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	自制		20x PBST： 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 加至 2 L H2O 使用前按1:20稀释
PBST + 5% 脱脂牛奶	自制		50 g 脱脂奶粉 + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	用于T细胞的活化
Power Pac HC	伯乐（Bio Rad）
Precision Plus Protein 标准 全蓝	伯乐（Bio Rad）	161-0373	使用3-5之间 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	根据制造商说明制备的亲和树脂珠
刮勺	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
摇床	Heidolph
叠氮化钠	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo 小型转印叠层	伯乐（Bio Rad）	170-4270	按照制造商说明书使用
TransBlot Turbo 5x 转膜缓冲液	Bio Rad	10026938	按照制造商说明进行制备
TransBlot Turbo Mini型硝酸纤维素膜	Bio Rad	170-4270	按照制造商说明书使用
Trans-Blot-Turbo	伯乐（Bio Rad）
Tris	化学溶质	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	泛反应应用化学	A4974,1000