本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。
本文内容
摘要
摘要
为了实现靶向生物合成而对细胞代谢进行工程化改造时，往往需要经历大量设计-构建-测试-学习（DBTL）循环，因为工程师必须在满足细胞生存需求的前提下开展工作。相比之下，在无细胞环境中进行DBTL循环可加速这一过程，并避免宿主兼容性相关问题。一种颇具前景的无细胞代谢工程（CFME）方法利用具有代谢活性的粗提细胞裂解物作为生物制造平台，用于快速发现和原型化改造蛋白质及代谢通路。要实现这些功能并优化CFME性能，就需要具备表征基于裂解物的无细胞系统代谢组的方法。也就是说，必须借助分析工具来监测靶向代谢物转化效率的提升，并阐明在调控裂解物代谢时代谢物流量的变化。本文应用高效液相色谱（HPLC）结合光学检测或质谱检测技术，对大肠杆菌（E. coli）S30裂解物中的代谢物生成与流量进行了表征。具体而言，本报告描述了从CFME裂解物中制备HPLC分析样品的方法，采用示差折光检测（RID）定量中心代谢中间体及副产物的生成情况，这些产物由低成本底物（如葡萄糖）转化为多种高价值产物的过程中产生。此外，还介绍了通过反相液相色谱串联质谱（MS/MS）分析添加了13C标记葡萄糖的CFME反应中代谢物转化情况的方法，该技术是表征起始原料转化为特定代谢物的产率及裂解物代谢流量的有力工具。综合而言，将这些分析方法应用于CFME裂解物的代谢研究，有助于推动此类系统作为替代平台，用于更快速或新颖的代谢工程任务。
引言
通过重现生化反应可解决化学生产中微生物工程的局限性 体外 在不存在竞争性细胞存活功能的情况下1此外，开放的反应环境（即无细胞膜）相较于活细胞更易于操作和监测。无细胞代谢工程（CFME）的这一基础概念已得到精妙验证：通过重构代谢途径合成氢气和单萜等高价值化学品，其产量指标较迄今为止微生物细胞工厂所达到的水平高出数个数量级。1,2,3然而，目前纯化完整代谢通路的方法受限于时间和成本。相比之下，无细胞代谢系统可通过快速且低成本的方法从粗制细胞提取物中制备，相较于完整代谢通路的重建具有明显优势。4细胞提取物中保留的中心代谢途径可通过在缓冲溶液中添加能量底物（如葡萄糖和酶辅因子）以及盐类，持续生成中心代谢前体物质，持续时间超过24小时5,6向基于裂解物的CFME反应中添加外源酶，可实现葡萄糖向更高价值化学品的更复杂生物转化，并达到高滴度4,6,7尽管由于这些系统具有类似细胞的代谢复杂性，其产量往往受到影响，但已有并正在开发一些独特的方法，以优化裂解液蛋白质组，实现更高的产量转化。7,8.
基于裂解物的无细胞系统易于进行代谢转化，使其成为将化学制造完全移出细胞之外，或在构建与测试这些设计之前高通量地对新代谢途径进行原型验证的优良平台 体内2,9对于任一应用，监测代谢转化或观察裂解液中代谢流整体变化的工具，对于无细胞代谢工程（CFME）的发展都至关重要。高效液相色谱法（HPLC）可用于高分辨率分离CFME反应中的化学组分，并可与光学检测器或质谱检测器联用，以实现对代谢物的定量分析5,10高效液相色谱法的基本原理是，溶解在溶剂（即流动相）中的分析物在被泵入色谱柱时会与特定的柱填料（即固定相）发生相互作用。11根据其化学性质的不同，这些分析物在固定相上的保留时间各异，最终被流动相洗脱并携带至检测器。本报告详细描述了样品的制备与分析过程 E. coli 基于裂解液的无细胞蛋白表达反应，通过基于高效液相色谱并结合示差折光检测和串联质谱检测的方法进行分析。
高效液相色谱联用折射率检测（HPLC-RID）是一种普遍可及的方法，可用于快速鉴定中心代谢前体物和终产物。简而言之，RID通过测量分析物对流动相中光线偏转程度的改变来进行检测12。样品中目标分析物对应的RID信号可通过与标准溶液的RID信号进行比较而实现定量。在无细胞代谢工程（CFME）应用中，该检测模式最常与高效液相色谱柱联用，这些色谱柱基于尺寸排阻和配体交换机制的组合，或离子调节分配色谱法对化合物进行分离5,6,8,13。该特定技术可用于快速定量基于裂解物的CFME反应中糖类底物（如葡萄糖）的消耗，以及发酵产物（如琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇）的生成8。通过HPLC记录这些化合物浓度的变化，有助于阐明粗制细胞提取物汇集中心代谢前体物的潜力，并理解在裂解物中从葡萄糖进行复杂代谢转化过程中，代谢通量如何被重新导向发酵途径6,8,14。在大肠杆菌（E. coli）细胞提取物中的开创性CFME研究证实，发酵产物会作为葡萄糖分解代谢的终产物积累，同时也会在过量表达外源酶的裂解物中作为不希望产生的副产物出现6,15。有研究认为，发酵代谢在再生辅因子的氧化还原当量（即NAD(P)H和ATP）以维持糖酵解反应方面发挥着必要作用8。因此，基于HPLC并设计用于分离发酵产物的光学检测方法，在执行各种基于裂解物的CFME任务时是一种有用且广泛应用的工具。
CFME 可用于积累非碳水化合物、有机酸或醇类的代谢终产物4。检测那些合成后迅速被消耗的中间代谢物也可能具有重要意义10。 尽管高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）在成本和操作难度方面较为可行，但该方法仅能根据保留时间区分代谢物，存在局限性。当液相色谱与串联质谱检测（LC-MS/MS）联用时，可分析更广泛的代谢物种类16。在此方法中，流动相中的分析物被离子化，并依据各分子的质量和电荷特性进行差异化检测。因此，结合代谢物的质荷比（m/z）及其在色谱柱上的保留时间，可实现对大多数代谢中间体和终产物的高分辨率分离16。该检测技术还可与纳米液相色谱联用，后者具有更低的流速和样品进样体积，可在复杂的裂解液背景下更灵敏地检测小分子17。LC-MS/MS 还可结合同位素标记技术，因为掺入的同位素标签会改变分析物的 m/z 值18。因此，通过对添加了 13C6-葡萄糖底物的 CFME 反应进行时间点取样分析，可确定特异性来源于外源葡萄糖的终产物或副产物。尽管该同位素示踪方法目前在 CFME 研究中尚未广泛应用，但它是一种强大的工具，可用于理解基于细胞裂解液的 CFME 系统中的代谢转化过程，尤其重要的是，在这些反应中，盐类反离子（如乙酸根和谷氨酸根）也可作为次级底物被分解代谢19。利用该技术可全面描绘裂解液中葡萄糖代谢的图景，而目前这一过程尚未被完全阐明。本文所述方案详细介绍了纳米液相色谱与纳米电喷雾电离（nano ESI）串联质谱（MS/MS）联用的方法，可用于探究一种可能的葡萄糖代谢模型，特别是在 E. coli 裂解液中的代谢路径（图1）。该模型基于已有报道，即发酵途径和磷酸戊糖途径在来自富营养培养基培养菌株的 E. coli 裂解液中具有活性5,6,8,14。该技术还被用于研究氨基酸的生成，因为目前关于裂解液中由葡萄糖合成氨基酸的代谢知识仅限于少数例子，例如芳香族氨基酸的合成7。鉴于这些通路中的终产物和中间体大多具有极性（如有机酸、糖磷酸酯和氨基酸），本研究采用了反相液相色谱法。该技术通过极性化合物从非极性固定相中洗脱实现分离。随后，这些化合物在负离子模式下通过纳米电喷雾电离（nano ESI）离子化，该模式可检测至少带有一个基本负电荷的分析物，因此适用于酸性化合物的检测。本研究应用该技术分析来源于葡萄糖的 13C 掺入型代谢物，展示了 LC-MS/MS 在解析裂解液中葡萄糖代谢方面的应用价值。
方案
1. 启动、终止及处理时间进程CFME反应以进行HPLC-RID定量分析。
- 解冻先前制备的 E. coli 在冰上制备裂解液并准备其余反应组分。
注意：本文报告的裂解液来源于 E. coli BL21DE3-Star 菌株在含 1.8% 葡萄糖的 2xYPTG 培养基中培养至对数中期。- 制备适量经滤膜除菌的（0.20 µm 孔滤器）S30缓冲液（1 M Tris-OAc，用冰醋酸调节pH至8.2，1.4 M Mg(OAc)2，以及 6 M KOAc）。
- 在S30缓冲液中配制含有葡萄糖、谷氨酸盐、ATP、辅酶A、NAD+、Bis-Tris缓冲液和磷酸氢二钾的能量混合物。用于制备CFME反应的所需反应体积中的终浓度分别为：100 mM葡萄糖、18 mM谷氨酸镁、15 mM谷氨酸铵、195 mM谷氨酸钾、1 mM ATP、0.2 mM辅酶A、1 mM NAD++150 mM Bis-Tris 和 10 mM 磷酸氢二钾。
- 将组分加入1.5 mL微量离心管中，配制终浓度为4.5 mg/mL总裂解液蛋白的反应体系。此处，CFME反应的终体积为 50 µL 每个时间点设三个重复。将反应物在 37 °C 在各自的时间范围内。
注意：操作需迅速，并将裂解液作为反应混合物的最后组分加入，以防止葡萄糖和谷氨酸盐发生过早的代谢反应。反应混合物在冰上孵育的时间越长，越可能发生少量葡萄糖消耗。 - 终止反应，并将样品进行 HPLC-RID 分析处理。
- 为在适当的时间点终止三份平行反应，立即向每份样本的终反应体积中加入等体积的5%三氯乙酸（即 50 µL 5% 三氯乙酸 50 µL 反应）。用无菌水将每个样本稀释至反应体积的2倍（即 100 µL).
- 为重现零时点，加入与总终反应体积相等体积的5%三氯乙酸（即 50 µL在加入其余反应组分之前，先用裂解液进行酸化。该酸化步骤可在裂解液中的酶显著代谢葡萄糖之前将其沉淀去除。
- 涡旋混匀样品，并在台式微量离心机中以11,600 x g离心 g 5 分钟，将含有有机分析物的上清液转移至干净的离心管中。将样品储存在 -20 °C 若需在不同日期进行高效液相色谱分析，则应在进行下一步操作前将储存的样品置于冰上解冻。
- 用滤器过滤每份上清液 0.22 µm 孔径滤器。作为注射器的替代方案，可使用离心管滤器，并在16,300 x g条件下离心上清液 g 1 分钟。
- 将每份滤液转移至洁净的HPLC玻璃小瓶中。将小瓶装载到HPLC自动进样器样品盘上。
- 制备用于生成标准曲线的样品。
- 将所有目标分析物溶解于S30缓冲液中，配制成等摩尔浓度的储备液，其浓度需高于CFME反应中葡萄糖的起始浓度。此处，储备液包含 150 µM 葡萄糖、琥珀酸盐、乳酸盐、甲酸盐、乙酸盐和乙醇的混合溶液被制备。从原液进行1:1（v/v）的系列稀释，以获得三份平行样本。 50 µL 终浓度范围从 0 µM 至原液浓度（即， 150 µM).
- 用稀释每种溶液 50 µL 5% 三氯乙酸 100 µL 无菌水。重复步骤 1.3.4–1.3.5。
注意：每次检测样本时均需随行运行标准曲线溶液，以确保代谢物浓度定量的准确性。
2. 准备高效液相色谱系统以检测代谢物。
- 在通风橱下，使用去离子水和滤膜除菌水配制5 mM的硫酸溶液。向2 L水中加入约550 µL的98% HPLC级硫酸溶液，以制备5 mM硫酸溶液。
注意：硫酸为危险化学品，在通风橱内操作并穿戴适当的实验室个人防护装备（PPE），可防止吸入、皮肤接触和眼睛接触。浓硫酸与水反应剧烈，必须将酸直接加入水中，切勿反向操作。应将溶液储存于阴凉、干燥、避光处，并遵循实验室规定的废液处理措施。 - 将2 L的5 mM硫酸溶液瓶置于HPLC仪器旁的水浴中，将水浴温度设定为35 °C。在溶剂瓶中插入带溶剂过滤器的管路，并将另一端连接至与泵模块串联的脱气装置。
注意：在安装色谱柱前，使用新配制的流动相冲洗系统是良好的仪器操作规范。 - 将HPLC色谱柱与示差折光检测器（RID）模块串联后安装至HPLC仪器上。若无柱温箱，将色谱柱置于35 °C水浴中。
- 在系统计算机上安装的色谱数据系统（CDS）软件中，设置RID模块的分析温度为35 °C。
- 在 View 菜单中，选择 Method 并运行 Control View。右键点击 Pump Module > Method，将流速设为0.55 mL·min-1，然后点击 On 按钮启动泵。
注意：若色谱柱在安装前处于储存状态，应先按照制造商说明进行平衡，再逐步将流速升至0.55 mL·min-1。 - 右键点击对应 RID Module > Method 的面板，将示差折光检测器（RI detector）模块温度设为35 °C，并点击 On 以开始加热RI检测器模块。
- 右键点击 RID Module > Control 面板。当使用新鲜溶剂时，选择 Purge Reference Cell 并保持 On 至少15分钟；若此前RI检测器中流经了不同溶剂，则应持续1小时。点击 On 按钮。
注意：保持泵和RI检测器处于 On 状态，以使在线图谱基线趋于稳定。基线稳定性受实验室温度波动影响，可能需要4小时或更长时间。在上样前，建议将系统保持 On 状态过夜。
- 在 View 菜单中，选择 Method 并运行 Control View。右键点击 Pump Module > Method，将流速设为0.55 mL·min-1，然后点击 On 按钮启动泵。
3. 在CDS中建立有机发酵产物的等度HPLC分离方法。
- 从菜单栏中选择 方法 > 新建方法。选择方法 > 另存方法为[MethodName].M。选择 方法 > 编辑完整方法 > 仪器/采集
- 在 二元泵 选项卡中，将流速设置为 0.55 mL·min-1。在 溶剂 下，选择对应于泵模块上溶剂输入的字母，并将其设置为 100%，以进行等度洗脱。将 压力限制 设置为 0 和 400 bar，并将 停止时间 输入为 30 min。
- 在 进样器 选项卡中，将进样体积设置为 50 µL。在 停止时间 下选择 随泵/无限制 选项。将 高级辅助设置 中的 吸取速度、排出速度 和 吸取位置 分别设置为 200 µL·min-1、200 µL·min-1 和 -0.5 mm。
- 在 RID 选项卡中，将 光学单元温度 设置为 35 °C。在 信号 下，为 信号 选择 采集，为 峰宽 选择 >0.2 min。为 停止时间 选择 随泵/进样器 选项。
- 在 RID 选项卡的 高级 设置中，将 模拟输出 设置为 5% 零点偏移，衰减 设置为 500,000 nRIU。为 信号极性 选择 正极性，为 分析前自动调零 选择 开启 选项。
- 通过选择 方法 > 保存方法 来保存方法。通过选择 方法 > 加载方法 > [MethodName].M 来加载方法。
4. 创建自动进样序列表格并启动HPLC-RID系统进行数据采集。
- 从菜单栏中选择 Sequence > New Sequence Template。然后选择 Sequence > Save Sequence Template as [SequenceTemplateName].S。
- 选择 Sequence > Sequence Table。根据自动进样器样品盘上的排列，在表中添加与样品瓶数量“n”相对应的“n”行，并在 Vial 和 Sample Name 列下分别输入样品瓶位置和样品名称。从“Method Name”下拉菜单中选择步骤3中生成的方法，并为每一行输入 50 µL 作为 Inj/Vial（每瓶进样量）。
- 点击 Apply，然后通过选择 Sequence Template > Save Sequence Template 保存序列模板。通过选择 Sequence > Load Sequence Template > [SequenceTemplateName].S，确保已加载该序列模板。
- 当在线图谱基线稳定后，右键单击面板 RID Module > Control > Off Recycling Valve，将溶剂流路导向RID检测器并排至废液。要开始数据采集，请从菜单栏选择 Sequence，然后选择 Sequence > Run。
5. 运行后提取和分析数据。
- 选择 数据分析 视角 查看 菜单。从序列文件名中查找 文件列表 屏幕左侧。在屏幕的中央面板上，前往 信号视图选择 > RID 信号 查看样品色谱图。
- 从屏幕上方面板中选择对应高浓度标准样品的一行。注意观察显示色谱图上目标分析物峰的保留时间。对应目标分析物的峰沿保留时间轴依次为葡萄糖、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇（补充图1).
注意：色谱图上的第一个大峰对应三氯乙酸。其RI单位应在所有标准曲线样品中保持一致。通过将每种化合物作为单独样品进样，验证各目标分析物的保留时间。 - 从标准品和反应样品的色谱图中提取每种目标分析物的峰面积。
- 判断软件是否对目标峰进行了良好积分。绘制红线作为每个峰的基线，以获得曲线下准确的积分面积。如果自动积分失败（即红线偏斜），请选择 手动整合 按钮从 整合工具集 并手动绘制峰基线以积分峰面积。
注意：如果某个样本中的目标分析物需要手动积分，则需保持一致，对所有样本中的同一分析物均进行手动积分。 - 选择 光标 工具来自 常用工具集 点击正确整合的峰。所选峰的峰面积及相应的保留时间将以表格行的形式显示在屏幕底部面板。
- 要导出峰面积，请选择 文件 > 导出 > 整合结果.
- 判断软件是否对目标峰进行了良好积分。绘制红线作为每个峰的基线，以获得曲线下准确的积分面积。如果自动积分失败（即红线偏斜），请选择 手动整合 按钮从 整合工具集 并手动绘制峰基线以积分峰面积。
- 使用标准曲线定量目标分析物的浓度。
- 将样品的峰面积值与已知浓度在电子表格中绘制成图。右键单击绘图中的数据点， 添加趋势线 > 格式化趋势线 > 在图表上显示方程.
- 在另一个电子表格中，使用标准曲线趋势线的方程将每个样品中各分析物的峰面积值转换为浓度。计算三个重复样本的平均峰面积及标准误，用于数据可视化。
6. 启动、终止及处理时间过程同位素示踪CFME反应以进行LC-MS/MS定量分析。
- 按照1.1-1.2所述，在冰上为每个时间点（除零时点外）设置三份重复反应。然而，反应中不使用葡萄糖，而是使用终浓度为100 mM的13C6-葡萄糖。将反应体系在37 °C下分别孵育1 h、2 h和3 h。
- 为终止反应，将反应液在液氮中快速冷冻，并于-80 °C保存。若为当天分析，则可跳过此保存步骤。
注意：未使用三氯乙酸终止反应，因其在通过LC-MS/MS检测某些中心碳代谢物时会产生干扰。取而代之的是使用含甲酸的提取溶剂（步骤6.3）来沉淀代谢相关蛋白，因为甲酸的分子量低于所报道的MS/MS方法的检测限。 - 配制50 mL提取溶剂。在50 mL离心管中混合20 mL乙腈、20 mL甲醇和10 mL水（均为LC-MS级），再加入0.199 mL甲酸，涡旋混匀，制成0.1 M的溶液。提取过程中将溶剂预冷至4 °C，不使用时储存于-20 °C。
- 用于LC-MS/MS分析的样品处理
- 在分析当天，向每个样品中加入等体积的提取溶剂（即50 µL）。若样品为冷冻状态，应在样品完全解冻前加入提取溶剂，以防止葡萄糖代谢重新激活。所有样品处理步骤均在冰上进行。
- 为重现零时点状态，向适量裂解液中加入终体积的提取溶剂（即50 µL），使其在反应体系中达到目标终浓度（例如在50 µL反应体积中为4.5 mg/mL）。然后按照1.2步骤加入其余反应组分。此酸化步骤可在裂解液中的酶显著代谢葡萄糖之前将其沉淀。
- 将样品在冰上用提取溶剂孵育30 min，并轻轻振荡，随后在4 °C下以21,000 x g离心15 min，以分离上清液与沉淀的蛋白质。将50 µL上清液转移至自动进样瓶中，并将进样瓶置于4 °C自动进样器的样品盘上。剩余上清液储存于-20 °C，以备后续分析使用。
7. 为 LC-MS/MS 分析设置液相色谱系统。
- 通过将77.08 mg乙酸铵完全溶解于950 mL水和50 mL异丙醇中，配制1 L溶剂A。用650 mL乙腈、300 mL水和50 mL异丙醇，同时加入77.08 mg乙酸铵，配制1 L溶剂B。确保所有溶剂均为LC-MS级。
- 将装有溶剂A和溶剂B的溶剂瓶连接至泵模块。以高流速冲洗系统，以去除或减少在将溶剂连接至液相色谱系统过程中可能引入的空气污染。
- 使用C18反相色谱柱（柱长30 cm，内径75 µm，颗粒直径5 µm）装配系统。通过以100%溶剂B流动，并缓慢将溶剂A梯度升至100%，对色谱柱进行平衡。
注意：色谱柱柱尖由微移液器拉制仪自制，并通过压力细胞和氦气填充。
8. 在与傅里叶变换和离子阱质谱仪联用的液相色谱系统所配套的液相色谱-串联质谱数据采集与解析软件中建立分析方法。
- 打开 Tune Plus 软件以编辑质谱方法的调谐文件。
- 从 文件 在菜单栏中，打开预安装的负离子模式调谐文件。
- 选择 扫描模式 在菜单栏中，然后选择 定义扫描窗口将离子阱和傅里叶变换的MSn微扫描时间设置为1。
- 转至纳米电喷雾电离源设置并设定 喷雾电压 至4 kV。调节电压直至产生可接受的电喷雾；通常，可接受的电喷雾可在2–5 kV范围内实现。
- 保存调谐文件。
- 使用以下方法生成一种新的液相色谱方法 安装向导 仪器的数据采集与分析软件。打开 路线图 > 序列设置 > 向导由于这些方法不需要使用柱温箱，因此跳过温度控制步骤。
- 下 流体梯度泵选项，选择 多步骤. 在下一个窗口中，插入 7 行，并将每行的流速设置为 0.1 mL·min⁻¹-1输入以下各时间段的参数：0–3 分钟，输送 100% 溶剂 A；3–9 分钟，从 100% 溶剂 A 线性梯度洗脱至 20% 溶剂 B；9–19 分钟，引入新的梯度，从 20% 溶剂 B 线性升至 100% 溶剂 B；19–27 分钟，保持 100% 溶剂 B；27–28 分钟，将梯度重新设置为 100% 溶剂 A；28–44 分钟，通过保持 100% 溶剂 A 对色谱柱进行冲洗和再平衡，以备后续运行。最后增加一步，将流速降低至 0.03 mL·min⁻¹。-1 运行结束后，当液相色谱仪不使用时，应保存溶剂。
- 应用默认设置 采样器选项 > 泵压 作为 采集选项 并使用 默认采集时间 并使用 默认泵压 选项
- 在仪器设置窗口的侧边栏中选择 Orbitrap Velos Pro MS 图标，创建一种 MS/MS 方法。
- 点击 新方法 > 数据依赖型串联质谱设置 采集时间 色谱运行时间（即 44 分钟） 片段 至 1，以及 扫描事件 至第11步。对于调谐文件，选择步骤8.1中编辑的文件。
注意：第一个事件是使用傅里叶变换质谱（FTMS）进行的MS1前体离子扫描。随后的10个事件将进行MS2扫描，针对每次前体离子扫描中信号最强且独特的10个离子进行MS2碎裂分析。 - 对于事件1，在...条件下 扫描描述 设置 分析仪 至 傅里叶变换质谱法 和 极性 至 阴性. 在 MSn 设置下，使用一个 分辨率 30,000 和一个 归一化碰撞能量 35 V 的 扫描范围 至 50 m/z 为第一质量，1800 m/z 为最后质量，以捕获小分子。
- 对于第2至第11个事件，在...条件下 扫描描述 设置 分析仪 到 离子阱选择 依赖扫描 并点击 设置 > 全球 > 动态排除 并选择 启用；设置30秒的重复扫描间隔时间和120秒的排除持续时间，以消除邻近区域的重复扫描。
- 前往 扫描事件 设置并设定 由扫描事件确定的质量 至所有MS2事件（2到11）的1。为扫描强度最高的10个离子，将每个MS2扫描事件设置为检测nth 来自1的最强离子st 至 10th因此，设置 事件 2 检测1作为nth 最强离子，事件3检测2，依此类推。
- 关闭设置窗口并前往 文件 > 另存为 [方法名称].meth
注意：有关液相色谱仪和质谱仪的一般使用、维护和校准，请参考制造商提供的操作说明和手册。
- 点击 新方法 > 数据依赖型串联质谱设置 采集时间 色谱运行时间（即 44 分钟） 片段 至 1，以及 扫描事件 至第11步。对于调谐文件，选择步骤8.1中编辑的文件。
9. 设置运行序列并启动液相色谱-串联质谱运行。
- 使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统的数据采集与分析软件设置运行序列。在导航路径 > 序列设置中，右键单击表格以插入与样品数量相同的行数。对每一行，将进样体积 设为 5 µL，将位置 设为自动进样器托盘上对应样品瓶的位置。以文件名作为样品名称，并设置运行结果的保存路径。
注意：可在序列开始时以及每组三复孔样品（每组时间点）之间运行装有溶剂 A 的空白样品瓶，以冲洗色谱柱。 - 要开始运行，先在序列中高亮所有文件名，然后从菜单栏选择操作 > 运行序列 > 确定。
10. 在 MZmine 2.53 中整合文件并搜索初步注释。
- 打开 MZmine 软件，并导入步骤 9.1 中生成的 '.raw' 输出文件。在菜单栏中选择 原始数据方法 > 导入原始数据，然后选择与样品对应的文件。
- 构建区分 MS1 和 MS2 扫描的峰列表。在菜单栏中选择 原始数据方法 > 特征检测 > MS/MS 峰列表构建器。相关设置包括将 m/z 窗口 设为 0.01，时间窗口 设为运行时长。在滤波器设置中，选择 负极性 作为 极性，并选择 质心化 作为 谱图类型。
- 在菜单栏中选择 特征列表方法 > 特征检测 > 峰扩展器。将 m/z 容差 设置为 0.005 m/z 或 10 ppm，最小高度 设置为 1E3。此步骤将生成完整定义的峰。
- 去除重复峰。返回菜单栏中的 特征列表方法 > 滤波 > 重复峰滤波器。相关设置包括将 m/z 容差 设为 0.005 m/z 或 10 ppm，保留时间容差 设为 5 分钟。
- 为在相似数据文件（即三重复反应的数据）之间对齐峰，请返回 特征列表方法 > 标准化 > 保留时间校准。务必同时处理三重复样品，并排除空白样品。相关设置包括将 m/z 容差 设为 0.005 m/z 或 10 ppm，保留时间容差 设为绝对值 3 分钟，最小标准强度 设为 1E3。
- 通过 特征列表方法 > 对齐 > RANSAC 对齐器，根据 m/z 和保留时间对所有文件中的峰进行对齐。设置 m/z 容差 为 0.005 m/z 或 10 ppm，保留时间容差 和 校正后保留时间容差 分别为 44 和 39 分钟，RANSAC 迭代次数 为 0，最小点数 为 10%，阈值 为 1。勾选 要求相同电荷态 选项。
- 在 特征列表方法 > 空缺填补 > 峰查找器 中，对先前步骤中可能丢失的数据点进行校正。相关设置包括将 强度容差 设为 50%，m/z 容差 设为 0.005 m/z 或 10 ppm，保留时间容差 设为 3 分钟。启用保留时间校正功能。
11. 计算13C标记的葡萄糖衍生代谢物的负离子模式质量，并在过滤后的数据中搜索这些分析物的质荷比特征。
- 计算以下物质的质量 13来自葡萄糖代谢的C标记代谢物用于靶向搜索。
- 根据化合物分子式中各元素的原子数量及其单同位素质量，计算每种目标化合物的单同位素质量20.
- 通过从单一同位素质量中减去1个质子的质量（1.007276 Da）来计算该化合物在负离子模式下的质荷比[M-H]⁻。此质量即为分子在电离过程中失去一个氢离子后，由负离子模式质谱检测所测得的质量。
- 从负离子模式质荷比计算分子质量 13C-结合的代谢物。此处，完全结合葡萄糖来源的同位素异构体的质量 13C-标签已计算。
- 使用计算出的质量 13使用C标记的代谢物来搜索并注释MZmine结果中的m/z特征。针对每个可能的匹配项，使用以下公式计算质量误差（ppm）：
注意：实验测得的 m/z 值 <15 ppm 的质量误差在本次分析中被视为可能的注释。 - 在质量浏览器中手动检查假定注释的谱图以确认注释。
- 开放 路线图 > Qual Browser从工具栏中打开 原始文件 导入每个样本的原始质谱数据。
- 在总离子色谱图（上图）中，在目标保留时间范围（即对应于假定注释）下方划线，以查看质谱图（下图）。右键点击质谱图，输入包含目标分析物 m/z 值的质量范围。检查假定注释是否具有明显高于噪声水平的特征峰信号补充图2).
- 计算每个时间点生物学重复中阳性注释的平均峰面积及其标准误。将数据可视化（例如，以柱状图呈现），以观察葡萄糖代谢的变化趋势。
结果
为了定量分析葡萄糖为底物时基于裂解液的无细胞合成常见发酵产物的情况，向来源于在2xYPTG培养基中培养的菌株所制备的裂解液中添加底物 100 µM 葡萄糖作为主要碳源8通过蛋白质酸化在24小时时间过程中终止反应。将含有葡萄糖分解产生的丙酮酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇的过滤上清液注入配备示差折光检测器（RID）模块的高效液相色谱（HPLC）系统的自动进样模块。含有发酵终产物与葡萄糖混合物滤液的样品瓶置于 1.17 µM, 2.34 µM, 4.69 µM, 9.38 µM, 18.75 µM, 37.50 µM, 75 µM，以及 150 µM S30缓冲液中的浓度作为标准品上样至仪器。分析物通过等度洗脱从HPLC柱洗脱至示差折光检测器（RID）。葡萄糖、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇的峰在1至 150 µM 可通过RID分辨该范围。葡萄糖的峰面积通过手动积分从RID的时间过程和标准曲线样品数据中获得。琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇的提取峰面积则取自自动积分信号。所有标准曲线（峰面积对已知浓度）的R2 数值 >0.99，在本研究所用浓度范围内呈线性。
所有目标分析物的摩尔浓度均根据各自的标准曲线计算得出。葡萄糖在反应开始后的前3小时内被消耗，主要发酵生成乳酸（图2A、B）。乙醇的积累也主要发生在反应的前3小时内，之后即停止（图2C）。在反应3小时后观察到显著的乳酸和乙醇生成以及显著的葡萄糖消耗并非意料之外，因为乳酸和乙醇的生成途径可通过糖酵解过程中产生的NADH再生1摩尔净量的NAD+，从而支持葡萄糖通过糖酵解途径持续消耗（图1）。因此，乳酸和乙醇可被视为基于裂解液的无细胞葡萄糖代谢中的主要发酵终产物。乙酸最初作为S30缓冲液的组分存在于反应体系中，出乎意料的是，其积累仅在6小时后葡萄糖消耗减缓时才发生（图2D）。该结果表明，乙酸发酵并不一定在早期时间点支持快速的糖酵解通量。与此同时，甲酸和琥珀酸作为次要发酵产物被合成（图2E、F）。综上所述，该方法实现了对大肠杆菌（E. coli ）S30裂解液中糖类底物消耗及发酵产物生成的绝对定量。
采用质谱检测以特异性分析裂解液中的葡萄糖代谢情况。来源于在2xYPTG培养基中培养的菌株的裂解液被供给 13C6-葡萄糖作为碳源。CFME反应分别在0 h、1 h、2 h和3 h时间点进行三重复实验。每个时间点的样品均加载至配备反相色谱柱并联接傅里叶变换和离子阱质谱仪的液相色谱系统。采集负离子模式质谱图，并进行处理以分析有机酸、糖磷酸酯和氨基酸。计算理论质量数 13属于中心碳代谢的C标记物被用于鉴定特异性来源于葡萄糖的化合物。根据所用菌株的培养条件以及既往关于活性代谢通路的报道 E. coli CFME 中，此处假设裂解物蛋白质组包含一个代谢网络，可将葡萄糖导入糖酵解发酵、磷酸戊糖途径，以及可能的氨基酸合成代谢5,6,7,8,14 (图1). 因此，搜索范围缩小至这些通路中的成员，其中16种代谢物含有葡萄糖衍生的 13C标签被明确注释（补充表 1).
13C6-葡萄糖通过糖酵解被明显消耗，这由糖酵解中间产物丰度的波动所证实（图3A-E). 与HPLC-RID数据一致，葡萄糖积累至 13C3-乳酸，并且也被发酵为 13C3-反应开始的前3小时内琥珀酸盐图4A，B）。形成的 13C3-琥珀酸同位素异构体支持所提出的裂解液葡萄糖代谢模型（图1），其中琥珀酸可能由3碳的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）分子羧化生成，而非由2碳的乙酰辅酶A分子进入三羧酸循环产生。既往的CFME研究中均假设三羧酸循环被激活，但其他 13三羧酸循环的C标记中间产物在此未被检测到8,19,21. 13C3-天冬氨酸的合成在最初1小时内即已发生并被消耗，进一步支持了磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）被直接转化为草酰乙酸的观点图1, 图6C）。数据反映的是在富含葡萄糖的培养基（2xYPTG）上进行发酵生长时收获的菌株裂解物蛋白质组的情况。这进一步表明，不参与琥珀酸生成的其余三羧酸（TCA）循环酶构成了一个氧化型TCA分支（图1然而，该途径中的任何代谢物均未被检测到，可能是因为作为盐反离子添加到CFME反应中的高浓度谷氨酸阻碍了该分支的进行。
HPLC-RID 数据进一步得到证实，在 3 小时反应时间内未检测到 13C2-乙酸盐，表明在 3 小时内葡萄糖尚未产生乙酸盐的积累（图 2B）。然而，乙酸盐的直接前体乙酰磷酸（acetyl-P）发生了积累，提示从乙酰辅酶A合成乙酸盐的 Pta-AckA 通路中的 Pta 分支具有活性（图 4C、D）。由 AckA 催化的 13C2-乙酰磷酸转化为 13C2-乙酸盐的去磷酸化反应在此时间范围内可能并未发生，原因是乙酸盐是反应中所用 S30 缓冲液的主要成分之一（图 1、图 2B）。
还观察到13C6-葡萄糖来源的碳原子掺入糖磷酸化合物6-磷酸葡萄糖酸内酯（6PGL）、6-磷酸葡萄糖酸（6PG）、核酮糖-5-磷酸（Ru5P）和景天庚酮糖-7-磷酸（S7P）中（图5）。这些结果证实了磷酸戊糖途径参与了裂解液中的葡萄糖代谢，并可能为13C9-酪氨酸的合成提供碳源——此前已有蛋白质组学研究提出过这一推测，同时也为13C5-组氨酸的生成提供了前体物质（图6A、B）7。本实验中未检测到标记的苯丙氨酸和色氨酸，大多数必需氨基酸也未被检测到。然而，这并不完全令人意外，因为氨基酸的生物合成更可能在营养匮乏条件或静止期细胞所制备的裂解液中富集7,22。此外，目前的数据表明，糖酵解和发酵的中间产物主要被导向辅因子再生相关的终末反应，这必然限制了来源于甘油醛-3-磷酸、丙酮酸和乙酰辅酶A的多种氨基酸（如甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸）的合成（图1）。如前所述，13C3-天冬氨酸在反应开始后一小时内即生成，而由天冬氨酸衍生的含13C标记的氨基酸（即苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺）未被观察到，可能是因为葡萄糖来源的天冬氨酸参与了发酵过程（图1，图6C）。最后，反应环境中高水平的谷氨酸可能阻碍了向标记的谷氨酸及其衍生氨基酸的代谢通量（图1）。
图1：来源于在高葡萄糖浓度下指数生长的 E. coli BL21DE3-Star 的无细胞裂解液的假设代谢模型。 在基于裂解液的无细胞代谢工程（CFME）中已检测到糖酵解（绿色）、磷酸戊糖途径（深橙色）以及由乙酰辅酶A出发的发酵途径（蓝色）的中间产物和终产物。琥珀酸发酵的存在表明氧化型三羧酸循环分支（灰色）被激活。裂解液中的氨基酸合成代谢（金色）尚不明确，本文对此进行了研究。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：使用大肠杆菌（E. coli）粗提物制备的无细胞代谢工程（CFME）反应中葡萄糖消耗及发酵终产物合成的高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）数据。 （A）葡萄糖消耗量，以及在 CFME 反应中监测的（B）乳酸、（C）乙醇、（D）乙酸、（E）甲酸和（F）琥珀酸的生成量，监测时间为 24 小时。结果显示了通过标准曲线定量得到的平均毫摩尔浓度及误差棒（标准误，SE）（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：时间过程趋势 13C6-葡萄糖和 13C标记的糖酵解中间产物在 E. coli 裂解液 CFME 相对丰度A) 13C6-葡萄糖，(B) 13C6-葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸，(C) 13C6-果糖-1,6-二磷酸，(D) 13C3-3-磷酸甘油醛/二羟基丙酮磷酸，以及（E) 13C6-pyruvate 在 CFME 反应中 3 小时内的变化。使用 mzMINE 软件提取的原始峰面积用于计算正向注释的平均值和误差线（标准误，n = 3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：中间产物和终产物的时间进程趋势 13C6-葡萄糖发酵在 E. coli 裂解液 CFME 相对丰度A) 13C3-乳酸，(B) 13C3-琥珀酸盐，(C) 13C2-乙酰磷酸盐，以及（D) 13C2在3小时内CFME反应中乙酰-CoA的原始峰面积由mzMINE软件提取，并用于计算正向注释的平均值和误差棒（标准误，n = 3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：时间过程趋势 13C6-葡萄糖衍生的磷酸戊糖途径中间产物在 E. coli 裂解物 CFME 相对丰度A) 13C6-6-磷酸葡萄糖酸内酯，(B) 13C6-6-磷酸葡萄糖酸, (C) 13C5-核酮糖-5-磷酸，以及（D) 13C7-7-磷酸景天庚酮糖在3小时内。使用mzMINE软件提取的原始峰面积用于计算正向注释的平均值和误差线（标准误，n = 3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6检测到的时间过程趋势 13C6-葡萄糖衍生的氨基酸在 E. coli 裂解物 CFME 相对丰度A) 13C9-酪氨酸，(B) 13C5-组氨酸，以及（C) 13C3-天冬氨酸持续3小时。使用mzMINE软件提取的原始峰面积用于计算阳性注释的平均值和误差线（标准误，n = 3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充图1：代表性高效液相色谱-示差折光（HPLC-RID）色谱图，显示在37 °C下孵育24小时的CFME反应中主要发酵产物的峰。在等度洗脱条件下，使用5 mM硫酸溶液作为流动相，通过HPLC色谱柱可根据保留时间清晰区分葡萄糖、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇的峰。请点击此处下载该文件。
补充图2：13C标记代谢物的代表性质谱图，分别为在CFME反应中于指定条件下孵育的（A）乳酸、（B）葡萄糖和（C）6-磷酸葡萄糖酸（6PG） 37 °C 1小时。 请点击此处下载此文件。
补充表 1：检测到的 13C标记代谢物列表，保留时间（使用MZmine在样品间对齐），理论上的完全13C标记负离子模式m/z值，检测到的特征m/z值，以及计算得到的质量误差。请点击此处下载该表格。
讨论
所述的高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）方法可用于随时间成功定量裂解液中心代谢过程中糖底物的消耗及其向主要有机酸和醇类产物的转化。此外，该方案采用简单的等度洗脱方法，仅使用单一流动相，样品前处理步骤极少，并可实现简便的靶向下游分析。HPLC-RID方法所检测的分析物仅通过其在选定色谱柱填料上的保留时间进行区分，因而依赖于其与填料的相互作用。此处使用的HPLC色谱柱专为分离碳水化合物、有机酸和醇类而设计，其原理结合了体积排阻和配体交换（即离子调节分配色谱）。因此，该方法适用于对碳水化合物底物及葡萄糖发酵途径中特定终产物进行更精准的分析，这些产物预期可主要促进并为基于裂解液的生物转化过程提供能量8,15,21。然而，本方案未涵盖细胞提取物中其他代谢途径的激活情况。可采用其他色谱分离技术（如亲水相互作用色谱）、梯度洗脱方法、更复杂的样品前处理（如衍生化）以及不同的光学检测器（例如紫外光或蒸发光散射检测器）的分析流程来检测其他代谢物，如氨基酸和糖磷酸酯23,24。 Alternatively, a global approach to studying lysate metabolism can be taken using LC-MS/MS。
所述的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法是一种用于测量和鉴定更广泛代谢物的单一工作流程。由于其高灵敏度以及能够通过保留时间和高分辨率的质荷比（m/z）比值来区分代谢物，LC-MS/MS已成为代谢组学分析的先进工具16。本研究聚焦于中心碳代谢通路和氨基酸合成代谢，采用负离子模式的MS/MS专门检测极性有机酸、磷酸糖和氨基酸。结合纳米液相色谱技术，该方法可在复杂的裂解液背景下实现对小分子的高灵敏度检测17。然而，在基于裂解液的无细胞代谢工程（CFME）代谢谱分析方面，该LC-MS/MS方案的一个局限性是其较低的检测下限为50 m/z，这导致无法检测乙醇——裂解液中葡萄糖代谢的主要产物之一，以及甲酸盐，而这些物质均可通过详细的高效液相色谱-示差折光检测（HPLC-RID）方法轻松定量。与LC-MS/MS相比，HPLC-RID在成本和操作难度方面还具有更高的可及性优势。就后者而言，本文所述LC-MS/MS方法的故障排查可能需要具备一定程度的质谱技术专业知识。尽管如此，相较于示差折光检测（RID），质谱检测具有独特的优势，因为它还能进一步区分代谢物中标记的同位素，是研究补充底物中的碳原子如何在复杂的裂解液代谢网络中转移的极佳技术18。本研究通过向反应体系中添加13C6-葡萄糖，并分析下游掺入13C的代谢物的相对丰度，应用了这一方法。该分析有助于界定活跃与非活跃的代谢通路，既支持了先前报道的假设，也提供了关于裂解液中代谢流分布的新见解。该方法还可根据特定分析需求进行调整。例如，可通过将13C标记的目标化合物标准品与样品一同分析，实现对葡萄糖来源分子的绝对定量，并随时间推移得出代谢通量分布的结论。此外，通过使用针对正离子模式检测优化的.meth文件运行序列，当前工作流程也可增强对带正电荷化合物的检测能力。
上述两种方法中的分析取样均可方便地实现自动化，从而确保高度的可重复性。此外，只要遵循正确的仪器操作规范并进行适当的维护，即可预期获得平稳的分析运行。在使用这些工具分析CFME反应时，取样前后环节更需审慎考虑 。在样品制备过程中，必须确保时间进程对照组能够真实代表零时点（time-zero）状态。本研究中，通过酸化裂解液使蛋白质沉淀，以终止代谢反应。对于零时点样品，先将酸性溶剂与裂解液混合，再加入含葡萄糖的反应体系。三氯乙酸酸化可有效确保在零时点葡萄糖不被代谢，HPLC-RID数据结果已证实这一点（图2）。尽管在已报道的LC-MS/MS分析中也采用了类似的淬灭葡萄糖代谢的步骤，但在零时点样品中仍检测到13C标记的代谢物，尽管其丰度显著低于后续时间点样品。此外，这些现象仅限于糖酵解中间产物。数据表明，使用这种高灵敏度方法检测时，反应体系在加入提取溶剂酸化后仍保留一定程度的糖酵解活性。然而，该活性的程度应予以量化。先前有研究报道，酸性提取溶剂可能不足以完全终止糖酵解中间反应，但可有效阻止葡萄糖的大量消耗10。尽管这一点在本研究所用体系中仍有待进一步验证，但零时点与后续时间点样品之间相对丰度的显著变化仍可被解释为葡萄糖代谢的趋势。然而，在类似应用中建议探索其他替代性淬灭方法，特别是为准确测定代谢中间产物的绝对含量时10。此外，在下游软件分析过程中也应遵循良好操作规范。在人工积分RID信号峰面积时，保持一致性至关重要，以减少人为误差。只要采用人工积分峰面积来定量样品中代谢物浓度，也应同样对标准品的峰面积进行人工积分。在整个靶向LC-MS/MS分析过程中，MZmine分析所得的初步注释应通过MS质量浏览器进行手动峰形核查予以验证，且仅在计算质量误差可接受的情况下才对m/z特征进行注释。本研究中，由于目前尚无成熟且可靠的同位素搜索软件，相关分析仅针对有限数量的目标化合物手动完成。然而，针对13C标记代谢物的自动化搜索方法正在逐步发展，未来有望简化更复杂的分析流程，例如对裂解液进行中心碳代谢以外的代谢谱分析25。
高级液相色谱法是一种稳健且广泛应用的方法，用于分离复杂代谢混合物中的小分子11。本文所述方法将该分离技术与折光指数检测或质谱检测相结合，成功实现了基于裂解液的无细胞代谢工程（CFME）反应中代谢物转化的分析。高效液相色谱-折光检测（HPLC-RID）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）均为分析活性裂解液代谢的有力工具，二者具有互补性，可进一步用于克服各自技术的固有局限性。所报道的方法有助于无细胞代谢工程（CFME）的应用与发展，可用于理解裂解液中的代谢过程、监测目标代谢物转化效率的提升，以及阐明调控裂解液代谢时代谢物流通量的变化。
披露
作者声明不存在已知的 competing financial interests 或其他利益冲突。
致谢
本研究由美国能源部科学办公室生物与环境研究项目下的基因组科学计划资助，属于植物-微生物互作科学重点研究领域（http://pmi.ornl.gov）。橡树岭国家实验室由UT-Battelle有限责任公司根据DE-AC05-00OR22725号合同为美国能源部管理。本稿件由UT-Battelle有限责任公司根据与美国能源部签订的合同DE-AC05-00OR22725撰写。美国政府保留相关权利，出版方在同意发表本文的同时承认：美国政府保有对本稿件发表版本进行出版或复制，或授权他人进行此类操作的非独占、免付费、不可撤销的全球许可，以用于美国政府目的。能源部将根据《能源部公共获取计划》（http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan）的要求，向公众提供联邦资助研究成果的访问权限。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 离心管滤器（离心柱） | Corning Costar | 8160 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | VWR | 87003-294 | |
| 1260 Infinity 二元液相泵 | Agilent | G1312B | HPLC-RID 系统 |
| 1260 Infinity 高性能脱气机 | Agilent | G4225A | HPLC-RID 系统 |
| 1260 Infinity 示差折光检测器 | Agilent | G7162A | HPLC-RID 系统 |
| 1260 Infinity 标准自动进样器 | Agilent | G1329B | HPLC-RID 系统 |
| 13C6-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME 反应混合物组分（LC-MS/MS） |
| 500 mL 0.20 μm 孔径（PES 膜）滤器 | VWR | 10040-436 | |
| 乙腈（LC/MS 级） | Fisher Scientific | A955 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME 反应混合物组分 |
| Aminex HPX 87-H 色谱柱 | Bio-rad | 1250140 | HPLC-RID 色谱柱 |
| 乙酸铵（LC/MS 级） | Fisher Scientific | A11450 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| 谷氨酸铵 | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME 反应混合物组分 |
| 自动进样瓶盖（黄色，卡扣式） | Thermo Scientific | C4011-50Y | LC-MS/MS 样品储存/递送 |
| 自动进样瓶（0.30 mL，聚丙烯） | Wheaton | W225181 | LC-MS/MS 样品储存/递送 |
| 台式微量离心机 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME 反应混合物组分 |
| 辅酶 A（CoA） | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME 反应混合物组分 |
| D-右旋葡萄糖（葡萄糖） | VWR | BDH9230 | CFME 反应混合物组分 |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME 反应混合物组分 |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP2818100 | 用于标准曲线溶液配制的 S30 缓冲液溶解（HPLC-RID） |
| 甲酸（LC/MS 级） | Thermo Scientific | 85178 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| 熔融石英（内径 100 μm，外径 375 μm） | Polymicro Technologies | WM22005-ND | LC-MS/MS 色谱柱 |
| 冰乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 缓冲液组分 |
| 异丙醇（LC/MS 级） | Fisher Scientific | A461 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| Kinetex 5 μm C18 固定相（100 Å） | Phenomenex | N/A；特殊订购 | LC-MS/MS 色谱柱 |
| LTQ Orbitrap Velos Pro 质谱仪 | ThermoFisher Scientific | N/A；特殊订购 | LC-MS/MS 质谱仪 |
| 乙酸镁 | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 缓冲液组分 |
| 谷氨酸镁 | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME 反应混合物组分 |
| 甲醇（LC/MS 级） | Fisher Scientific | A456 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME 反应混合物组分 |
| 纳喷电离源 | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071（最新型号） | LC-MS/MS 质谱仪 |
| OpenLab CDS（在线）软件 | Agilent | 版本 2.15.26 | 色谱数据系统，用于采集和分析 HPLC 数据 |
| Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus 软件 | Thermo | 版本 2.7 | LC-MS/MS 系统调谐软件 |
| 乙酸钾 | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 缓冲液组分 |
| 谷氨酸钾 | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME 反应混合物组分 |
| 制冷离心机 | Eppendorf | 5415 C | |
| 螺口盖（带隔垫，9 mm） | Supelco | 29315-U | HPLC-RID 样品储存/递送 |
| 螺纹口玻璃小瓶（2 mL） | Supelco | 29376-U | HPLC-RID 样品储存/递送 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | 241245 | 用于标准曲线溶液配制的 S30 缓冲液溶解（HPLC-RID） |
| 甲酸钠 | Sigma-Aldrich | 247596 | 用于标准曲线溶液配制的 S30 缓冲液溶解（HPLC-RID） |
| 乳酸钠 | Sigma-Aldrich | 71716 | 用于标准曲线溶液配制的 S30 缓冲液溶解（HPLC-RID） |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | 398055 | 用于标准曲线溶液配制的 S30 缓冲液溶解（HPLC-RID） |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 258105 | HPLC-RID 溶剂配制 |
| 三氯乙酸 | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Tris-乙酸盐 | GoldBio | T-090-100 | S30 缓冲液组分 |
| 带自动进样器的 Ultimate 3000 液相色谱系统 | Dionex | 溶剂架：SRD-3600 | 用于 LC-MS/MS 分析的液相色谱系统 |
| 带自动进样器的 Ultimate 3000 液相色谱系统 | Dionex | 快速分离二元泵：HPG-3400RS | 用于 LC-MS/MS 分析的液相色谱系统 |
| 带自动进样器的 Ultimate 3000 液相色谱系统 | Dionex | 快速分离板式自动进样器：WPS-3000TRS | 用于 LC-MS/MS 分析的液相色谱系统 |
| 水（LC/MS 级） | Fisher Scientific | W6500 | LC-MS/MS 溶剂配制 |
| Xcalibur 软件 | Thermo | 版本 3.0.63 | LC-MS/MS 数据采集与解析软件 |
参考文献
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