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方法文章

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中线粒体亚结构蛋白定位的评估

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DOI：

10.3791/62853

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2021年7月19日

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

本文内容

摘要

尽管近年来取得了进展，许多酵母线粒体蛋白的功能仍然完全未知。本方案提供了一种简单且可靠的方法来确定蛋白质的线粒体亚结构定位，这对于阐明其分子功能至关重要。

摘要

尽管近年来在酵母线粒体蛋白质组的表征方面取得了进展，但仍有大量蛋白质的线粒体亚结构定位尚不明确。本文介绍一种可靠且有效的方法，用于确定酵母线粒体蛋白的亚细胞器定位，该步骤被认为是阐明线粒体蛋白功能的基本环节。该方法首先需获得高纯度的完整线粒体。随后，将这些线粒体制剂进行亚组分分离处理，包括低渗休克（膨胀）和蛋白酶K（蛋白酶）孵育。在膨胀过程中，线粒体外膜被选择性破坏，从而使蛋白酶K能够降解位于膜间隙的蛋白质。同时，为了获取膜蛋白拓扑结构的信息，线粒体制剂首先进行超声处理，然后用碳酸钠进行碱性提取。最后，经过离心后，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析不同处理所得的沉淀和上清组分。通过将目标蛋白的蛋白质印迹图谱与已知标准蛋白进行比较，即可确定其线粒体亚结构定位及膜拓扑结构。

引言

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，在生物能量学、细胞代谢和信号通路中发挥关键作用1。为了正确执行这些功能，线粒体依赖于一组独特的蛋白质和脂质，以维持其结构与功能。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 被广泛用作研究线粒体过程以及其他细胞器的模式系统2。酵母中线粒体基因组仅编码八种蛋白质；绝大多数线粒体蛋白质（约99%）由核基因编码，在细胞质核糖体上翻译后，通过复杂的蛋白质导入机制被转运至相应的线粒体亚区室3,4,5。因此，线粒体的生物发生依赖于核基因组与线粒体基因组的协调表达6,7。导致线粒体生物发生缺陷的遗传突变与人类疾病相关8,9,10。

在过去二十年中，针对高度纯化的线粒体开展的高通量蛋白质组学研究，已对酵母线粒体蛋白质组进行了全面表征，据估计 至少包含900种蛋白质11,12,13,14。尽管这些研究提供了宝贵的信息，但每种蛋白质在线粒体四个亚区室——外膜（OM）、膜间隙（IMS）、内膜（IM）和基质（matrix）中的亚细胞定位仍需进一步明确。这一问题已通过针对两个较小亚区室（OM和IMS）的大规模蛋白质组学研究得到部分解答15,16。最近，Vögtle 及其合作者取得了一项重大进展，通过整合基于SILAC的定量质谱分析、不同的线粒体亚组分分离方法，并结合OM和IMS蛋白质组的数据集，构建了酵母线粒体蛋白质分布的高质量全局图谱，成功将818种蛋白质定位至四个线粒体亚区室中13。

尽管高通量蛋白质组学研究已取得诸多进展，但我们对线粒体亚结构蛋白质组组成的认识仍远未完整。事实上，在Vögtle及其合作者报道的定位于酵母线粒体的986种蛋白质中，有168种无法被归入任何一种线粒体亚结构区室13。此外，作者未提供有关预测为外周结合于线粒体膜表面的蛋白质的膜拓扑结构信息。例如，无法确定被归类为内膜外周结合的蛋白质是朝向基质还是膜间隙。除了这些蛋白质组学研究中缺失的数据外，目前对于大量线粒体蛋白质的亚细胞器定位仍存在相互矛盾的信息。一个例子是蛋白酶Prd1，在Saccharomyces Genome Database（SGD）和Uniprot等常用数据库中，Prd1被标注为定位于膜间隙的蛋白质。然而，Vögtle及其合作者采用了一种与本文所述相似的亚组分分离方案，明确证明Prd1实际上是一种真正的基质蛋白13。如上所述，许多线粒体蛋白的线粒体亚结构定位仍需进一步阐明或重新评估。本文提供了一种简单且可靠的实验方案，用于确定酵母线粒体蛋白的亚细胞器定位。该方案由多个研究团队开发并优化，已被常规用于确定线粒体蛋白的线粒体亚结构定位及其膜拓扑结构。

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方案

1. 酵母细胞的培养

  1. 从-80 °C甘油保存菌种中取少量细胞，在YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）琼脂平板上划线，分离目标菌株的单菌落。将平板置于30 °C培养2-3天。
    注意：本实验方案中使用的S. cerevisiae菌株源自BY4741（MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0）。除营养缺陷型标记基因外，该菌株不含任何基因敲除，也不携带任何质粒，因此可在丰富培养基中成功培养，促进细胞旺盛生长。若使用携带质粒的菌株，应采用相应的最小培养基进行质粒筛选。
  2. 从YPD琼脂平板上挑取2-3个单菌落，接种于10-20 mL YPGal培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%半乳糖）中，置于100 mL三角烧瓶内，制备预培养物。在30 °C下剧烈振荡培养24小时。
    注意：培养基的选择取决于本实验所用的酵母菌株。YPD和YPGal均含有可发酵的碳源，可支持无法进行线粒体呼吸的菌株生长。然而，由于葡萄糖会抑制多种线粒体基因的表达，因此不建议使用该碳源，因其会导致线粒体产量较低。对于具有呼吸能力的菌株，也可尝试使用 甘油或乙醇等碳源，以 获得更高的线粒体产量。
  3. 将预培养物按稀释后OD600 低于0.1的比例接种至1 L新鲜YPGal培养基中，在30 °C下剧烈振荡培养，直至OD600 达到1-1.5。
    ​注意：在进行实验前，应先测定每种酵母菌株的生长速率（倍增时间），以便准确估算培养物达到OD600为1-1.5所需的培养时间。

2. 高纯度线粒体的分离

注意：本方案改编自17，略有修改。

  1. 通过离心在 3,000 x g 条件下收集细胞 g 室温下孵育5分钟。
  2. 用蒸馏水洗涤细胞，并在3,000 x g下离心收集细胞。 g 室温下孵育5分钟。
  3. 测定细胞的湿重。
    注意：测量第2.2步所得细胞沉淀重量的最简便方法是在收集细胞前，先称量离心管的空重。离心后，弃去上清液，再次称量同一离心管（含细胞）的重量。细胞的重量即为两次称量结果之差。
  4. 用巴斯德吸管或P5000吸头在DTT缓冲液中重悬细胞（每1 g细胞使用2 mL缓冲液）。参见 表1 DDT缓冲液成分。
  5. 在30 °C下轻轻振荡（约70 rpm）孵育细胞20分钟。
  6. 3,000 x g 离心 g 室温下离心5分钟以沉淀细胞。
  7. 用不含酶的Zymolyase缓冲液洗涤细胞（每1克细胞约7 mL）。
    ​参见 表1 用于Zymolyase缓冲液的配制。
  8. 3,000 x g 离心 g 在室温下离心5分钟以沉淀细胞。
  9. 将细胞重悬于不含Zymolyase的缓冲液中（每1 g细胞加入7 mL缓冲液）。
  10. 将细胞悬液转移至250 mL锥形瓶中，加入Zymolyase-20T（每克湿重3 mg）。
  11. 在30 °C下轻轻振荡（约70 rpm）孵育细胞30–40分钟。通过比较Zymolyase处理前后细胞悬液的浊度，检测该步骤的效率。
    注意：在此步骤中，细胞将因Zymolyase对细胞壁的消化作用而转化为原生质球。
    1. 为此，将每种细胞悬液各50 µL加入含有2 mL水的独立玻璃试管中。剧烈振荡混匀后，经Zymolyase处理的细胞悬液由于原生质球的渗透性破裂，其浑浊度应迅速降低；而未经处理的细胞悬液浑浊度应保持不变。
      注意：浊度的影响也可通过简单的目视观察或通过测量OD来监测600 的两个样品。在第二种情况下，OD600 经Zymolyase处理的样品的细胞数应为未处理样品的10%–20%。另一种方法是使用光学显微镜对两个样品中的细胞进行计数。
    2. 若原生质球形成产量较低，可加入更多Zymolyase，并继续孵育15分钟。
  12. 通过离心（2500 x g）收集球状体 g 4 °C下离心5分钟。
    注意：所有后续步骤均应快速进行，并在冰上或4 °C条件下操作，以避免水解酶导致蛋白质降解。
  13. 用预冷的匀浆缓冲液（每1 g细胞约6.5 mL）将原生质体洗涤两次，每次通过在2,500 x g下离心收集沉淀 g 4 °C下离心5分钟。参见 表1 匀浆缓冲液成分。
  14. 将原生质球重悬于预冷的匀浆缓冲液中（每1 g细胞加入6.5 mL），转移至预冷的玻璃Dounce匀浆器中。使用容量约为30 mL的大号玻璃匀浆器。
  15. 使用研杵上下研磨15次，使原生质球均匀化。
    注意：研磨次数应根据研杵的松紧程度进行调整。若使用较紧的研杵，15次研磨已足够；若使用较松的研杵，则建议研磨多达25次。
  16. 将匀浆液转移至50 mL离心管中，并加入1体积的预冷匀浆缓冲液。
  17. 将匀浆在低速下离心，1,500 x g 在4 °C下离心5分钟，以沉淀细胞核、细胞碎片和未破裂的细胞。
  18. 使用巴斯德移液管或P5000吸头将上清液转移至新的50 mL离心管中，注意避免扰动沉淀。
  19. 4,000 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。
  20. 将上清液转移至高速离心管中，在12,000 x g 在4 °C下离心15分钟，以沉淀粗线粒体组分。
  21. 弃去上清液，用P5000枪头吸取20–30 mL预冷的匀浆缓冲液，轻柔吹打重悬粗线粒体沉淀。
  22. 将悬液转移至50 mL离心管中，在4,000 x g 在4 °C下离心5分钟，以沉淀剩余的细胞碎片。
  23. 将上清液转移至高速离心管中，在12,000 x g 在4 °C下离心15分钟，以沉淀粗线粒体组分。
  24. 弃去上清液，用 P1000 移液器枪头轻轻吹打，将粗线粒体沉淀重悬于少量预冷的 SEM 缓冲液中（通常为 1000 µL）。参见 表1 用于 SEM 缓冲液成分。
    注意：尽管这种粗线粒体组分可直接用于某些应用，例如 在细胞器内 蛋白质导入实验中，它含有大量其他细胞组分。这些污染物在确定蛋白质的线粒体亚结构定位时可能导致结果误判。因此，需要进一步纯化步骤以获得高纯度的线粒体制剂，如下所述。
  25. 在EM缓冲液中配制浓度分别为60%、32%、23%和15%（w/v）的蔗糖溶液。这些溶液在4 °C下可稳定保存长达1个月。参见 表1 用于电镜缓冲液的配制。
  26. 在超速离心管中制备4步蔗糖梯度，步骤如下：将1.5 mL 60%（w/v）蔗糖溶液加至离心管底部。随后，小心地逐层加样：依次加入4 mL 32%、1.5 mL 23%和1.5 mL 15%蔗糖溶液（w/v），注意避免各相间界面扰动。
  27. 将粗线粒体组分小心地加在蔗糖梯度的上层。
  28. 以 134,000 x g 离心 1 小时 g 在4 °C下使用摆桶转子离心。
  29. 小心地继续去除蔗糖溶液，直至到达高纯度线粒体组分，该组分表现为60%/32%蔗糖界面处的棕色条带。
  30. 使用P1000切口吸头回收纯化的线粒体，并将其转移至预冷的高速离心管中。
  31. 用5-10倍体积的冰预冷SEM缓冲液稀释回收的线粒体。
  32. 在 12,000 x g 条件下离心 30 分钟 g 4 °C下
  33. 用P1000剪头枪头轻轻吹打，将纯化的线粒体重悬于500 µL预冷的SEM缓冲液中。
  34. 使用 Bradford 法，按照试剂盒说明书测定高纯度线粒体样品的蛋白质浓度。用预冷的 SEM 缓冲液将蛋白质浓度调整至 10 mg 蛋白质/mL。
    ​注意：对于下述线粒体亚组分分离方案，建议使用 freshly prepared mitochondria。然而，Vögtle 及其合作者对线粒体完整性进行了详细的质量控制分析，结果表明 frozen organelles 也可用于该方案13为此，将样品分装为每份40 µL，于液氮中速冻，然后在-80 °C保存。

3. 线粒体亚组分分离方案

注意：本方案改编自参考文献18，包含两个步骤：（1）在有或无蛋白酶K存在条件下进行低渗膨胀；（2）超声处理后进行碳酸盐提取。为避免蛋白质降解，两个方案的所有步骤均需在冰上或4 °C下进行。

  1. 在蛋白酶K存在下的低渗膨胀
    1. 将40 µL浓度为10 mg/mL（400 µg）的高纯度线粒体转移至四个预冷并标记的1.5 mL微量离心管中。
    2. 向1号和2号管中各加入360 µL SEM缓冲液。
    3. 向3号和4号管中各加入360 µL EM缓冲液。
    4. 向2号和4号管中各加入4 µL蛋白酶K（10 mg/mL）。请使用表2中列出的移液方案以避免错误。
      注意：请在使用前立即用水配制10 mg/mL的蛋白酶K溶液。实验中蛋白酶K的终浓度应约为50–100 µg/mL。更多细节请参见讨论部分。
    5. 轻轻混匀所有试管，并在冰上孵育30分钟，期间偶尔轻柔混匀。
    6. 向全部四个试管中各加入4 µL 200 mM PMSF，以终止蛋白酶K活性。
      警告：PMSF具有高毒性。操作含PMSF的溶液时请佩戴手套。
    7. 在4 °C条件下以20,000 x g离心30分钟。
    8. 收集上清液并转移至新的预冷并标记的1.5 mL微量离心管中。注意避免扰动沉淀。
      注意：沉淀可直接用样品缓冲液重悬，用于后续SDS-PAGE和Western印迹分析。然而，即使经过PMSF处理，微量蛋白酶K仍可能保持活性，并在沉淀溶解于含SDS的样品缓冲液后逐渐降解部分蛋白质。为避免此问题，可通过三氯乙酸（TCA）处理完全灭活蛋白酶K，如下所述。
      警告：TCA具有高毒性。操作含TCA的溶液时请佩戴手套。
    9. 将步骤3.1.8中的沉淀用400 µL预冷的SEM缓冲液重悬。
    10. 用TCA将步骤3.1.8的上清液和步骤3.1.9中重悬的沉淀沉淀至终浓度为10%（w/v）。
    11. 将所有试管置于冰上孵育10分钟。
    12. 将经TCA处理的样品在4 °C条件下以12,000 x g离心10分钟。
    13. 弃去上清液，并将沉淀用200 µL样品缓冲液重悬。
      注意：由于酸处理，溴酚蓝pH指示剂可能变为黄色。若发生此情况，可逐次加入少量（1–5 µL）1 M Tris碱溶液，直至颜色变蓝。
    14. 向所有试管中加入4 µL 200 mM PMSF。
    15. 将所有样品在-80 °C保存，待后续进行SDS-PAGE和Western印迹分析。
  2. 超声处理与碳酸盐提取
    注意：在本方案中，一旦超声处理导致线粒体膜破裂，则无需使用新鲜制备的线粒体。
    1. 将200 µL浓度为10 mg/mL（2 mg蛋白）的高纯度线粒体转移至一个预冷的1.5 mL微量离心管中。
    2. 用预冷的SEM缓冲液将线粒体稀释一倍。
    3. 在冰上进行超声处理，每次30秒，共3次。使用适用于小体积样品的超声仪。
    4. 在4 °C条件下以100,000 x g离心30分钟。
    5. 收集上清液并转移至新的预冷1.5 mL微量离心管中，置于冰上。该样品命名为可溶性蛋白组分（S）。
    6. 将步骤3.2.4中的沉淀用400 µL预冷的SEM缓冲液重悬。
    7. 取步骤3.2.6中重悬沉淀的100 µL转移至新的预冷1.5 mL微量离心管中，置于冰上。该样品命名为亚线粒体颗粒组分（SMP）。
    8. 将步骤3.2.6中剩余的300 µL沉淀用新配制的200 mM碳酸钠稀释一倍。
    9. 将步骤3.2.8的样品在冰上孵育30分钟。
    10. 在4 °C条件下以100,000 x g离心30分钟。
    11. 收集上清液并转移至新的预冷1.5 mL微量离心管中，置于冰上。该样品命名为碳酸盐上清组分（CS）。
    12. 将步骤3.2.10中的沉淀用400 µL预冷的SEM缓冲液重悬。该样品命名为碳酸盐沉淀组分（CP）。
    13. 用TCA将所有样品（S、SMP、CS和CP）沉淀至终浓度为10%（w/v）。
    14. 将所有试管置于冰上孵育10分钟。
    15. 将经TCA处理的样品在4 °C条件下以12,000 x g离心10分钟。
    16. 弃去上清液，并将各沉淀用样品缓冲液重悬。若样品缓冲液变黄，可逐次加入少量（1–5 µL）1 M Tris碱溶液，直至颜色变蓝。
    17. 向所有试管中加入1 µL 200 mM PMSF。
    18. 将所有样品在-80 °C保存，待后续进行SDS-PAGE和Western印迹分析。

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结果

亚线粒体组分分离方案的成功取决于获得高纯度的完整线粒体。为此，在酵母细胞裂解过程中，必须几乎完全保持细胞器的完整性。这可通过采用一种结合酶法消化细胞壁，随后使用Dounce匀浆器物理破坏质膜的细胞裂解方法来实现。然后通过差速离心收集线粒体内容物。这种亚细胞分级分离可获得富集的线粒体组分，这一点已通过线粒体标志蛋白孔蛋白（Por1）的高表达水平得到证实（图1，第2道）。然而，该组分为粗制线粒体组分，其中含有大量其他细胞区室成分，包括内质网、液泡、胞质溶胶和内体（图1，第2道）。这些污染成分可能在某些应用中引入假象，例如在线粒体亚结构蛋白定位实验中。为了减少这些污染，将粗制线粒体组分进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化。这一额外的纯化步骤可获得高度纯净的线粒体组分，表现为其他细胞区室蛋白标志物的含量显著降低（图1，第3道）。

为了确定蛋白质的线粒体亚结构定位，需将高度纯化的线粒体进一步分离为其亚区室（

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讨论

本方案已成功应用并长期持续优化，用于确定蛋白质在线粒体亚结构区室中的定位13,14,18,21,22,23。该方案的可靠性和可重复性在很大程度上取决于线粒体样品的纯度和完整性18。通过在粗线粒体制备物中增加一步额外的纯化步骤（蔗糖密度梯度离心），即可同时满足这两个要求13,24,25（图1）。除了去除非线粒体来源的杂质外，该额外纯化步骤还可去除在实验操作过...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢哥伦比亚大学的 A. Tzagoloff 博士提供了针对线粒体亚结构标志蛋白 Cyt. b2、αKGD 和 Sco1 的抗体。我们还感谢圣保罗大学的 Mario Henrique de Barros 博士在本实验方案建立过程中提供的有益讨论和意见。

本工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）研究资助（项目编号 2013/07937-8）的支持。

Fernando Gomes 和 Helena Turano 还得到了 FAPESP 的资助，资助编号分别为 2017/09443-3 和 2017/23839-7。Angélica Ramos 还得到了高等教育人员进修协调办公室（CAPES）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨（Bacto Peptone）BD211677
酵母提取物（Bacto Yeast extract）BD212750
Beckman 超透明离心管，14 × 89 mmBeckman Coulter344059
牛血清白蛋白（BSA，无脂肪酸）Sigma-AldrichA7030匀浆缓冲液组分
二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）Sigma-Aldrich43815DTT 缓冲液组分
D-山梨醇（D-Sorbitol）Sigma-AldrichS1876
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichE9884
半乳糖（Galactose）Sigma-AldrichG0625
葡萄糖（Glucose）Sigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626用于灭活蛋白酶K
磷酸氢二钾Sigma-AldrichP3786
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP0662
蛋白酶K（Proteinase K）Sigma-Aldrich
蔗糖（Sucrose）Sigma-AldrichS8501
三氯乙酸（TCA）Sigma-AldrichT6399
Trizma 碱（Trizma Base）Sigma-AldrichT1503
来自Arthrobacter luteus的Zymolyase-20TMP Biomedicals, Irvine, CA320921用于裂解活酵母细胞壁以制备原生质球

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