尽管近年来取得了进展，许多酵母线粒体蛋白的功能仍然完全未知。本方案提供了一种简单且可靠的方法来确定蛋白质的线粒体亚结构定位，这对于阐明其分子功能至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
尽管近年来在酵母线粒体蛋白质组的表征方面取得了进展，但仍有大量蛋白质的线粒体亚结构定位尚不明确。本文介绍一种可靠且有效的方法，用于确定酵母线粒体蛋白的亚细胞器定位，该步骤被认为是阐明线粒体蛋白功能的基本环节。该方法首先需获得高纯度的完整线粒体。随后，将这些线粒体制剂进行亚组分分离处理，包括低渗休克（膨胀）和蛋白酶K（蛋白酶）孵育。在膨胀过程中，线粒体外膜被选择性破坏，从而使蛋白酶K能够降解位于膜间隙的蛋白质。同时，为了获取膜蛋白拓扑结构的信息，线粒体制剂首先进行超声处理，然后用碳酸钠进行碱性提取。最后，经过离心后，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析不同处理所得的沉淀和上清组分。通过将目标蛋白的蛋白质印迹图谱与已知标准蛋白进行比较，即可确定其线粒体亚结构定位及膜拓扑结构。
引言
线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，在生物能量学、细胞代谢和信号通路中发挥关键作用1。为了正确执行这些功能，线粒体依赖于一组独特的蛋白质和脂质，以维持其结构与功能。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 被广泛用作研究线粒体过程以及其他细胞器的模式系统2。酵母中线粒体基因组仅编码八种蛋白质；绝大多数线粒体蛋白质（约99%）由核基因编码，在细胞质核糖体上翻译后，通过复杂的蛋白质导入机制被转运至相应的线粒体亚区室3,4,5。因此，线粒体的生物发生依赖于核基因组与线粒体基因组的协调表达6,7。导致线粒体生物发生缺陷的遗传突变与人类疾病相关8,9,10。
在过去二十年中，针对高度纯化的线粒体开展的高通量蛋白质组学研究，已对酵母线粒体蛋白质组进行了全面表征，据估计....
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方案
1. 酵母细胞的培养
- 从-80 °C甘油保存菌种中取少量细胞，在YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）琼脂平板上划线，分离目标菌株的单菌落。将平板置于30 °C培养2-3天。
注意：本实验方案中使用的S. cerevisiae菌株源自BY4741（MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0）。除营养缺陷型标记基因外，该菌株不含任何基因敲除，也不携带任何质粒，因此可在丰富培养基中成功培养，促进细胞旺盛生长。若使用携带质粒的菌株，应采用相应的最小培养基进行质粒筛选。 - 从YPD琼脂平板上挑取2-3个单菌落，接种于10-20 mL YPGal培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%半乳糖）中，置于100 mL三角烧瓶内，制备预培养物。在30 °C下剧烈振荡培养24小时。
注意：培养基的选择取决于本实验所用的酵母菌株。YPD和YPGal均含有可发酵的碳源，可支持无法进行线粒体呼吸的菌株生长。然而，由于葡萄糖会抑制多种线粒体基因的表达，因此不建议使用该碳源，因其会导致线粒体产量较低。对于具有呼吸能力的菌株，也可尝试使用 甘油或乙醇等碳源，以 获得更高的线粒体产量。 - 将预培养物按稀释后OD600 低于0....
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结果
亚线粒体组分分离方案的成功取决于获得高纯度的完整线粒体。为此，在酵母细胞裂解过程中，必须几乎完全保持细胞器的完整性。这可通过采用一种结合酶法消化细胞壁，随后使用Dounce匀浆器物理破坏质膜的细胞裂解方法来实现。然后通过差速离心收集线粒体内容物。这种亚细胞分级分离可获得富集的线粒体组分，这一点已通过线粒体标志蛋白孔蛋白（Por1）的高表达水平得到证实（图1，第2道）。然而，该组分为粗制线粒体组分，其中含有大量其他细胞区室成分，包括内质网、液泡、胞质溶胶和内体（图1，第2道）。这些污染成分可能在某些应用中引入假象，例如在线粒体亚结构蛋白定位实验中。为了减少这些污染，将粗制线粒体组分进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化。这一额外的纯化步骤可获得高度纯净的线粒体组分，表现为其他细胞区室蛋白标志物的含量显著降低（图1，第3道）。
为了确定蛋白质的线粒体亚结构定位，需将高度纯化的线粒体进一步分离为其亚区室（
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讨论
本方案已成功应用并长期持续优化，用于确定蛋白质在线粒体亚结构区室中的定位13,14,18,21,22,23。该方案的可靠性和可重复性在很大程度上取决于线粒体样品的纯度和完整性18。通过在粗线粒体制备物中增加一步额外的纯化步骤（蔗糖密度梯度离心），即可同时满足这两个要求13,24,25（图1）。除了去除非线粒体来源的杂质外，该额外纯化步骤还可去除在实验操作过.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢哥伦比亚大学的 A. Tzagoloff 博士提供了针对线粒体亚结构标志蛋白 Cyt. b2、αKGD 和 Sco1 的抗体。我们还感谢圣保罗大学的 Mario Henrique de Barros 博士在本实验方案建立过程中提供的有益讨论和意见。
本工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）研究资助（项目编号 2013/07937-8）的支持。
Fernando Gomes 和 Helena Turano 还得到了 FAPESP 的资助，资助编号分别为 2017/09443-3 和 2017/23839-7。Angélica Ramos 还得到了高等教育人员进修协调办公室（CAPES）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨（Bacto Peptone） | BD | 211677 | |
| 酵母提取物（Bacto Yeast extract） | BD | 212750 | |
| Beckman 超透明离心管，14 × 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| 牛血清白蛋白（BSA，无脂肪酸） | Sigma-Aldrich | A7030 | 匀浆缓冲液组分 |
| 二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol） | Sigma-Aldrich | 43815 | DTT 缓冲液组分 |
| D-山梨醇（D-Sorbitol） | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 半乳糖（Galactose） | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| 葡萄糖（Glucose） | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma-Aldrich | P7626 | 用于灭活蛋白酶K |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| 蛋白酶K（Proteinase K） | Sigma-Aldrich | ||
| 蔗糖（Sucrose） | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| 三氯乙酸（TCA） | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma 碱（Trizma Base） | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 来自Arthrobacter luteus的Zymolyase-20T | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | 用于裂解活酵母细胞壁以制备原生质球 |
参考文献
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast ....
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