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在生物安全三级（BSL-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型

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DOI：

10.3791/62857

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2021年9月10日

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1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, 3Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University Hospital, 4Research Group “Cellular Polarity and Viral Infection”, German Cancer Research Center (DKFZ)

本文内容

摘要

本方案描述了如何从人肠道类器官的顶侧或基底侧进行感染，以利用单细胞RNA测序（scRNAseq）技术在单细胞水平上表征宿主与病原体之间的相互作用。

摘要

人肠道类器官是研究胃肠道病原体感染的最佳细胞模型。这些类器官可来源于胃肠道的所有区段（胃、空肠、十二指肠、回肠、结肠、直肠），并在分化后包含各肠段天然存在的大多数细胞类型。例如，肠道类器官包含营养吸收性肠上皮细胞、分泌型细胞（杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞）、干细胞，以及所有谱系特异性的分化中间阶段细胞（例如 早期或未成熟细胞类型）。利用胃肠道来源的类器官研究感染性疾病的最主要优势在于，能够精确定位何种细胞类型被肠道病原体靶向，并可探究胃肠道不同区段及其特异性细胞类型对病原体攻击的响应是否一致。近年来，胃肠道类器官模型以及其他组织来源的类器官已被广泛用于研究病毒嗜性及致病机制。然而，在使用高致病性病毒时充分运用类器官的各项优势仍面临技术挑战，并需要严格的生物安全考量。此外，由于类器官通常以三维形式培养，细胞的基底侧朝向类器官外部，而其顶端侧则朝向类器官内部（腔内）。这种结构对肠道病原体的研究构成了挑战，因为多数肠道感染在摄入后始于细胞的顶端/腔面侧。本文将提供一套全面的实验方案，用于准备人肠道类器官以进行肠道病原体感染研究，并考虑感染途径（顶端侧 vs. 基底侧），进而开展单细胞RNA测序，以表征细胞类型特异性的宿主-病原体相互作用。该方法详细描述了类器官的制备流程，以及在生物安全三级（BSL-3） containment 条件下开展此类工作所需注意的各项事项。

引言

由于缺乏原代人类细胞模型，对人类肠道病毒的细胞类型特异性趋向性以及细胞类型特异性免疫应答的研究一直面临挑战。随着类器官技术的发展，这一局限性目前已得到部分解决1。在胃肠道领域，已建立了人类及多种其他物种（例如， 小鼠、牛、猫、蝙蝠）的胃和肠类器官模型2,3,4,5,6。肠类器官能够重现人类肠上皮的结构架构，包含隐窝和绒毛样结构，具有功能性肠细胞谱系，甚至已被用于鉴定此前未知的细胞谱系。目前有两种不同的方法可用于培养肠类器官。第一种方法是从组织切除样本或活检标本中分离含有隐窝的肠干细胞，并在特定培养条件下（例如 Wnt3A、R-spondin、Noggin 和 EGF）进行扩增，随后将其分化为大多数肠细胞谱系（例如， 肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞）7。该方法可用于从胃肠道各个节段（例如， 胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠）分离类器官。第二种方法则依赖于人诱导性多能干细胞或胚胎干细胞，通过逐步分化过程生成肠上皮细胞8。这些基于诱导干细胞的类器官通常被认为相较于患者来源的类器官更具胚胎样特性。尽管所有这些类器官模型对于揭示形成肠道所需的发育信号至关重要，但其在感染性疾病研究中的应用仍处于起步阶段。

肠道病毒是一个广义术语，涵盖所有通过胃肠道感染的病毒，例如小RNA病毒（如.，EV-71），呼肠孤病毒（例如，轮状病毒），以及杯状病毒（例如，诺如病毒）9肠道病毒通过摄入被污染的食物和水启动其感染性生命周期，由于发展中国家将未经处理的废弃物排入环境，且感染发生后缺乏医疗护理，使人群面临较高的感染风险。10根据病原体类型的不同，感染可导致胃肠炎、呕吐和/或因肠黏膜渗漏引起的水样腹泻。人诺如病毒是一种高度流行且传染性极强的肠道病原体，全球每年导致超过6亿例感染和1500万例住院。11类器官在诺如病毒研究中发挥了关键作用，因为它们能够支持人类诺如病毒的感染与复制，而该病毒此前无法在标准的细胞培养模型中进行培养。12.

在过去二十年中，冠状病毒已成为重要的人类病原体13。该病毒家族包括高致病性的MERS、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，对这些病毒开展研究时需要严格的生物安全防护措施。有趣的是，尽管这三种病原体主要因其引发的呼吸道症状和呼吸困难而被认识，但现在已明确这些病毒不仅感染呼吸道，还可感染其他器官。除呼吸系统症状外，SARS-CoV-2感染患者中另一个重要的病理表现是出现胃肠道症状14。部分SARS-CoV-2感染者表现出此类症状，临床表现从极轻微到严重腹泻不等。此外，在感染者的粪便及胃肠道组织活检样本中均可检测到SARS-CoV-2基因组15。值得注意的是，胃肠道症状并不仅限于SARS-CoV-2感染，在MERS和SARS-CoV-1感染者中也观察到了类似现象。为了阐明SARS-CoV-2如何引发胃肠道损伤，并精确定义其在胃肠道中的嗜性，人类肠道类器官已成为关键研究工具，目前正被广泛用于解析该病原体对特定细胞类型的感染响应机制16,17。

对细胞群体进行转录谱分析（批量RNA测序）在评估病原体感染 immortalized 细胞系以及类器官时已成为常规做法。尽管这种方法能够帮助我们确定细胞对病原体的整体响应变化（例如细胞因子的上调），但批量RNA测序无法揭示为何群体中某些特定细胞比其他细胞更容易被感染。单细胞RNA测序（scRNAseq）已成为解析细胞谱系特异性转录程序的有力工具，可用于研究这些转录程序如何促进或抑制病毒感染18,19。scRNAseq的首次描述发表于2009年，当时用于分析小鼠卵裂球中不同细胞的转录谱20。目前，该技术已得到扩展，并可通过多种不同平台实现。早期技术采用荧光激活细胞分选仪（FACS）将单个细胞分离用于测序，通常局限于96孔或384孔板，每样本最多可分析约300个单细胞21。如今，单细胞测序平台已取得进展，采用微流控装置将单个细胞与携带条形码的微珠共同包裹进独立的液滴中。该技术可使每个样本条件下捕获多达10,000个细胞。

将类器官技术与单细胞RNA测序（scRNAseq）相结合，使我们能够以细胞类型特异性的方式研究肠道病原体对胃肠道的影响。然而，需要考虑若干技术与生物安全因素。首先，传统的类器官培养方法（即三维（3D）类器官，嵌入于细胞外基质（ECM）中）会使上皮细胞的基底侧暴露于类器官外部。由于肠道病原体通常通过摄入受污染的食物或水而感染，感染通常起始于细胞的顶膜侧，而这一侧在这些3D肠类器官中是无法接触的。因此，必须对类器官进行处理，以使病原体能够接触到细胞的顶膜侧，可通过二维（2D）接种方式直接暴露细胞顶膜侧，或通过显微注射实现22,23。其次，在对感染样本进行scRNAseq分析时，必须考虑其传染性。尽管已有方法可在单细胞分离前通过固定细胞并灭活病原体来降低风险，但这些方法常导致测序质量下降18。以下方案将描述几种针对肠类器官进行肠道病毒感染的方法，考虑感染途径（顶膜侧 vs. 基底侧感染）（图1）。此外，该方案还将包括一个工作流程，用于从高度致病性病毒感染的类器官中解离并分离单细胞，以进行scRNAseq分析。本方案将重点说明在生物安全三级（BSL-3）防护条件下操作时需实施的关键步骤，以避免气溶胶的产生和潜在污染。

方案

人体组织来自海德堡大学医院的结肠切除术或回肠活检，用于以下实验方案。本研究在海德堡大学医院的建议下进行，并根据《赫尔辛基宣言》的要求，获得所有受试者的知情书面同意。所有样本均以匿名方式接收和保存。该方案已获得海德堡大学医院伦理委员会批准，批准编号为 S-443/2017。

1. 肠道和结肠类器官的维持与传代

警告：人肠道类器官来源于人体组织或诱导性多能干细胞/胚胎干细胞，因此需要获得伦理审批。必须遵守各国相应的法规。人体材料通常未经检测，因此常被视为生物安全等级2（BSL-2）材料。应在实验所在国家确认适当的 containment 条件。

  1. 采用先前描述的方法2，从分离的组织和/或活检样本中制备肠道和结肠类器官。此外，关于如何从患者来源材料或诱导性多能干细胞（iPSCs）制备类器官的更多技术细节，可参见 Lees 等人和 Mahe 等人的研究24,25。
  2. 一旦类器官培养物建立，按照下述传代操作流程准备类器官，以用于肠道病原体感染实验。
  3. 在24孔非组织培养处理板中，将20–100个类器官接种于50 μL 100% ECM溶液中。每孔加入500 μL生长培养基（表1）。
  4. 每2天更换一次培养基，从每孔中移除250 μL旧培养基，并添加250 μL新鲜生长培养基。更换前将培养基预热至室温。
    注意：低温培养基会使含类器官的ECM溶液液化。
  5. 当类器官内部因死细胞积聚而开始变暗时，每周传代一次。示例见图2。
  6. 在传代当天，从-20 °C取出ECM溶液并在冰上解冻。
  7. 将用于接种传代后类器官的新空细胞培养板置于37 °C预热（至少需1小时，也可过夜预热）。同时将培养基预热至室温。
  8. 使用P1000移液器移除生长培养基，每孔加入500 μL冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS），孵育3分钟，以部分液化ECM溶液并使类器官脱离培养板。
  9. 为确保ECM溶液完全解离，使用P1000移液器（设定为450 μL）上下吹打10次，重悬PBS、ECM溶液和类器官，将重悬液转移至15 mL锥形管中，并置于冰上。
  10. 将多个相同类器官的孔收集至同一锥形管中。
  11. 若同时传代多个不同类器官（如不同供体、不同部位、不同预处理等），应分别收集至不同锥形管中。收集过程中保持锥形管置于冰上。
  12. 在4 °C下以500 × g离心5分钟。小心使用移液器移除PBS，保留底部的类器官沉淀。
  13. 避免使用带套管的真空废液系统，因为类器官沉淀非常松散，若移除PBS过快，容易被抽吸掉。
  14. 向锥形管中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶，用P1000移液器上下吹打10次以重悬类器官。将含类器官的锥形管在37 °C孵育3分钟。
  15. 加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基以终止消化反应，并用P1000移液器上下吹打10次以进一步解离类器官。
  16. 在4 °C下以500 × g离心5分钟。从离心机中取出锥形管并置于冰上保存。
  17. 使用5 mL一次性移液器小心移除上清液/胰蛋白酶，保留底部的类器官沉淀。残留约500 μL液体时，改用P1000移液器移除。
  18. 当所有锥形管中的上清液/胰蛋白酶均被移除后，将24孔非细胞培养处理板从37 °C培养箱中取出，并置于细胞培养罩内。
  19. 根据各供体类器官的生长特性，按1:3至1:5的比例，向含传代后类器官的锥形管中加入保持在冰上的100% ECM溶液。（例如，若原为一个孔中含20–100个类器官、50 μL ECM液滴，则将类器官沉淀重悬于150–250 μL冰冻ECM溶液中。）
  20. 将50 μL ECM溶液/类器官混合液接种至已预热至37 °C的24孔非细胞培养处理板的每孔中。
    注意：ECM溶液一旦升温会迅速聚合。使用过程中应始终保持ECM溶液低温（置于冰上）。类器官重悬后应立即接种至新板。对于初学者，建议将移液器吸头盒存放于-20 °C，以延长操作时间。
  21. 将24孔板在37 °C孵育10–15分钟，使ECM溶液完成聚合。
  22. 聚合完成后，每孔加入500 μL生长培养基（表1）26，将类器官在37 °C继续培养。每日通过显微镜观察类器官状态，并按照步骤1.4每2天更换一次培养基。

2. 用于顶面感染的二维（2D）类器官制备

注意：以下方案将介绍如何将肠类器官以单层细胞形式接种于细胞培养板中，以便从其顶侧感染肠上皮细胞。测序实验请使用48孔板，而通过免疫荧光方法监测感染时则使用8孔玻璃底共聚焦培养皿。

  1. 按照第1节所述方法培养和维持类器官。
  2. 在将类器官接种至二维培养前，于37 °C条件下，用每孔200 μL的2.5%人胶原蛋白水溶液孵育48孔板和8孔玻璃底培养板，每孔处理1小时。
    注意：肠类器官最适合接种于48孔板和8孔玻璃底培养板中。经验表明，其在96孔板中感染效果不佳。也可使用Transwell小室，以便在二维培养条件下实现顶膜和基底膜侧的感染。若使用Transwell，应在感染前检测跨上皮电阻（TEER），以确认已形成融合的单层细胞。通常情况下，肠类器官具有紧密的屏障，TEER值为450–600 Ohm/cm。2.
  3. 在每孔48孔板或8孔玻璃底培养皿的一个孔中接种100-150个类器官。
  4. 为估算类器官数量，计数第1步中制备的24孔板内50 μL ECM溶液液滴中的类器官数目。通常需要1-2个孔，可获得约15,000-30,000个细胞。
  5. 为破坏ECM溶液并消化类器官，请执行步骤1.8–1.17。
  6. 从48孔板和8孔玻璃底培养皿中移除人胶原蛋白。
  7. 将类器官沉淀物用250 μL生长培养基重悬于锥形管中，将悬液加入胶原蛋白包被的孔板孔内。将培养板置于37 °C培养箱中。
    注意：进行实验时，会比较多个条件（对照） 与 感染±目标处理）。为尽量减少2D培养类器官各孔间的变异性，应将所需数量的类器官统一收集至同一锥形管中。从最多12个24孔板孔中收集类器官时，可使用1 mL胰蛋白酶和2 mL中和培养基；当使用12至24个孔时，应增加至2 mL胰蛋白酶和4 mL中和培养基。
  8. 48小时后，将培养板从培养箱中取出，放入细胞培养超净台中。吸去生长培养基，每孔加入250 μL分化培养基（表148小时后重复更换培养基。
  9. 48小时后，通过提取RNA，使用250 ng RNA反转录为cDNA，并利用针对干细胞（OLFM4 和/或 SMOC2）、杯状细胞（MUC2）、肠内分泌细胞（CHGA）以及肠上皮吸收细胞（SI 和/或 CYP3A4）的引物进行基于SYBR Green的qPCR检测，以确认分化情况（即转换至分化培养基后第四天）。图3).
    注意：从生长培养基转换为分化培养基后，类器官将 降低干细胞标志物（OLFM4 和/或 SMOC2）的表达，并增加 杯状细胞（MUC2）、肠内分泌细胞（CHGA）和肠上皮细胞（SI 和/或 CYP3A4）的标志物通过 qPCR 检测。额外准备一个孔，使用生长培养基培养，以比较各细胞类型特异性标志物在生长条件下的表达水平 与 分化培养基
  10. 在确认分化完成后，类器官即可进行顶端感染。将类器官转移至针对所选病原体所需的生物安全等级防护环境中。
    警告：处理BSL-2或BSL-3级防护条件下的病原体时，须参照所在机构的本地规定和标准操作程序。
  11. 为了从顶膜侧感染在二维培养的肠类器官，使用P1000移液器移除培养基，并在分化培养基中加入所需感染复数的病原体稀释液（每孔病原体/培养基混合液体积最少为50 μL，最多为250 μL）。
  12. 在37 °C条件下，将培养板置于细胞培养箱内的摇床上，或每15–20分钟手动轻摇一次，使感染反应进行2小时。根据所选病原体优化该孵育时间。
  13. 2小时后，使用P1000移液器吸除培养基，每孔加入250 μL新鲜分化培养基。将细胞在37 °C培养箱中继续培养，直至进行单细胞测序的时间点。
  14. 为进行单细胞测序的细胞制备，请进入第4节。

3. 用于顶面和基底面感染的三维（3D）类器官制备

  1. 按照第1节所述方法，在24孔非细胞培养处理板中培养类器官。
  2. 传代后两天，将培养板从培养箱中取出，并置于细胞培养超净台中。
  3. 使用P1000移液器移除生长培养基，每孔加入500 μL预温至室温的分化培养基，然后将培养板放回37 °C培养箱中。
  4. 48小时后，更换新鲜分化培养基（每孔500 μL）。
    注意：类器官在感染前需在分化培养基中维持共4天。
  5. 按照步骤2.9所述方法确认分化情况。
  6. 确认分化完成后，类器官即可用于感染实验。
  7. 将细胞外基质（ECM）置于冰上解冻。将分化培养基预温至室温，并将一个24孔板预热至37 °C。
  8. 进行感染时，将类器官从ECM溶液中取出。
    注意：应尽可能去除ECM溶液，因为病毒更倾向于结合ECM溶液而非细胞。若类器官周围残留过多ECM溶液，将严重影响感染效率。
  9. 通过加入500 μL冷的1x PBS并孵育3分钟来破坏ECM结构。使用P1000上下吹打10次。将类器官合并至同一离心管中，在500 × g条件下离心5分钟。用P1000移除PBS。
    注意：为尽量减少各感染条件之间的差异，应将来自24孔板多个孔的类器官合并至同一锥形离心管中。例如，若需要设置八个感染条件，则可将24孔板中的八个孔（每孔约含100个类器官）合并，随后在针头破碎后分装至新的24孔板的八个孔中（见步骤3.12）。
  10. 将类器官重悬于1 mL分化培养基中。如需进行顶膜和基底膜侧感染，请执行步骤3.10.1；如仅进行基底膜侧感染，请执行步骤3.10.2。
    1. 将27 G针头连接至1 mL注射器，将沉淀重悬并反复推注6次，以破碎类器官结构，使感染可在顶膜和基底膜两侧同时发生。随后进入步骤3.11。
      注意：在针头破碎前观察，类器官应呈现典型的囊状或章鱼芽状结构，中心颜色较深。破碎后，类器官体积变小，内部深色区域减少或消失。进行感染实验时，至少应设置两个条件（模拟感染组与感染组），因此最初需将24孔板中至少两个孔的类器官合并至一个15 mL锥形离心管中进行针头破碎（因此重悬体积至少为1 mL）。若需设置超过两个条件，可将最多10个孔的类器官合并至一个15 mL锥形离心管中，并用1 mL分化培养基重悬以进行针头破碎。破碎完成后，按n + 1加入500 μL分化培养基（例如，若使用10个孔，则补充4.5 mL，使总体积达5.5 mL）。若条件超过10个，应使用多个锥形离心管。推荐使用1 mL注射器，因该规格注射器更利于有效破碎类器官。也可使用压扁的P1000吸头作为替代方案。
    2. 每孔类器官用500 μL分化培养基重悬。操作时注意避免破碎类器官，并确保顶膜侧不可接触。随后进入步骤3.11。
  11. 使用P1000移液器将每孔500 μL类器官悬液转移至24孔细胞培养板中，并将培养板转移至对应病原体所需生物安全等级的防护环境中。
    警告：处理BSL-2或BSL-3等级病原体时，请遵循当地法规及机构标准操作程序。类器官的针头破碎操作必须在BSL-3环境外进行，以避免针头相关意外事故。根据当地规定，BSL-3环境中可能禁止使用针头。
  12. 将用分化培养基稀释后的病原体加入孔中，使其达到实验所需的感染复数（MOI）。总加入体积不得超过500 μL（使24孔板每孔总体积为1 mL）。
  13. 在37 °C条件下进行感染，持续2小时（该时间需根据具体病原体调整），可使用细胞培养箱内的摇床，或每15–20分钟手动轻摇培养板一次。
  14. 2小时孵育结束后，将每种条件下的类器官收集至一个1.5 mL离心管中，在4 °C、500 × g条件下离心5分钟。
  15. 使用P1000移液器移除含病原体的培养基，并将其置于冰上保存。用PBS清洗类器官沉淀一次。
  16. 将类器官重悬于50 μL预先在冰上解冻的100% ECM溶液中，接种至已预热至37 °C的24孔非细胞培养处理板中，并在37 °C孵育10–15分钟，使ECM溶液完成聚合。
  17. 聚合完成后，向每孔加入500 μL室温分化培养基，并在37 °C继续培养，直至进行单细胞测序取样。
    ​注意：若取样时间需超过接种后48小时，应每隔2天更换一次培养基，即移除旧培养基并加入500 μL新鲜分化培养基。但经验表明，由于类器官在分化培养基中生长，其存活时间通常不超过48小时。

4. 在生物安全三级（BSL-3）条件下制备单细胞悬液及凝胶珠-乳液（GEMs）

注意：完成以下步骤需要在BSL-3实验室内部配备单细胞测序设备（材料表）以及能够处理100 μL反应体系的PCR仪。类器官的培养按照第1节所述进行，并根据病原体种类和感染途径，按照第2–3节所述进行感染。在预定的感染后时间点收获类器官。以下描述了用于收获肠道类器官的方法。

  1. 在收获感染的类器官之前，去除单细胞凝胶珠（Single Cell Gel beads）材料表从 -80 °C 取出并恢复至室温（至少提前 30 分钟）。
  2. 此外，将RT试剂、还原剂B和RT酶C（均保存于-20 °C）平衡至室温。按照生产商说明书所述重新悬浮模板转换寡核苷酸。
    注意：以下所有步骤均须遵循针对所涉病原体的既定标准操作程序以及当地的生物安全法规。作为生物安全三级（BSL-3）实验室操作的一般原则，所有离开细胞培养操作台的容器（如培养板、试管等）外部必须经过适当消毒，执行实验人员的手部或手套也须同样进行消毒处理。
  3. 若对二维培养的类器官（第2节）进行感染，请执行步骤4.4；若对三维类器官（第3节）进行感染，请执行第4.5节。
  4. 对于二维类器官的感染实验，将细胞培养板放入生物安全柜中，使用P1000移液器吸除分化培养基。
    1. 每孔加入 250 μL 室温的 1x PBS。
    2. 用 P1000 移液器吸除 PBS，向 48 孔板的每个孔中加入 250 μL 室温解离酶（例如 TrypLE Express）。更换手套，清洁培养板，将含有解离酶的培养板放入 37 °C 培养箱中。
    3. 每5分钟通过显微镜观察一次细胞解离情况。
      注意：将二维培养的肠类器官解离为单个细胞大约需要15分钟。具体时间需根据实际情况调整，因为解离时间取决于最初接种并感染的类器官数量以及所使用的病原体种类——某些病原体具有更强的细胞病变效应，会导致类器官比其他病原体更快解离。
    4. 在确认获得明显的单细胞悬液后，将培养板移回细胞培养超净台，通过向48孔板的每孔加入250 μL含10% FBS的DMEM/F12培养基终止消化反应。
    5. 使用 P1000 移液器将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
    6. 更换手套，清洁离心管，以500 x g离心样品 g 4 °C下离心5分钟。
    7. 用 P1000 小心吸除培养基/解离酶，以保持细胞沉淀位于管底。用含 0.1% BSA 的 PBS 将单细胞重悬于最小体积中。对于肠类器官，每孔 48 孔板加入 250 μL。
    8. 将细胞悬液通过滤器转移至流式管中，以去除任何大块团块，并将含有细胞的流式管置于冰上。
    9. 继续执行步骤 4.6，进行细胞计数和主混合液的制备。
  5. 对于类器官的感染实验，将培养板从培养箱中取出，置于细胞培养操作台内。
    1. 用 P1000 移液器从 24 孔板的每个孔中移除分化培养基。向每孔加入 500 μL 冰冷的 1x PBS，置于冰上孵育 3 分钟。
    2. 为确保充分解离细胞外基质（ECM）溶液，使用P1000移液器（设定为450 μL），上下吹打10次以重悬PBS、ECM溶液和类器官；将重悬后的类器官转移至15 mL锥形管中，置于冰上。每种感染条件分别收集于各自的15 mL锥形管中。
      注意：使用 15 mL 离心管比使用 50 mL 离心管或 1.5 mL 离心管可获得更佳、更明显的细胞沉淀。
    3. 更换手套，将试管从细胞培养罩中取出，并清洁试管外表面。
    4. 将样品在500 x g条件下离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。
    5. 将离心管重新放回细胞培养超净台中，用P1000移液器吸去PBS，注意避免重新悬浮管底的类器官沉淀。
    6. 将沉淀重悬于1 mL解离酶（例如TrypLE Express）中。更换手套，清洁管壁，于37 °C孵育样品。
    7. 每10分钟一次，共30分钟，将试管移回细胞培养罩内，用P1000移液器上下吹打10次，重悬类器官。
      注意：通常情况下，三维培养的肠道类器官在感染时需要约30分钟才能形成单细胞悬液。
    8. 为确定类器官是否已解离为单细胞，使用P10移液器吸取10 μL类器官悬液。
    9. 将悬液置于一次性塑料细胞计数板中。用透明胶带封住样品加样口。
    10. 更换手套并清洁细胞计数器的外表面。使用明场显微镜判断是否已制成单细胞悬液。
    11. 在确认形成单细胞悬液后，加入含10% FBS的DMEM/F12培养基1 mL以终止消化，并用P1000移液器吹打10次。
    12. 更换手套，清洁离心管，将样品在500 x g 4 °C下离心5分钟。
    13. 使用P1000移液器小心吸除上清液/解离酶，避免重新悬浮管底的细胞沉淀。
    14. 将单细胞重悬于含有0.1% BSA的PBS最小体积溶液中。对于肠道类器官，重悬于250 μL溶液中。
    15. 将细胞悬液通过滤器转移至流式管中，以去除任何大块团块，并将含有细胞的流式管置于冰上。
    16. 继续执行步骤 4.6，进行细胞计数和主混合液的制备。
  6. 通过将10 μL细胞悬液加入一次性塑料细胞计数板，测定每微升（μL）的细胞数量。
  7. 在将样本从细胞培养罩中取出之前，需用透明胶带密封样本进样口，因为在此阶段，细胞悬液仍具有感染性。
  8. 更换手套，清洗细胞计数室，并使用明场显微镜计数细胞数量。
  9. 在细胞培养超净台内，根据实验中的样本数量，按照试剂盒说明书，在1.5 mL离心管中配制包含RT试剂、模板转换寡核苷酸（Template Switch Oligo）、还原剂B和RT酶C的主混合液。每个样本分装33.4 μL主混合液至PCR管中，置于冰上保存。
  10. 根据制造商说明书中的目标细胞数量，将细胞和水加入主混合液中。
    注意：通常可回收50%–60%的细胞（即，当在芯片上加载10,000个细胞时，有5,000–6,000个细胞可用于分析）。因此，始终加载10,000个细胞。如果细胞密度无法满足此要求，可将细胞离心后重悬于较小体积中。 注意不要过载芯片，否则会导致芯片堵塞。此外，如果细胞未充分解离，将增加每个磁珠结合多个细胞的风险，这些情况需在后续的生物信息学分析中予以剔除。
  11. 更换手套，将单细胞控制器移入细胞培养罩内，并准备芯片，因为芯片仅覆盖有未密封的垫圈。
    注意：仪器必须置于生物安全柜内，以防止接触感染性细胞悬液及潜在气溶胶。
  12. 将单细胞芯片加入芯片架中，并用50%甘油填充未使用的泳道。
  13. 根据制造商说明书，将主混合液、磁珠和分区油加入用于样品的泳道中。
  14. 用垫圈盖住芯片，将芯片装入控制器，然后启动程序。
    注意：建议仅使用八条泳道中的六条。第一和第八泳道常出现乳化异常问题。该公司声称所有泳道相互独立，不应出现此类问题；但若条件允许，应避免使用这两个泳道。若需运行八个样本，可分两次上样，每次运行两块芯片。
  15. 程序结束后，取下芯片和垫圈。
  16. 使用多通道移液器将100 μL乳状液转移至洁净的PCR管中。确保每个孔呈现均匀的白色，表明乳化完全。
  17. 更换手套，清洁离心管，将PCR管转移至可支持100 μL反应的PCR仪中。运行程序：53 °C孵育45分钟；85 °C孵育5分钟。
  18. 反应完成后，将样品置于 4 °C 保存。此时，可按照试剂盒说明书进行后续处理，或在 4 °C 保存 3 天，或在 -20 °C 保存 1 周。
  19. 85 °C孵育5分钟后，大多数包膜病毒将被灭活，随后根据标准操作程序将cDNA从BSL-3实验室移出，并在BSL-1实验室中进行文库制备。
    注意：本实验需进行三次生物学重复（例如，在三个不同的日期进行），因为每次实验中各细胞类型的分化程度可能存在轻微差异。最终得到的测序文库可使用不同的索引进行标记，并在一次测序运行中合并测序。

结果

用于单细胞测序的类器官制备
单细胞测序的结果高度依赖于高质量的细胞。为确保类器官的质量，应每天对其进行适当的维护和观察，以确定其何时达到需要传代的阶段（图2）。类器官的传代时间因供体而异：某些供体生长较快，需每5天传代一次；而另一些生长较慢，需每10天传代一次。通常情况下，当类器官中心变暗时，平均每周传代一次（图2B）。如果任由类器官过度生长，中心积聚过多死亡细胞，则会导致类器官死亡。

类器官在含有高浓度 Wnt3A 的培养基中维持培养。这有助于维持干细胞微环境，并促进类器官持续生长和增殖。在此类生长条件下，类器官中含有大量干细胞和过渡扩增细胞，而分化细胞群体（如成熟的肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞）的比例较低。然而，为了模拟人类肠道内存在的细胞复杂性，必须促进细胞分化，以产生更多上述分化细胞类型。这可通过改变培养基条件实现，包括去除 Wnt3A，并降低 R-Spondin 和 Noggin 的浓度（表 1）。通常，细胞向肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞的分化需要在分化培养基中培养 4 天（图 3）。获得良好的分化效果至关重要；否则，将难以评估病原体的细胞嗜性及特定细胞类型的反应。

BSL-3 病原体灭活的确认
必须使用所选病原体确认完全灭活，并验证从 BSL-3 实验室移出 cDNA 的安全性。对于 SARS-CoV-2，通过取 100 μL 的 SARS-CoV-2 在 PCR 仪中于 85 °C 孵育 5 分钟来验证病毒的完全灭活。随后将该处理后的病毒重新加入 naive Vero 细胞中，并在感染后 24 小时、48 小时和 72 小时通过免疫荧光和空斑实验，与未经热处理的病毒进行比较，以确认所有病毒颗粒均不再具有感染性。这些结果提交至当地监管机构，经其批准后，方可开展单细胞实验及 cDNA 处理。

单细胞测序结果
为了评估 SARS-CoV-2 如何感染人结肠和回肠类器官，进行了单细胞测序。类器官按上述方法制备，并以二维形式进行感染，以允许 SARS-CoV-2 从顶侧感染。在感染后 12 小时和 24 小时收集感染细胞，并按上述方法进行单细胞测序处理。对单细胞测序数据的分析使我们确定，仅有人肠道上皮细胞中的一个亚群（未成熟肠上皮细胞 2）支持 SARS-CoV-2 的感染（图 4）。此外，由于并非群体中的所有细胞都被感染，因此同时分析了被感染细胞和未感染的旁观者细胞（图 5）。这些结果表明，SARS-CoV-2 在被感染细胞中诱导了促炎性信号级联反应，而未感染的旁观者细胞则表现出干扰素介导的免疫反应。此外，单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）显示，由于病毒对信号通路的阻断，被感染细胞无法感知干扰素（图 5）。此类信息无法通过批量 RNA 测序获得。

细胞感染示意图；二维/三维方法，顶面/基底面，t-SNE 图谱分析。
图 1：示意图展示三种不同的人肠道类器官制备方法，用于肠道病原体感染研究。 通过将肠道类器官以二维形式接种，可实现顶面感染。通过破坏三维类器官结构，可进行顶面与基底面同时感染。最后，通过感染完整的三维肠道类器官，可实现仅限基底面的感染。上述每种方法均可用于制备单细胞测序所需的样本。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞培养示意图及显微镜图像，显示时间线：传代、换液；第1-7天。
图2：类器官维持示意图及代表性明场图像。 （A）人肠道类器官的维持与传代示意图。（B）传代后第1、3、5和7天的代表性明场图像。至第7天，由于死细胞积聚，类器官变得较大且较暗，可进行传代。比例尺表示25 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达比较；点图；干细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠上皮细胞；相对于HPRT1；分析。
图3：人肠道类器官在转换至分化培养基后第4天的代表性qPCR结果。 肠道类器官维持在生长培养基中，或转换至分化培养基中培养4天。收集RNA并进行qPCR检测，分析干细胞标志物（OLFM4）、潘氏细胞标志物（LYZ）、杯状细胞标志物（MUC2）以及肠上皮细胞标志物（SI）的表达。N = 5。请点击此处查看该图的放大版本。

SARS-CoV-2在结肠和回肠细胞中表达的UMAP图；细胞感染比例的柱状图。
图4：SARS-CoV-2感染的细胞群体鉴定。 人结肠和回肠来源的类器官被SARS-CoV-2感染。感染后12小时和24小时收集细胞，并进行单细胞RNA测序，以确定支持SARS-CoV-2感染的细胞群体。结果显示病毒感染随时间增加，主要感染未成熟肠上皮细胞2型。本图经修改自Triana等19。请点击此处查看该图的高清版本。

结肠基因表达分析；图表 A-C：log2 倍数变化 vs p 值；D-E：表达点图。
图 5：固有先天免疫反应的确定。 人结肠来源类器官感染 SARS-CoV-2 后，在感染后 12 小时和 24 小时收集细胞，并进行单细胞 RNA 测序，以分析病毒直接感染细胞及未感染的旁观者细胞中的固有先天免疫反应。SARS-CoV-2 感染的细胞表现出强烈的促炎反应，而未感染的旁观者细胞则表现出干扰素介导的反应。该图经 Triana 等人19 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

生长培养基
成分终浓度
Ad DMEM/F12GlutaMAX (1X)
+GlutaMAXHEPES 1 mM
+HEPESPen 10 U/mL
+P/SStrep 10 µg/mL
L-WRN50% by volume
B2701:50
N-acetyl-cysteine1 mM
EGF50 ng/mL
A83-01500 nM
IGF-1100 ng/mL
FGF basic50 ng/mL
Gastrin10 mM
分化培养基
成分终浓度
Ad DMEM/F12GlutaMAX (1x)
+GlutaMAXHEPES 1 mM
+HEPESPen 10 U/mL
+P/SStrep 10 µg/mL
B2701:50
N-acetyl-cysteine1 mM
R-spondin5% by volume
Noggin50 ng/mL
EGF50 ng/mL
Gastrin10 mM
A83-01500 nM

表1：生长与分化培养基的培养基成分。

讨论

肠道病原体通常通过感染肠上皮细胞的顶膜（面向肠腔的一侧）来启动其生命周期。尽管类器官被公认为是重现肠上皮细胞复杂性和组织结构的良好模型，但其三维闭合结构使得病原体无法接触到顶膜。本方案描述了从顶膜、基底外侧膜或双侧感染肠道类器官的方法，适用于生物安全三级（BLS-3）病原体。通过遵循下文强调的几个关键步骤，这些方案可轻松适用于在生物安全二级（BSL-2）或生物安全三级（BLS-3）条件下研究任何肠道病原体，或应用于其他类器官模型。上述方法适用于根据德国法规进行单细胞液滴的分离与制备。需要声明的是，本方案未涉及在BLS-3条件下操作所需的生物安全处理措施（标准操作程序）。同时必须强调，不同国家的法规可能存在差异，应联系当地主管部门以确保遵守所有本地规定。

将类器官以二维方式接种用于顶膜感染时，一个关键步骤是确保细胞的分化程度与经典三维类器官生长时相似。根据不同的肠道病原体，其嗜性可能仅限于极少数细胞，或需要高度分化的细胞。在此情况下，若使用未充分分化的二维类器官，可能导致错误结论，即该肠道病原体无法感染肠类器官。建议在条件允许时，采用本方案中的三种配置进行感染实验：仅用于顶膜感染的二维类器官（第2节）、裂开的三维类器官用于顶膜和基底外侧膜感染（第3节），以及仅用于基底外侧膜感染的完整三维类器官（第3节）。该策略有助于明确病原体的入侵途径（顶膜 vs. 基底外侧膜），并可对照验证各组类器官达到相似的分化水平。二维顶膜感染的另一种替代方法是显微注射，该方法使用三维类器官，但将病原体直接递送至顶膜侧（详见 Bartfeld 等27 的研究）。此技术需要熟练的操作人员，以确保病原体准确递送且类器官保持完整。显微注射通常在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，可能不适用于生物安全三级（BSL-3）条件。

在二维培养的类器官中进行感染实验时，另一个重要的考虑因素是最终的细胞密度。如步骤2.3所述，将在一个48孔板或一个8孔玻璃底培养板的单孔中接种100-150个类器官。根据类器官细胞系以及操作人员的不同，这些类器官的大小可能存在显著差异，从而导致在48孔板或8孔玻璃底培养板中的细胞密度差异较大。对于不同的肠道病毒，有些病毒更倾向于感染稀疏分布的细胞，而另一些则也能有效感染汇合状态的细胞。目前尚不清楚不同细胞汇合度下病毒易感性差异的分子机制；因此，在开展后续深入表征实验之前，应首先通过预实验确定目标肠道病原体感染的最佳细胞密度。

在进行单细胞液滴乳化之前，通常需要先进行流式细胞分选（FACS）。该步骤常用于区分活细胞与死细胞，以及单细胞与双联体细胞。当处理生物安全等级3级（BSL-3）病原体时，要求实验设施配备相应的FACS分选仪，但这种情况并不常见。此外，类器官中的细胞并非大小均一，因此常常难以区分双联体细胞与体积较大的单个细胞，从而可能导致特定细胞类型被错误地排除。同时，领域内仍在讨论对每个样本分选5,000至10,000个细胞所需的时间是否会导致单个细胞转录谱发生显著改变。尽管已有报道适用于单细胞测序的细胞固定方法（如甲醇和RNAassist），但观察发现这些方法会导致测序质量下降。18最后，有观点认为，使用细胞死亡标志物进行细胞分选也可能导致偏差。鉴于细胞沿隐窝-绒毛轴方向进行增殖与分化，处于最高度分化的细胞将被脱落并释放，位于绒毛顶端。这些细胞通常对多种细胞死亡通路的标志物呈阳性（例如., 细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡）；然而，在观察轮状病毒对小鼠肠道的感染时，绒毛顶端是最易感染的区域28因此，若过滤掉可能呈现死亡标志物阳性的细胞，将导致对可能代表生理感染状态的感染细胞进行负向筛选。目前，在类器官进行单细胞测序之前，尚无理想的分选与固定方案。建议使用未经分选的活细胞，因为仍需进一步研究以寻找合适的替代方案。

单细胞测序技术彻底改变了细胞应答的评估方式。该技术能够在基础状态以及病原体感染条件下，识别出细胞谱系特异性的应答。这一方法为许多以往受限于群体细胞检测结果的研究领域打开了新的大门。尽管该技术功能强大，但仍存在一定的局限性。其中一个关键局限在于测序后续所需的大量生物信息学分析工作，尤其是在分析组织样本和鉴定尚无注释信息的细胞类型时尤为突出。因此，开展所有单细胞研究均需要有经验的生物信息学研究人员提供支持。

本方案描述了如何培养和处理人肠道类器官，用肠道病原体感染它们，并进行单细胞RNA测序（scRNAseq）。由于大多数器官均已建立类器官模型系统，该方法现已可推广至其他器官。肺和肝类器官的结构与肠道类器官相似，因此类似的方法可直接适用于这些类器官。关键的对照在于验证：当这些类器官以二维形式培养或被裂开时，其分化程度是否与其三维类器官对应物相当。定义分化状态的具体特征和基因因每种器官模型而异。其他类器官模型，如肾脏和血管类器官，因其为致密的大体积结构，需要额外的方法将其连续解离为单个细胞。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

Megan Stanifer 和 Steeve Boulant 获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的研究资助（项目编号：240245660、278001972、415089553 和 272983813 资助 Steeve Boulant，项目编号 416072091 资助 Megan Stanifer），以及巴登-符腾堡州的资助；Megan Stanifer 还获得了联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）项目 01KI20239B 的资助，Steeve Boulant 获得了项目 01KI20198A 以及 （NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021）的资助。示意图使用 BioRender 绘制。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 重组小鼠nogginPeprotechCat#250-38
[Leu15]-胃泌素ISigma-AldrichCat# G9145
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermo Fischer ScientificCat#25300054
24孔非细胞培养处理板CorningCat#3738
8孔玻璃底培养皿iBIDICart#80827
A83-01TocrisCat#2939
高级DMEM/F12Thermo Fischer ScientificCat# 12634010
B27Thermo Fischer ScientificCat#17504-044
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X GenomicsCat#1000202用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit10X GenomicsCat #1000127用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.110X GenomicsCat#1000268用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备
人胎盘来源胶原蛋白Sigma AldrichCat#C5533-5MG
CYP34A 正向引物EurofinsGATGGCTCTCATCCCAGACTT用于检测分化状态的引物
CYP3A4 反向引物EurofinsAGTCCATGTGAATGGGTTCC用于检测分化状态的引物
DMEM/F12Thermo Fischer ScientificCat#11320074
EDTASigma AldrichCar#E9884
Fast Read 102 细胞计数板BiosigmaCat# BVS100
胎牛血清（FBS）CapricornCat#FBS-12A
GlutaMAXThermo Fischer ScientificCat# 35050061
HEPESThermo Fischer ScientificCat3 15630080
L-WRN细胞ATCCCRL-3276该细胞系用于制备含有Wnt 3A、R-Spondin和Noggin的条件培养基。条件培养基的制备方案可在生产商网站上找到。
Matrigel GFR，无LDEVCorningCat#354230
MUC-2 正向引物EurofinsTGTAGGCATCGCTCTTCTCA用于检测分化状态的引物
MUC-2 反向引物EurofinsGACACCATCTACCTCACCCG用于检测分化状态的引物
N-乙酰半胱氨酸Sigma AldrichCat# A9165
OLMF4 正向引物EurofinsACCTTTCCCGTGGACAGAGT用于检测分化状态的引物
OLMF4 反向引物EurofinsTGGACATATTCCCTCACTTTGGA用于检测分化状态的引物
青霉素/链霉素Thermo Fischer ScientificCat#15140122
重组人碱性FGFPeprotechCat#100-18B
重组人IGF-1BioLegendCat#590904
重组小鼠EGFThermo Fischer ScientificCat# PMG8043
SI 正向引物EurofinsAATCCTTTTGGCATCCAGATT用于检测分化状态的引物
SI 反向引物EurofinsGCAGCCAAGAATCCCAAT用于检测分化状态的引物
TrypLE ExpressThermo Fischer ScientificCat#12605036
Y-27632Caymann ChemicalsCat#10005583

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在生物安全三级（BSL-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型
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