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方法文章

24 小时内利用无细胞自动诱导工作流程从细胞到无细胞蛋白质合成

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DOI：

10.3791/62866

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2021年7月22日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

本文内容

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摘要

本研究描述了在24小时内完成大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）细胞提取物的制备及无细胞蛋白合成（CFPS）反应的过程。文中详细阐述了无细胞自动诱导（CFAI）方案的改进之处，旨在减少研究人员的干预，并提高所获得细胞提取物的产量。

摘要

无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一种生物技术平台，已能够体外捕获转录和翻译机制。in vitro。近年来的诸多进展使CFPS平台对新用户更加友好，并拓展了其应用范围。对于基于裂解液的CFPS系统，细胞提取物可来源于多种生物体，利用宿主特有的生物化学特性来增强蛋白质合成。在过去20年中，Escherichia coli（E. coli）因其成本低廉且用途广泛，已成为支持CFPS最常用的生物体之一。尽管已有诸多关键进展，E. coli细胞提取物制备的工作流程仍是新用户应用CFPS的主要瓶颈。提取物制备过程耗时较长，且需要专业技术才能获得可重复的结果。为克服这些障碍，我们此前报道了一种24小时无细胞自诱导（CFAI）工作流程，可减少用户操作和所需的技术经验。CFAI工作流程在降低制备细胞提取物所需人力和技术要求的同时，也提高了所获得细胞提取物的总量。本文将逐步描述该工作流程，以促进更广泛地获取并推动基于E. coli的CFPS的广泛应用。

引言

近年来，无细胞蛋白合成（CFPS）在生物技术应用中的使用已显著增长1,2,3。这一发展部分归因于人们对CFPS中发生的各种过程及其各组分作用的理解不断深入4,5。此外，由于系统优化和替代能源的使用降低了成本，使得新用户更容易实施无细胞技术6,7,8,9 。为了实现蛋白合成所需的转录和翻译因子，通常使用细胞提取物来驱动无细胞反应10。最近发布的用户指南提供了制备功能性提取物的简单方案，使新用户和有经验的用户都能更方便地实施该技术1,11,12,13,14。细胞提取物通常通过裂解细胞培养物获得，而细胞培养物可根据具体应用需求选用不同生物体进行培养1,15,16。

Escherichia coli（E. coli）已迅速成为用于制备功能性提取物的最常用宿主生物之一17。BL21 Star (DE3) 菌株是首选，因为它缺失了外膜中的蛋白酶（OmpT 蛋白酶）和细胞质中的蛋白酶（Lon 蛋白酶），为重组蛋白表达提供了最佳环境。此外，DE3 含有 λDE3 噬菌体，其携带在 lacUV5 启动子控制下的 T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）基因；Star 组分包含一个突变的 RNaseE 基因，可防止 mRNA 的降解4,14,18,19。在 lacUV5 启动子调控下，异丙基-硫代半乳糖吡喃苷（IPTG）诱导可实现 T7 RNAP 的表达20,21。这些菌株用于培养和收获细胞，以获得提取物制备所需的原始材料。细胞裂解可通过多种方法进行，包括珠磨法、French 压力法、均质化、超声处理以及氮气空化法1,11,12,22。

细菌培养与收获的过程在使用大多数平台时具有一致性 大肠杆菌， 但需要多天时间并要求研究人员进行严密监督1,11,13该过程通常从LB肉汤中的过夜种子培养开始，经过过夜培养后，于次日接种至较大体积的2xYTPG（酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸盐缓冲液、葡萄糖）培养基中。持续监测该大体积培养物的生长情况，直至其达到对数生长早期至中期，光密度（OD）为2.5。14,20需要持续进行测量，因为已有研究证实，转录和翻译相关组分在对数生长早期至中期具有很高的活性。23,24尽管该过程能够制备出可重复的提取物，但本实验室近期开发了一种新方法，即使用无细胞自动诱导（CFAI）培养基，该方法可减少研究人员的干预，提高每升细胞培养物的总体提取物产量，并改善获取效率 E. coli基于提取物制备的方法，适用于有经验及新用户（图1）本文提供了实施CFAI工作流程的逐步指南，可在24小时内从细胞划线平板完成至CFPS反应。

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方案

1. 培养基培养

  1. 按照表1所述配制960 mL CFAI培养基，并用KOH调节pH至7.2。
  2. 将培养基转移至2.5 L带挡板的锥形瓶中，在121 °C下高压灭菌30分钟。
  3. 按照表1所述配制40 mL糖溶液。通过过滤除菌将溶液转入另一个已灭菌的玻璃容器中。
    注意：糖溶液可存放于30 °C培养箱中，待后续使用。
  4. 高压灭菌后，让培养基完全冷却至40 °C以下。
  5. 在接种CFAI培养基前，将糖溶液直接加入CFAI培养基中。
  6. 接种时，用接种环蘸取先前划线的E. coli BL21 Star (DE3) 平板上的单菌落，直接接入培养基中。轻轻旋转接种环使菌体混入培养基，避免接触容器壁。确保划线平板新鲜，菌体具有活性。
  7. 将接种后的培养基置于30 °C培养箱中，以200 rpm振荡培养过夜。若在晚间接种，次日早晨菌液在600 nm处测得的光密度（OD600）约为10。可根据需要调整接种和收获时间。

2. 细胞收获

  1. 提前配制 S30 缓冲液并保持低温。按照以下配方配制 S30 缓冲液： 表2，调至终pH为8.2。
    注意：S30 缓冲液可在细胞收获前数天配制。若提前配制，请勿加入二硫苏糖醇，于 4 °C 保存。使用前再加入二硫苏糖醇。
  2. 从此时起，将所有溶液和材料置于冰上。取1 L培养基转移至1 L离心瓶中，在5,000 ×g下离心 x g 4–10 °C 下离心 10 分钟。倾去并弃除上清液。使用无菌刮勺将沉淀转移至预冷并预先称重的 50 mL 锥形管中。
  3. 用30–40 mL冷的S30缓冲液重悬沉淀，洗涤一次 通过 以30秒为一轮涡旋振荡，期间在冰上休息。
    注意：由于沉淀体积较大，将细胞沉淀分装至两个50 mL锥形管中，有助于洗涤步骤的操作。将细胞以较小体积分装保存也可为后续处理提供便利。
  4. 将细胞重悬液在5000离心 x g 4-10 °C 下孵育 10 分钟。
  5. 弃去上清液，用干净的纸巾擦拭50 mL离心管内壁的残留液体，注意避免触碰沉淀。称重后将沉淀在液氮中速冻，于-80 °C保存备用。
    ​注意：如果用户计划继续进行提取制备实验方案，则沉淀物可能无需进行速冻。

3. 提取物制备

  1. 将每1 g细胞沉淀与1 mL S30缓冲液混合，置于冰上解冻约30–60分钟。通过涡旋振荡（每次30秒，间隔冰上静置）重悬解冻后的沉淀，直至无可见细胞团块残留。
    注意：较小的团块可通过移液混合进行重悬。
  2. 将1.4 mL细胞重悬液分装至1.5 mL微量离心管中用于细胞裂解。将各管置于冰浴中，使用20 kHz频率、50%振幅超声处理，每次超声45秒，每轮间隔59秒休息，共进行三轮。每轮之间颠倒混匀管内液体，并在最后一次超声后立即加入4.5 µL的1 M二硫苏糖醇（dithiothreitol）。
    注意：由于超声过程中会产生热量，因此在未进行超声时必须确保所有样品始终置于冰上。冰浴应持续补充或足够大，以在整个超声过程中保持低温。
  3. 将各管在18,000 x g、4 °C条件下离心10分钟。收集上清液，并以每管600 µL分装至1.5 mL微量离心管中。迅速冷冻分装样品并储存在-80 °C，直至后续使用。吸取时应注意仅取上清液部分。

4. 无细胞蛋白质合成

  1. 从上一步骤中取出一份提取物，在1.5 mL离心管中进行四次重复的15 µL无细胞蛋白合成反应，将其解冻。
  2. 每个反应体系包含240 ng DNA（终浓度为16 µg/mL）、2.20 µL溶液A、2.10 µL溶液B、5.0 µL提取物，以及适量的分子生物学级水补足至15 µL。该反应体系可按比例放大。比例详见表3。
    1. 根据表4配制溶液A和溶液B。每种溶液可按100 µL至1 mL的批量配制，分装后于-80 °C保存，以备后续使用。
      注意：DNA用量可根据目标蛋白的不同而调整。本实验所用质粒pJL1-sfGFP已优化至在16 µg/mL（即597 µM）浓度下表现最佳。
  3. 将反应体系在37 °C下孵育至少4小时。

5. 报告蛋白（超折叠绿色荧光蛋白，sfGFP）的定量分析

  1. 使用半面积96孔黑色聚苯乙烯板，将每种无细胞蛋白合成反应产物各2 µL与48 µL pH 7.2的0.05 M HEPES缓冲液混合。建议每种反应管设置三到四个重复。
  2. 采用485 nm激发波长和528 nm发射波长测定sfGFP的荧光强度。
  3. 为将相对荧光单位转换为sfGFP的体积产率（µg/mL），需使用纯化的pJL1-sfGFP建立标准曲线。

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结果

在配制CFAI培养基时，将葡萄糖替换为增加的乳糖和甘油作为培养基中的主要能量来源。此外，CFAI培养基的缓冲能力也得到了增强。这些特定成分见表1。

细胞随后培养至OD600 为10和CFAI培养基中的标准2.5，以证明尽管提取物用量不同，但提取质量具有一致性。2.5 OD600 CFAI 培养基在接种 LB 肉汤中的种子培养物后进行培养 37 °C，200 rpm，同时测量OD600 从平板直接接种10代培养物. 每批CFAI培养基均在各自的OD下进行监测并收获600生长至 OD600 10 的培养导致细胞沉淀量和总提取物量增加，获得的提取物体积为 9.60 mL，而 OD 值培养至 2.5 时仅获得 2.10 mL 提取物600 (图2）。总蛋白浓度的进一步分析表明，各提取物中的总蛋白含量无显著差异（表5

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讨论

在细胞培养过程中，传统上需要研究人员进行两项关键操作：T7 RNA聚合酶的诱导以及在特定OD600值时收获细胞。CFAI技术消除了这两项要求，从而减少了制备高质量细胞提取物所需的研究人员时间和技术培训。通过在培养基中用乳糖替代葡萄糖作为主要碳源，可实现T7 RNA聚合酶的自动诱导，不再需要人工监测细胞生长并在特定时间点加入IPTG 进行诱导。同时，也无需再持续监测细胞培养物以在特定OD600 值时收获细胞，使研究人员摆脱了对细胞培养过程的实时依赖。这一点进一步支持了近期已有研究证明的、在非传统时间收获仍可获得高质量提取物的可行性13,25,26。新型培养基配方优化了缓冲能力和碳源组成，即使在细胞培养接近稳定期时，仍可维持活跃的能量代谢。从高OD600培养物中获得高活性细胞提取物的能力，使研究人员可根据自身安排灵活选择收获时间27

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Jennifer VanderKelen 博士和 Andrea Laubscher 提供的技术支持。作者还感谢 Nicole Gregorio、Max Levine、Alissa Mullin、Byungcheol So、August Brookwell、Elizabeth (Lizzy) Vojvoda、Logan Burrington 和 Jillian Kasman 提出的有益讨论。作者同时感谢比尔和琳达·弗罗斯特基金、加州理工学院应用生物技术中心雪佛龙生物技术应用研究捐赠基金、加州理工学院研究与学术基金以及美国国家科学基金会（NSF-1708919）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管PhenixMPC-425Q
1L 离心管Beckman CoulterA99028
Avanti J-E 离心机Beckman Coulter369001
辅酶 A（CoA）Sigma-AldrichC3144-25MG
Cytation 5 细胞成像多功能读板仪BiotekBTCYT5F
D-葡萄糖FisherD16-3
D-乳糖Alfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
亚叶酸Sigma-AldrichF7878-100MG
甘油FisherBP229-1
甘氨酸Sigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 转子Beckman Coulter366754
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-丙氨酸Sigma-AldrichA7627-100G
L-精氨酸Sigma-AldrichA8094-25G
L-天冬酰胺Sigma-AldrichA0884-25G
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA7219-100G
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352-25G
L-谷氨酸Sigma-AldrichG1501-500G
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG3126-250G
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000-25G
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI2752-25G
L-亮氨酸Sigma-AldrichL8000-25G
L-赖氨酸Sigma-AldrichL5501-25G
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM9625-25G
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP2126-100G
L-脯氨酸Sigma-AldrichP0380-100G
L-丝氨酸Sigma-AldrichS4500-100G
L-苏氨酸Sigma-AldrichT8625-25G
L-色氨酸Sigma-AldrichT0254-25G
L-酪氨酸Sigma-AldrichT3754-100G
LB 培养基（Luria Broth）ThermoFisher12795027
L-缬氨酸Sigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)₂Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)₂Sigma-AldrichM5661-250G
Microfuge 20 微型离心机Beckman CoulterB30134
分子生物学级水Sigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R 恒温摇床EppendorfM1335-0000
NH₄(Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
草酸Sigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
磷酸氢二钾Acros, OrganicsA0382124
磷酸二氢钾Acros, OrganicsA0379904
PureLink HiPure 质粒提取试剂盒ThermoFisherK210007
腐胺Sigma-AldrichD13208-25G
亚精胺Sigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
胰蛋白胨Fisher Bioreagents73049-73-7
Tunair 2.5L 带挡板摇瓶Sigma-AldrichZ710822
超声波处理器QSonicaQ125-230V/50HZ
酵母提取物Fisher Bioreagents1/2/8013

参考文献

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

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勘误


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

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