本研究描述了在24小时内完成大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）细胞提取物的制备及无细胞蛋白合成（CFPS）反应的过程。文中详细阐述了无细胞自动诱导（CFAI）方案的改进之处，旨在减少研究人员的干预，并提高所获得细胞提取物的产量。
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摘要
摘要
无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一种生物技术平台，已能够体外捕获转录和翻译机制。in vitro。近年来的诸多进展使CFPS平台对新用户更加友好，并拓展了其应用范围。对于基于裂解液的CFPS系统，细胞提取物可来源于多种生物体，利用宿主特有的生物化学特性来增强蛋白质合成。在过去20年中，Escherichia coli（E. coli）因其成本低廉且用途广泛，已成为支持CFPS最常用的生物体之一。尽管已有诸多关键进展，E. coli细胞提取物制备的工作流程仍是新用户应用CFPS的主要瓶颈。提取物制备过程耗时较长，且需要专业技术才能获得可重复的结果。为克服这些障碍，我们此前报道了一种24小时无细胞自诱导（CFAI）工作流程，可减少用户操作和所需的技术经验。CFAI工作流程在降低制备细胞提取物所需人力和技术要求的同时，也提高了所获得细胞提取物的总量。本文将逐步描述该工作流程，以促进更广泛地获取并推动基于E. coli的CFPS的广泛应用。
引言
近年来，无细胞蛋白合成（CFPS）在生物技术应用中的使用已显著增长1,2,3。这一发展部分归因于人们对CFPS中发生的各种过程及其各组分作用的理解不断深入4,5。此外，由于系统优化和替代能源的使用降低了成本，使得新用户更容易实施无细胞技术6,7,8,9 。为了实现蛋白合成所需的转录和翻译因子，通常使用细胞提取物来驱动无细胞反应10。最近发布的用户指南提供了制备功能性提取物的简单方案，使新用户和有经验的用户都能更方便地实施该技术1,11,12,13,
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方案
1. 培养基培养
- 按照表1所述配制960 mL CFAI培养基，并用KOH调节pH至7.2。
- 将培养基转移至2.5 L带挡板的锥形瓶中，在121 °C下高压灭菌30分钟。
- 按照表1所述配制40 mL糖溶液。通过过滤除菌将溶液转入另一个已灭菌的玻璃容器中。
注意：糖溶液可存放于30 °C培养箱中，待后续使用。 - 高压灭菌后，让培养基完全冷却至40 °C以下。
- 在接种CFAI培养基前，将糖溶液直接加入CFAI培养基中。
- 接种时，用接种环蘸取先前划线的E. coli BL21 Star (DE3) 平板上的单菌落，直接接入培养基中。轻轻旋转接种环使菌体混入培养基，避免接触容器壁。确保划线平板新鲜，菌体具有活性。
- 将接种后的培养基置于30 °C培养箱中，以200 rpm振荡培养过夜。若在晚间接种，次日早晨菌液在600 nm处测得的光密度（OD600）约为10。可根据需要调整接种和收获时间。
2. 细胞收获
- 提前配制 S30 缓冲液并保持低温。按照以下配方配制 S30 缓冲液： 表2，调至终pH为8.2。
注意：S30 缓冲液可在细胞收获前数....
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结果
在配制CFAI培养基时，将葡萄糖替换为增加的乳糖和甘油作为培养基中的主要能量来源。此外，CFAI培养基的缓冲能力也得到了增强。这些特定成分见表1。
细胞随后培养至OD600 为10和CFAI培养基中的标准2.5，以证明尽管提取物用量不同，但提取质量具有一致性。2.5 OD600 CFAI 培养基在接种 LB 肉汤中的种子培养物后进行培养 37 °C，200 rpm，同时测量OD600 从平板直接接种10代培养物. 每批CFAI培养基均在各自的OD下进行监测并收获600生长至 OD600 10 的培养导致细胞沉淀量和总提取物量增加，获得的提取物体积为 9.60 mL，而 OD 值培养至 2.5 时仅获得 2.10 mL 提取物600 (图2）。总蛋白浓度的进一步分析表明，各提取物中的总蛋白含量无显著差异（表5
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讨论
在细胞培养过程中，传统上需要研究人员进行两项关键操作：T7 RNA聚合酶的诱导以及在特定OD600值时收获细胞。CFAI技术消除了这两项要求，从而减少了制备高质量细胞提取物所需的研究人员时间和技术培训。通过在培养基中用乳糖替代葡萄糖作为主要碳源，可实现T7 RNA聚合酶的自动诱导，不再需要人工监测细胞生长并在特定时间点加入IPTG 进行诱导。同时，也无需再持续监测细胞培养物以在特定OD600 值时收获细胞，使研究人员摆脱了对细胞培养过程的实时依赖。这一点进一步支持了近期已有研究证明的、在非传统时间收获仍可获得高质量提取物的可行性13,25,26。新型培养基配方优化了缓冲能力和碳源组成，即使在细胞培养接近稳定期时，仍可维持活跃的能量代谢。从高OD600培养物中获得高活性细胞提取物的能力，使研究人员可根据自身安排灵活选择收获时间27
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Jennifer VanderKelen 博士和 Andrea Laubscher 提供的技术支持。作者还感谢 Nicole Gregorio、Max Levine、Alissa Mullin、Byungcheol So、August Brookwell、Elizabeth (Lizzy) Vojvoda、Logan Burrington 和 Jillian Kasman 提出的有益讨论。作者同时感谢比尔和琳达·弗罗斯特基金、加州理工学院应用生物技术中心雪佛龙生物技术应用研究捐赠基金、加州理工学院研究与学术基金以及美国国家科学基金会（NSF-1708919）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L 离心管 | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E 离心机 | Beckman Coulter | 369001 | |
| 辅酶 A（CoA） | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 细胞成像多功能读板仪 | Biotek | BTCYT5F | |
| D-葡萄糖 | Fisher | D16-3 | |
| D-乳糖 | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| 亚叶酸 | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| 甘油 | Fisher | BP229-1 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 转子 | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-丙氨酸 | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-精氨酸 | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-组氨酸 | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-异亮氨酸 | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-苯丙氨酸 | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-丝氨酸 | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-苏氨酸 | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-色氨酸 | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-酪氨酸 | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| LB 培养基（Luria Broth） | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-缬氨酸 | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)₂ | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)₂ | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 微型离心机 | Beckman Coulter | B30134 | |
| 分子生物学级水 | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R 恒温摇床 | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH₄(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| 草酸 | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| 磷酸氢二钾 | Acros, Organics | A0382124 | |
| 磷酸二氢钾 | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure 质粒提取试剂盒 | ThermoFisher | K210007 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| 胰蛋白胨 | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L 带挡板摇瓶 | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| 超声波处理器 | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| 酵母提取物 | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
参考文献
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics.....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
