小鼠硬脑膜刺激联合眶周 von Frey 测试作为头痛的临床前模型

摘要

偏头痛最显著的症状是严重的头痛，据推测这是由支配脑膜的感觉神经元介导的。本文介绍一种在最小侵入条件下局部向硬脑膜施加物质的方法，并以面部痛觉过敏作为检测指标。

摘要

硬脑膜、蛛网膜和软脑膜组成的颅脑脑膜被认为主要为神经系统提供结构支持功能。例如，它们可保护大脑免受颅骨的直接压迫，并固定和组织皮层的血管与神经供应。然而，脑膜也参与多种神经系统疾病的发生过程，例如偏头痛：偏头痛发作时的疼痛被认为源于局部无菌性炎症以及继发的局部伤害性传入神经元的激活。在脑膜各层中，硬脑膜在偏头痛的病理生理过程中尤为关键。硬脑膜具有丰富的血管分布，含有局部的伤害性感觉神经元，并驻留着多种多样的细胞类型，如免疫细胞。脑膜局部微环境的细微变化可能导致硬膜周围血管伤害性感受器的激活和致敏，从而引发偏头痛疼痛。已有研究尝试通过在体电生理记录、成像技术或行为学模型来探讨硬脑膜传入神经如何被激活或致敏，但这些方法通常需要高度侵入性的手术操作。本实验方案介绍了一种相对非侵入性地向小鼠硬脑膜施加化合物的方法，以及在硬脑膜刺激后通过眶周von Frey测试评估类头痛性触觉敏感性的适宜方法。该方法通过在未完全闭合的矢状缝与人字缝交界处插入一根改良的0.65 mm导管注射物质，从而保持硬脑膜和颅骨的完整性，减少侵入性技术带来的干扰因素。这一临床前模型将使研究人员能够在不造成颅骨和脑膜损伤的前提下，广泛探究多种硬脑膜刺激因素在偏头痛病理进展中的作用，包括伤害性感受器激活、免疫细胞活化、血管变化以及疼痛相关行为等。

引言

偏头痛疼痛仍是全球主要的公共卫生问题。世界卫生组织将其列为全球第六大常见疾病，影响着全球近15%的人口¹，并给社会带来重大的社会经济负担^2,3。目前的治疗选择及其疗效仍不理想，仅能缓解症状，而无法显著改变偏头痛发作背后的病理生理过程^4,5。治疗效果不佳的原因可能在于偏头痛是一种多因素障碍，其病理机制尚未被充分理解，导致可用的治疗靶点有限。偏头痛在动物模型中也难以全面模拟，尤其是因为偏头痛的诊断依赖于与患者的语言交流，患者需描述其经历的偏头痛典型特征，如先兆、头痛、畏光和异常性疼痛。尽管如此，值得注意的是，近年来偏头痛治疗方面取得的进展，目前在疗效上已超过许多虽经临床前模型充分验证但治疗效果仍有限的神经系统疾病。例如，靶向降钙素基因相关肽（CGRP）或其受体的单克隆抗体和小分子药物在改善偏头痛患者生活质量方面已取得显著成功，并有望彻底改变偏头痛的临床管理方式。尽管对该疾病的理解已有进展，但仍有许多机制尚待阐明。

根据临床前动物模型和人类研究，目前普遍认为偏头痛是由脑膜内伤害性纤维异常激活所引发，这些纤维通过三叉神经和上颈段背根神经节传递信号^6,7,8,9,10。尽管如此，许多研究仍采用系统性给药方式来探究偏头痛的潜在致病机制。虽然系统性药物干预显著加深了我们对该疾病的理解，但这些结果并不能直接评估靶组织局部作用是否在偏头痛中发挥作用。相反，已有若干研究尝试直接刺激硬脑膜；然而，这类实验需通过侵入性开颅手术植入导管，并伴随较长的术后恢复时间^11,12。由于上述局限性，我们开发了一种微创方法，可在无需开颅的情况下对硬脑膜进行局部刺激，从而消除术后恢复期，实现在清醒动物中立即开展测试^12,13,14。该注射操作在小鼠矢状缝与人字缝交界处进行，期间使用轻度异氟烷麻醉。

已开发出多种方法用于评估啮齿类动物的伤害性行为反应¹⁵。据报道，约80%的偏头痛患者存在皮肤触诱发痛^16,17，这一现象可作为在啮齿类动物中应用的潜在转化终点指标。在临床前模型中，已采用von Frey纤维丝刺激啮齿类动物足底区域，以评估偏头痛临床前模型中的疼痛行为。该方法的主要局限性在于其并未检测头面部区域。面部表情评分法通过分析疼痛刺激诱导后的面部表情变化，已被用于捕捉啮齿类动物的疼痛行为^18,19。然而，其局限性包括仅能捕捉对急性刺激的反应，而无法反映慢性口面部疼痛状态。面部理毛行为和直立行为减少也被视为偏头痛临床前模型中行为反应的输出指标^20,21。前者的局限性包括难以区分疼痛反应与正常的日常理毛行为以及其他感觉（如瘙痒）；而后者的局限性在于，啮齿类动物进入新环境后，直立行为通常会迅速减少。尽管上述每种行为终点指标在理解参与疼痛状态的各种机制方面均具有重要价值，但目前迫切需要在偏头痛等疼痛障碍的临床前模型中纳入能够特异性捕捉头面部敏感性反应的终点指标。通过硬脑膜刺激后评估眼周皮肤的触觉过敏，是一种可能更深入揭示以头面部感觉症状为主的偏头痛相关机制的方法。本文中，我们描述了一种将物质施加于小鼠硬脑膜的方法，作为偏头痛的临床前模型。在硬脑膜给药后，我们还介绍了一种使用校准后的von Frey纤维丝，按照Dixon上下法施加刺激，以详细检测眼周触觉过敏的实验方法。

方案

所有实验程序均事先获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用了6至8周龄、体重30-35 g的ICR（CD-1）小鼠和体重25-30 g的C57/BL6小鼠。

1. 硬脑膜输注器

1. 通过改造市售的单侧注射用内插管和注射器，使用可调节的非金属熔融石英塑料帽，制备小鼠注射装置/注射器，该塑料帽可插入并延伸至内径（I.D.）为0.18 mm、外径（O.D.）为0.35 mm的28 G引导套管下方（图1A）。
2. 使用卡尺或其他测量工具将注射器上的熔融石英塑料帽调节至0.6 mm的长度；该长度从注射器尖端测量至石英塑料帽边缘。
   1. 调节塑料帽时需小心，避免弯曲或钝化注射器尖端。
   2. 对于此前未用于硬脑膜注射的小鼠品系，可通过将注射器长度设为0.6 mm并使用墨水或染料进行预实验注射，确定最佳注射器长度；逐步调整注射器长度，直至观察到染料仅位于硬脑膜内，而未出现在脑组织或颅骨上。
3. 将已调节好的注射器较长一端（即未测量为0.6 mm的一端）连接至塑料管路（泵用管路，双止口，内径0.19 mm，长度406 mm）。
   1. 将管路剪裁至至少8英寸长，以确保管路有足够的容量容纳5 µL液体。
   2. 确保管路覆盖注射器的金属部分及塑料塞顶部，以帮助防止管路中产生气泡。
4. 将管路另一端连接至10 µL玻璃微量注射器（气密型；固定针头；21 G，针头突出长度10 mm），同样需确保与注射器金属部分形成紧密密封（图1A）。
5. 管路连接完成后，用5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）、人工间质液（SIF）或其他合适溶剂反向填充注射器，以防止气泡形成。
   1. 若观察到管路中存在气泡，用溶剂冲洗管路直至气泡消失。
      注：在将注射器连接至管路前，先用溶剂填充注射器，连接后再推动液体通过管路，可能有助于减少气泡。
6. 当管路已用5 µL溶剂充分反向填充且运行正常后，将5 µL药物/溶液装入Hamilton注射器（若为学习或练习该技术，可用墨水或染料替代药物/溶液）。
   1. 确保所有施用于硬脑膜的溶剂均维持在pH 7.4，并调节渗透压至310，以减少硬脑膜内酸敏感离子通道及其他渗透压敏感通道的潜在激活。
7. 在小鼠中测试的最大未引起脑组织渗漏的体积约为10 µL，但该体积注射后的行为学效应尚未进行测试。因此，仅向硬脑膜施用5 µL溶液。
   ​注：这些观察结果基于6-8周龄CD1/ICR小鼠品系/年龄/体重。

2. 硬脑膜注射

1. 准备好注射器并装入药物后，将小鼠俯卧位固定，通过鼻罩以0.5–1 L/min的氧气流速和3%异氟烷进行短暂麻醉。
   1. 当小鼠不再出现夹趾反射时，调整麻醉状态，维持1.5%异氟烷麻醉。
2. 麻醉成功后，向小鼠眼部涂抹无菌眼膏，剃除头部毛发，并使用聚维酮碘和乙醇对皮肤进行消毒。随后，调整至有利于成功注射的体位。 
3. 用一只手固定小鼠头部，另一只手持注射导管。
4. 仔细探查并定位小鼠颅骨上矢状缝与人字缝的交界处（图1B，C）。
   1. 通过皮肤定位该隐蔽交界处时，应依据颅骨的解剖特征，用注射导管轻柔地探查交界区域的大致位置。
   2. 通过沿颅骨重新移动注射导管并感受确切位置，确认交界点的准确性。
5. 确定缝合线位置且注射导管就位后，非常缓慢而轻柔地前后摆动导管，直至其穿透皮肤并完全落入交界处，直至塑料止挡部位。
   注：务必确保将导管全长0.6 mm的尖端完全插入交界处。
6. 为验证注射准确性，可使用墨水或染料作为注射液，随后处死并断头取下小鼠头部。
   1. 去除颅骨盖以观察硬脑膜内的染料分布（图1C）。
      注：不应在脑组织或颅骨外部观察到染料。同样，在任何实验中，均应在动物死后检查注射位置的准确性，并确认硬脑膜完整性未受损伤。
7. 完成注射后，将小鼠撤离麻醉，等待其恢复意识，随后将其放回笼具或转移至测试装置，开始所需的检测。
   ​注：在进行任何行为学实验前，应至少让小鼠从麻醉中恢复30分钟。

3. 眼周 von Frey

1. 以约16-20只小鼠组成的群体开始研究。
2. 在适应性训练前一天，对每只小鼠进行至少5分钟的手动操作处理。
3. 处理后约24小时，使小鼠适应测试室环境及von Frey测试装置（图2A）。
   注：丙烯酸测试装置由带盖的独立隔间组成，每个隔间尺寸约为3英寸×3.5英寸×5英寸（宽×高×深），由铝制支架支撑，支架通过0.25英寸19号镀锌方孔钢丝网连接。
   1. 将小鼠放入一个水平放置的4盎司白色纸杯中，该纸杯无味，且不含聚乙烯或石蜡。
      注：推荐使用此类纸杯，因为若被小鼠摄入，可减少其胃肠道不适（图2B）。
4. 当动物处于各自隔间时，在每只小鼠的独立隔间内放置一粒正常饲料颗粒，以安抚动物并避免任何不必要的应激。在进行任何von Frey行为测试前3天即开始此操作。
   1. 确保每次小鼠进入隔间时均有食物可供取食。
   2. 对每只动物编号，并将其固定分配至测试架中的同一位置。在测试期间的每一天，均将小鼠放入相同的纸杯中，以确保每只动物能适应其测试环境。
      注：小鼠会啃咬纸杯并最终将其破坏。若发生此情况，应更换纸杯，并用相应的小鼠编号进行标记。
5. 在初始3天适应期结束后，将小鼠放入各自的独立隔间中。
   1. 在进行von Frey测试前，让动物在测试室及隔间中至少适应1小时，以便小鼠安静下来，从而更易于测试。
6. 在测试当天适应环境后，将一只小鼠连同其纸杯一起从对应隔间中取出。
   1. 保持纸杯处于水平位置，使小鼠前爪和后爪均着地，以帮助其体重均匀分布。
      注：体重分布不均可能改变动物的反应，甚至导致动物无反应。
7. 将装有小鼠的纸杯放置在测试架下方桌面上的吸水垫上。
8. 进行眶周von Frey测试时，将0.07 g的von Frey纤维丝直接置于面部中央、两眼之间。
9. 对纤维丝施加足够的压力，使其弯曲成"C"形。
   1. 保持与测试区域接触至少3秒，但不超过5秒，或直至小鼠缩回头部并用前爪拍打纤维丝。
      注：若纤维丝滑脱，或测试过程中纤维丝的尖端以外部分接触动物，则不应计入任何反应。此类反应可能是由刷毛刺激引发，而刷毛激活的是不同类型的机械感受器，因此可能无法反映准确结果。
   2. 按照Dixon "上下"法施加von Frey纤维丝^22,23。
      1. 初始时使用重量为0.07 g的von Frey纤维丝。本研究中可能使用的最低和最高测试纤维丝重量分别为0.008 g和0.6 g。
      2. 使用重量为0.008 g、0.02 g、0.04 g、0.07 g、0.16 g、0.4 g和0.6 g的纤维丝进行本项检测。
      3. 在此方法中，若动物对某根纤维丝无反应，则施加下一更重克数的纤维丝。
      4. 若小鼠对某根纤维丝产生反应，则认为该小鼠对该纤维丝有反应。若出现此情况，则施加下一更轻克数的纤维丝。
      5. 重复此模式，直至动物在首次反应后完成4次测试，或确定动物对检测中所有纤维丝均无反应。
         ​注：避免来自手臂或手腕的额外施压。可使用天平练习纤维丝的施加力度。

4. 测试基线撤退阈值

1. 在将小鼠纳入实验之前，确保其基础缩足阈值达到 0.5–0.6 g 之间。
   1. 若小鼠在第 3.9.2.2 步所述系列细丝（0.07 g、0.16 g、0.4 g 和 0.6 g）测试中均未产生反应，则视为已达到基础状态。
2. 在建立基础缩足阈值期间，应每天对小鼠进行测试。
   1. 测试可使动物适应测试环境及 von Frey 细丝施加的压力。
   2. 若小鼠在测试第三天后仍表现出极度的痛觉过敏，可尝试再等待 1 至 2 天后重新测试。
      注意：测试间隔时间过长可能导致动物无法适应细丝对其眶周区域施加的压力，从而无法达到目标缩足阈值。
3. 在确定哪些动物不符合实验纳入标准前，需对小鼠进行约 7 天的测试。
   ​注意：约 70% 的小鼠可达到目标基础水平。
   1. 在硬脑膜刺激前，分析基础数据，排除未达到 0.5–0.6 克或更高基础值的任何小鼠。
   2. 排除后，将剩余每只小鼠随机分配至各测试组。可通过抽签或在电子表格中编写脚本以实现编号的随机分组。

5. von Frey 实验结果的分析

1. 获得一系列反应后，根据已发表的方法²⁴确定 delta 值、k 值、50% 阈值以及以克为单位的撤足阈值。
2. 使用以下公式计算撤足阈值：WT = 10^(x*F+B)，其中 WT = 撤足阈值，F = 通过 Chaplan 方法计算的足爪撤回阈值，B = log（弯曲力）的线性回归 = x × 接触丝编号 + B。
3. 以克为单位，将数据绘制成 50% 撤足阈值或平均撤足阈值曲线图。

结果

该注射方法用于将刺激物施加到小鼠的硬脑膜上，以便进行后续的行为学测试。在此模型中最常检测的行为学指标是通过von Frey纤维丝评估的面部皮肤痛觉过敏^12,13,14。本文展示了该模型可用于评估潜在的性别特异性因素在偏头痛病理机制中的作用（图3）。

该方法已被用于研究硬脑膜催乳素（PRL）对机械性诱发的面部感觉过敏的影响¹⁴（图3）。本研究结果显示，雌性ICR小鼠在硬脑膜给予5 µg催乳素后，面部回缩阈值显著降低（图3A）。给予10倍低剂量（0.5 µg）的催乳素（PRL）亦可产生与高剂量PRL相似的反应（图3B）...

讨论

尽管没有组织损伤，硬脑膜局部伤害性感受系统的适应不良性改变仍被认为是偏头痛发作头痛期的关键因素^25,26。本研究提出了一种方法，通过微创刺激硬脑膜可诱导面部触觉过敏。在不损伤颅骨和组织的情况下，阐明硬脑膜伤害性感受器激活所涉及的机制和事件，可能更准确地反映临床前模型中的偏头痛机制。

开颅术和套管植入术长期以来被用于评估与偏头痛疼痛相关的功能和机制^11,12。然而，已有报道称开颅术可诱导硬脑膜肥大细胞活化，并增加啮齿类动物软脑膜血管通透性²⁷。鉴于硬脑膜肥大细胞活化在偏头痛中具有重要作用^7,8,28,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 盎司热饮纸杯	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
吸水性垫巾	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC 内置 28 G 套管	P1 Technologies (前身为 Plastics One)	8IC313ISPCXC	内径 18 mm，外径 35 mm
Gastight 1701 SN 型气密注射器	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec 泵管，0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
带铁丝网的支架	定制		镀锌钢丝网规格为 0.25 英寸 × 19 号
带独立 隔间的测试架	定制		每个隔间应设有分隔板以分隔每只小鼠，并配有盖子防止小鼠逃逸。隔间还应足够大，以容纳一个 4 盎司纸杯。
von Frey 纤维丝	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html