偏头痛最显著的症状是严重的头痛，据推测这是由支配脑膜的感觉神经元介导的。本文介绍一种在最小侵入条件下局部向硬脑膜施加物质的方法，并以面部痛觉过敏作为检测指标。
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本文内容
摘要
摘要
硬脑膜、蛛网膜和软脑膜组成的颅脑脑膜被认为主要为神经系统提供结构支持功能。例如，它们可保护大脑免受颅骨的直接压迫，并固定和组织皮层的血管与神经供应。然而，脑膜也参与多种神经系统疾病的发生过程，例如偏头痛：偏头痛发作时的疼痛被认为源于局部无菌性炎症以及继发的局部伤害性传入神经元的激活。在脑膜各层中，硬脑膜在偏头痛的病理生理过程中尤为关键。硬脑膜具有丰富的血管分布，含有局部的伤害性感觉神经元，并驻留着多种多样的细胞类型，如免疫细胞。脑膜局部微环境的细微变化可能导致硬膜周围血管伤害性感受器的激活和致敏，从而引发偏头痛疼痛。已有研究尝试通过在体电生理记录、成像技术或行为学模型来探讨硬脑膜传入神经如何被激活或致敏，但这些方法通常需要高度侵入性的手术操作。本实验方案介绍了一种相对非侵入性地向小鼠硬脑膜施加化合物的方法，以及在硬脑膜刺激后通过眶周von Frey测试评估类头痛性触觉敏感性的适宜方法。该方法通过在未完全闭合的矢状缝与人字缝交界处插入一根改良的0.65 mm导管注射物质，从而保持硬脑膜和颅骨的完整性，减少侵入性技术带来的干扰因素。这一临床前模型将使研究人员能够在不造成颅骨和脑膜损伤的前提下，广泛探究多种硬脑膜刺激因素在偏头痛病理进展中的作用，包括伤害性感受器激活、免疫细胞活化、血管变化以及疼痛相关行为等。
引言
偏头痛疼痛仍是全球主要的公共卫生问题。世界卫生组织将其列为全球第六大常见疾病，影响着全球近15%的人口1，并给社会带来重大的社会经济负担2,3。目前的治疗选择及其疗效仍不理想，仅能缓解症状，而无法显著改变偏头痛发作背后的病理生理过程4,5。治疗效果不佳的原因可能在于偏头痛是一种多因素障碍，其病理机制尚未被充分理解，导致可用的治疗靶点有限。偏头痛在动物模型中也难以全面模拟，尤其是因为偏头痛的诊断依赖于与患者的语言交流，患者需描述其经历的偏头痛典型特征，如先兆、头痛、畏光和异常性疼痛。尽管如此，值得注意的是，近年来偏头痛治疗方面取得的进展，目前在疗效上已超过许多虽经临床前模型充分验证但治疗效果仍有限的神经系统疾病。例如，靶向降钙素基因相关肽（CGRP）或其受体的单克隆抗体和小分子药物在改善偏头痛患者生活质量方面已取得显著成功，并有望彻底改变偏头痛的临床管理方式。尽管对该疾病的理解已有进展，但仍有许多机制尚待阐明。
根据临床前动物模型和人类研究，目前普遍认为偏头痛是由脑膜内伤害性纤维异常激活所引发，这些纤维通过三叉神经和上颈段背根神经节传递信号6....
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方案
所有实验程序均事先获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用了6至8周龄、体重30-35 g的ICR（CD-1）小鼠和体重25-30 g的C57/BL6小鼠。
1. 硬脑膜输注器
- 通过改造市售的单侧注射用内插管和注射器，使用可调节的非金属熔融石英塑料帽，制备小鼠注射装置/注射器，该塑料帽可插入并延伸至内径（I.D.）为0.18 mm、外径（O.D.）为0.35 mm的28 G引导套管下方（图1A）。
- 使用卡尺或其他测量工具将注射器上的熔融石英塑料帽调节至0.6 mm的长度；该长度从注射器尖端测量至石英塑料帽边缘。
- 调节塑料帽时需小心，避免弯曲或钝化注射器尖端。
- 对于此前未用于硬脑膜注射的小鼠品系，可通过将注射器长度设为0.6 mm并使用墨水或染料进行预实验注射，确定最佳注射器长度；逐步调整注射器长度，直至观察到染料仅位于硬脑膜内，而未出现在脑组织或颅骨上。
- 将已调节好的注射器较长一端（即未测量为0.6 mm的一端）连接至塑料管路（泵用管路，双止口，内径0.19 mm，长度406 mm）。
- 将管路剪裁至至少8英寸长，以确保管路有足够的容量容纳5 µL液体。
- 确保管路覆盖注射器的金属部分及塑料塞顶部，以帮助防止管路....
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结果
该注射方法用于将刺激物施加到小鼠的硬脑膜上，以便进行后续的行为学测试。在此模型中最常检测的行为学指标是通过von Frey纤维丝评估的面部皮肤痛觉过敏12,13,14。本文展示了该模型可用于评估潜在的性别特异性因素在偏头痛病理机制中的作用（图3）。
该方法已被用于研究硬脑膜催乳素（PRL）对机械性诱发的面部感觉过敏的影响14（图3）。本研究结果显示，雌性ICR小鼠在硬脑膜给予5 µg催乳素后，面部回缩阈值显著降低（图3A）。给予10倍低剂量（0.5 µg）的催乳素（PRL）亦可产生与高剂量PRL相似的反应（图3B）.......
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讨论
尽管没有组织损伤，硬脑膜局部伤害性感受系统的适应不良性改变仍被认为是偏头痛发作头痛期的关键因素25,26。本研究提出了一种方法，通过微创刺激硬脑膜可诱导面部触觉过敏。在不损伤颅骨和组织的情况下，阐明硬脑膜伤害性感受器激活所涉及的机制和事件，可能更准确地反映临床前模型中的偏头痛机制。
开颅术和套管植入术长期以来被用于评估与偏头痛疼痛相关的功能和机制11,12。然而，已有报道称开颅术可诱导硬脑膜肥大细胞活化，并增加啮齿类动物软脑膜血管通透性27。鉴于硬脑膜肥大细胞活化在偏头痛中具有重要作用7,8,28,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助（资助号：NS104200 和 NS072204，授予 GD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4 盎司热饮纸杯 | Choice Paper Company | 5004W | https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html |
| 吸水性垫巾 | Fisherbrand | 14-206-65 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048 |
| C313I/SPC 内置 28 G 套管 | P1 Technologies (前身为 Plastics One) | 8IC313ISPCXC | 内径 18 mm，外径 35 mm |
| Gastight 1701 SN 型气密注射器 | Hamilton | 80008 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008 |
| Ismatec 泵管，0.19 mm | Cole-Palmer | EW-96460-10 | https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 |
| 带铁丝网的支架 | 定制 | 镀锌钢丝网规格为 0.25 英寸 × 19 号 | |
| 带独立 隔间的测试架 | 定制 | 每个隔间应设有分隔板以分隔每只小鼠，并配有盖子防止小鼠逃逸。隔间还应足够大，以容纳一个 4 盎司纸杯。 | |
| von Frey 纤维丝 | Touch test/Stoelting | 58011 | https://www.stoeltingco.com/touch-test.html |
参考文献
- GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
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