方法文章

活荧光、细胞褶皱的逆向成像和巨胞饮作用

DOI：

10.3791/62870

⸱

2021年8月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案使用连续摄取和反向图像在活细胞中展示葡聚糖成像，以优化褶皱、巨噬菌体成熟的可视化以及葡聚糖和其他细胞标记的分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

巨胞饮作用是一个高度保守但仍不完全了解的过程，对于细胞中液体、液相营养物质和其他物质的吸收和摄入至关重要。细胞表面褶皱的急剧延伸、它们闭合形成巨噬菌体以及内化巨噬菌体的成熟是该途径中的关键事件，使用基于追踪荧光货物团块的常规共聚焦成像可能难以捕获。荧光葡聚糖在实验中通常用作巨噬菌体和其他内吞途径的液相标志物。实验室采用的一种优化葡聚糖摄取成像的方法包括对培养基中沐浴在高浓度荧光葡聚糖中的细胞进行实时成像，未标记的细胞呈浮雕状（黑色）。细胞褶皱被突出显示以可视化褶皱闭合，内化的巨噬菌体在细胞内部表现为荧光液泡。这种方法是可视化巨噬菌体特征的最佳选择，并且易于分割和定量。本文描述了具有不同大小葡聚糖的通路的双重标记以及脂质探针和荧光膜蛋白的共表达以标记巨噬菌体和其他内体。还证明了使用相关光学和电子显微镜 （CLEM） 在超微结构水平上检测内化葡聚糖。这些细胞过程可以使用多种实时成像模式（包括 3D）进行成像。综上所述，这些方法优化了许多不同环境和实验系统的巨噬菌体成像。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大多数脊椎动物细胞类型在整个进化过程中与前辈共享非选择性吸收液体的先天能力，这可以追溯到单细胞变形虫1。这种巨胞饮作用（大量饮酒）高度保守的液相摄取过程被变形虫主要用于营养获取1，而在脊椎动物细胞中，它同样可以作为在压力下获取营养的供应途径，并且免疫细胞使用它来采样和监测组织环境2。巨噬作用具有区别于其他形式的内吞作用的特征，包括独特的大（直径 >0.2 mm）液泡状巨噬菌体、液体和溶质摄取的非选择性性质以及伴随的质膜扩展，这些质膜被机会性地内化为巨噬菌体3。这种摄取的非选择性性质意味着必须迅速进行分选和回收，才能通过将必需的可溶性和质膜蛋白回收回细胞表面来挽救它们。进入巨噬细胞体的大部分物质注定要在溶酶体中降解，并通过巨噬细胞体成熟和与其他内体融合进入内/溶酶体途径。质膜蛋白也可以从巨噬菌体回收回细胞表面。癌症领域对了解巨胞饮作用的过程有着浓厚的兴趣，巨胞饮作用在癌细胞中被激活并有助于维持其营养和增殖 2,4,5,6。巨噬细胞作用既是组成性的，也可以在免疫细胞中受体介导的刺激下进一步诱导，其中巨噬菌体宿主受体信号传导，有助于抗原呈递的内/溶酶体加工，并为各种病毒、细菌和其他病原体提供进入门户 3,7。

Macropinosome 几乎没有独特或独特的标志物。它们在剧烈的、富含肌动蛋白的细胞表面褶皱的基部形成过程中最容易识别，这些褶皱接近吞噬液体8。闭合后，巨噬菌体周围的 F-肌动蛋白立即解聚，巨噬菌体本身发生与同型和异型融合、管化和收缩相关的动态变化9。Macropinosome 也很难在超微结构水平上识别，因为它们没有特征性外壳或其他特征，并且简单地表现为大小不一的液泡。如果没有明确的膜标志物，巨噬菌体最容易和传统上由它们的液体货物定义，实验上通过使用荧光葡聚糖。葡聚糖是一种葡萄糖衍生的复合多糖，可与大量荧光或电子密集标记物偶联，并添加到培养基中以供细胞摄取或灌注以供组织摄取。此外，大分子量 （MW） 葡聚糖 （70 kDa） 现在被认为是巨噬菌体的尺寸选择性货物，因为它不会进入其他较小的内吞囊泡，并且已成为巨胞饮作用最常见的标记10,11。观察巨胞饮作用通常包括用荧光葡聚糖脉冲孵育细胞，并使用固定或活细胞进行荧光成像，以查看巨噬细胞体细胞内葡聚糖标记的推注。由于它们的体积大，也可以使用相差或明场显微镜在某些细胞类型中观察未标记的巨噬菌体，其中巨噬菌体表现为大的白色空泡。从细胞的相差图像中获得一些上下文信息，然后这些图像还可以与荧光图像叠加，以描述荧光葡聚糖摄取12,13。不同大小和不同标记的葡聚糖可用于监测液体对多个细胞和内吞途径的摄取 10,14,15，葡聚糖可应用于细胞培养物或灌注到小鼠体内进行活体成像16 ，甚至可以注射到果蝇胚胎17 中进行实时成像。

使用葡聚糖追踪巨噬菌体产生的一些困难包括它在细胞固定或透化后从巨噬菌体中泄漏出来，它在不进行侵袭性巨噬作用的细胞中的水平稀释或难以检测，以及它在巨噬菌体成熟过程中在细胞内的动态部署和分散3.这些问题在大多数实验中都变得更加复杂，这些实验旨在跟踪添加到细胞中然后洗掉的葡聚糖的单次脉冲的摄取。

相反，本文描述了将荧光葡聚糖应用于细胞并在实时成像期间将其留在培养基中以记录细胞连续摄取的优势。这放大了巨噬菌体和随后的内体中的葡聚糖信号，显示了整个成熟途径。在细胞的未标记（黑色）内部观察标记的巨噬菌体，作为高对比度逆设置，揭示了巨噬菌体的所有特征，相反，在细胞外部，高荧光培养基突出了细胞表面的动态褶皱。该方法描述了葡聚糖的实时成像，用于光学显微镜、共聚焦成像，以及在细胞固定后通过相关光学和电子显微镜 （CLEM） 进行检测。此处包括的成像是对不同的细胞类型进行的，以证明这些方法的广泛适用性，包括活化的巨噬细胞和小胶质细胞，其中巨胞饮作用非常活跃和快速，以及巨胞饮作用相对较少的癌细胞。

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方案

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1. 在 35 mm 玻璃底培养皿上制备细胞（第 0 天）

  1. 在37°C下，在加湿的5%CO2 培养箱中，在补充有10%热灭活（用于RAW264.7）或常规胎牛血清和1%L-谷氨酰胺的完全培养基中维持和传代细胞系。
  2. 在 35 mm 玻璃底培养皿上接种适当数量的细胞，以在 24 小时内达到 60% 汇合。
    注:对于此处描述的 RAW264.7、BV2 小胶质细胞和 MDA-MB 231 乳腺癌细胞，推荐的细胞密度为 2 mL 的 0.15 x 106 个细胞/mL 至 0.25 x 106 个细胞/mL。

2. 荧光 DNA 质粒转染（第 1 天） - 可选

注:不同的荧光标记蛋白和探针可以在克隆细胞系中瞬时或稳定表达，以特异性标记内吞途径中的肌动蛋白褶皱和隔室，例如早期内体、晚期内体或溶酶体。

  1. 根据制造商的说明，使用基于脂质的转染试剂盒转染细胞，在组织培养罩中铺板 1 天后。
  2. 在 125 μL 最低必需培养基（减血清）中稀释 2 μg 无内毒素纯化的 DNA 质粒。轻轻混合，在室温下静置 5 分钟。
  3. 在 125 μL 最低必需培养基（减量血清）中稀释 5 μL 转染试剂。轻轻混合，在室温下静置 5 分钟。
  4. 将稀释的 DNA 质粒和稀释的转染试剂混合，再孵育 10 分钟，然后滴加到细胞中。
  5. 将细胞与转染复合物在 37 °C 下在加湿的 5% CO 2 培养箱中孵育 3-4 小时，然后更换为新鲜的全培养基。
  6. 第二天使用转染的细胞进行实验或进行有限稀释克隆以获得稳定表达的细胞系。

3. 内吞囊泡和巨噬菌体的可视化（第 2 天）

注:不同分子量的荧光葡聚糖（10 kDa MW 的葡聚糖 Alexa Fluor 488/647 和 70 kDa MW 的葡聚糖 Oregon Green 488/四甲基罗丹明，阴离子，赖氨酸可固定）用于监测液相摄取到一系列内吞途径中14。巨噬菌体为 70 kDa，所有途径为 10 kDa。

  1. 在预热的培养基中以 200-500 ng/mL 的浓度制备葡聚糖作为 2x 浓缩悬浮液，以添加到细胞中。
  2. 可选:实验可能需要事先或同时添加补充剂或药物以影响内吞活性。例如，用生长因子（例如 200 ng/mL CSF-1）或活化配体（例如 LPS 100 ng/mL 或 300 ng/mL CpG）预处理巨噬细胞和小胶质细胞，以增强褶皱和巨胞饮作用。在完全培养基中摄取葡聚糖之前，将癌细胞在适当的无血清培养基中培养 12-16 小时。有关推荐的细胞密度，请参阅步骤 1.2。
  3. 为了准备实时成像，将玻璃底培养皿中生长的细胞放在装有 37 °C 加热垫和 5% CO2 加湿培养箱的倒置共聚焦显微镜的载物台上。
  4. 吸出多余的培养基，在玻璃底培养皿中留下 500 μL 完全培养基。
  5. 找到合适的单元格区域并设置焦点。对于延时成像，请在采集前预先选择合适的荧光激光器、滤光片和设置。使用以下设置来解析单个细胞和巨噬菌体。
    1. 在具有 63x 1.4 NA 油浸 Plan Apochromat 物镜的倒置共聚焦显微镜上对感兴趣区域进行成像。
    2. 选择 512 x 512 作为图像大小，双向扫描以实现快速成像。
    3. 专注于细胞的单个焦平面。设置为捕获为单个切片或设置大约 0.3 μm 的光学切片厚度 （Nyquist） 以组合为 Z 堆栈。
    4. 选择间隔为 5 秒的延时摄影，持续时间为 20-45 分钟，具体取决于特定的细胞类型。
    5. 根据特定的单元类型，选择硬件自动对焦/对焦跟踪，以帮助在拍摄期间在适当的持续时间内保持图像稳定。
    6. 加入等体积的 2x 葡聚糖加标培养基，并立即开始巨噬细胞的实时图像捕获。等待 20 分钟，然后再对 MDA-MB 231 细胞中较慢的摄取进行成像。
      注:使用这种方法，具有两个荧光团通道的 BV2 细胞在加入葡聚糖混合物后以最大速度跟踪在单个平面上连续成像 45 分钟。为了检测 RAW 264.7 细胞中的早期巨噬菌体，其中巨胞饮作用发生得非常迅速，获取 4-6 个切片的单个切片（用于快速成像）或 Z 堆栈（用于 3D 捕获）并在添加葡聚糖后以 5 秒的间隔延时 20 分钟。对于 MDA-MB 231 细胞，获取 10-15 个切片之间的最佳 Z 堆栈，间隔 5 秒，持续 40 分钟。

4. 光电联用显微镜 （CLEM）（第 3 天）- 可选

  1. 根据方案的步骤 1、2 和 3 进行调整准备细胞。简而言之，在带网格的玻璃底培养皿（35 mm 培养皿，1.5 号网格盖玻片，14 mm 玻璃直径，无涂层）上培养 0.2 x 10个 6 个细胞/mL RAW264.7 细胞，用荧光质粒（例如 mCherry-2xFYVE）转染，并在加入葡聚糖-488 （70 kDa） 之前在 37 °C、5% CO2 加湿培养箱中放置 20 分钟。
  2. 用 1 mL 冰冷的 PBS 快速洗涤细胞，并用 0.1% 戊二醛固定。
  3. 在共聚焦显微镜上获取葡聚糖-488 和 mCherry-2xFYVE 的固定细胞图像。
  4. 如前所述，在将培养皿处理为透射电子显微镜 （EM） 之前捕获明场图像以识别网格位置18。简而言之，进一步将细胞固定在 2.5% 戊二醛中，后固定在 1% 还原的四氧化锇中，用 2% 乙酸铀整块染色，然后通过一系列乙醇脱水，然后包埋在 LX112 树脂中。从块中切除网格位置，并使用超薄切片机收集超薄切片。使用适当的成像系统软件在 80 kV 的电子显微镜上捕获图像。

5. 数据处理和可视化（第 4 天）

注意:FIJI - 一个开源图像分析包- 用于可视化和分析33.

  1. 复制原始数据进行处理，以符合 F.A.I.R. 数据原则，即研究数据是可查找、可访问、可互作和可重用的。
  2. 使用直方图数据均匀调整图像集的亮度和对比度。
  3. 将图像显示为从获取的 Z 堆栈图像中获得的最大强度投影。
  4. 为图像集插入比例尺。
  5. 裁剪/旋转 FOV 数据（可选）。为时间序列数据创建代表性面板。
  6. 为了进一步分析和定量，量化细胞中摄取的葡聚糖的荧光强度，作为巨胞饮作用活性的量度。要将分析限制在单个细胞中，请使用此处描述的成像方法。
    1. 反转 LUT 以翻转没有荧光的细胞区域的颜色以执行阈值。
    2. 分割前景对象并创建单元格掩码以标识单个单元格。
    3. 将细胞掩膜与先前发表的识别和测量单个巨噬菌体的方法19 结合使用。使用这些指标来量化巨胞饮作用，包括每个细胞的大小、数量和总摄取量。

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结果

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与传统的成像技术相比，浸入高浓度荧光葡聚糖中的未标记活细胞成像方法具有多项优势，可用于追踪巨胞饮作用。通过以浮雕形式呈现图像，细胞体显示为黑色，并允许在明亮的荧光背景下改善戏剧性细胞表面褶皱的可视化，然后是 TMR 葡聚糖 （70 kDa） 填充的大噬菌体的液相内化，如图 1A 所示。在这个最大强度投影中，记录了癌细胞，巨噬菌体从褶皱边界进入细胞。细胞的黑色内部，没有背景或离焦荧光，提供了巨噬菌体的高对比度清晰度，精确地描绘了它们的大小和形状，并揭示了成熟过程中发生的变化，如图 1B 所示，并在 图 1C 中的电影序列中突出显示。同型融合伴随着尺寸的增加（图 1C），并且可以清楚地看到巨噬菌体的管状（图 1D）。因此，我们现在能够对液体货物在巨噬细胞体中进入细胞并通过连续的成熟步骤的轨迹进行成像。实时成像消除了对任何可能导致这些囊泡结构改变的...

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讨论

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本文描述了使用葡聚糖标记追踪巨胞饮作用的更传统方法的变体，该方法基于连续沐浴在荧光葡聚糖中的细胞的实时成像，并可视化未标记细胞的黑色背景上的摄取。优化的方案提供了区分不同细胞内囊泡的方法，并允许对多个巨胞饮和内吞货物和蛋白质进行时空跟踪。将细胞浸入葡聚糖培养基中以监测液相摄取动态过程的方法首次在 Dictyostelium23 中得到验证。其他先前研究的例子也观察了 Relief 中的细胞以查看摄取15,16。本文中描述的方案提供了对这种方法的更全面的治疗和分析，现在将有助于在各种细胞和组织环境中进行未来的研究。这种方法也适用于沐浴在葡聚糖中的类器官以及通常将葡聚糖灌注或注射到组织、胚胎和不易洗掉的整个生物体中的体内环境。

单独或一起摄取小和大葡聚糖可以为定量和比较巨胞饮作用与其他内吞途径提供强大的...

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披露

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作者声明没有竞争性的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Tatiana Khromykh 提供的专业技术帮助。荧光成像是在 IMB 显微镜中进行的，其中包含由澳大利亚癌症研究基金会资助的癌症超微结构和功能设施;电子显微镜检查在 UQ 的显微镜和微量分析中心进行。资金来自澳大利亚国家健康与医学研究委员会 （JLS APP1176209） 和澳大利亚研究委员会 （DP180101910）。NDC 作为 CZI 成像科学家得到了硅谷社区基金会咨询基金 Chan Zuckerberg Initiative DAF 的资助号 2020-225648 的支持。YH 得到了澳大利亚政府的博士奖学金和 Yulgilbar 阿尔茨海默病研究计划的资助。Z-JX 得到了中国科学院奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2% 四氧化锇ProSciTechEMS19192
647-转铁蛋白分子探针，Invitrogen T23366
BV2 细胞由 Liviu Bodea 博士（昆士兰脑研究所）
CpG（B 类）综合 DNA 技术定制订单
葡聚糖 Alexa Fluor 488  10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
葡聚糖 Alexa Fluor 647  10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
葡聚糖 Oregon Green 488,70 kDaMW Life Technology Australia Pty LtdD1818
葡聚糖四甲基罗丹明，70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM 培养基，含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺Gibco Invitrogen#11995
胎牛血清Interpath Services Pty LtdSFBS-F
戊二醛水溶液，EM 级 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 电子显微镜JEOL-L
-谷氨酰胺Gibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek 玻璃底培养皿 35 mm，未涂层网格MatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek 玻璃底培养皿 35 mm 未涂层MatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 细胞ATCCHTB-26
Opti-MEM 还原血清培养基Thermo Fisher Scientific31985088
质粒 mCherry-2XFYVEFrederic Meunier 博士（昆士兰大学）亲切赠予我们的礼物-
质粒 mCherry-PLCδ-PHFrederic Meunier 博士（昆士兰大学）亲切赠予我们的礼物-
Raw264.7 细胞ATCCTIB-71
RPMI 培养基 1640，不含 L-谷氨酰胺Gibco Invitrogen#21870
超纯 LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
乙酸铀酰ProSciTechC079
蔡司倒置 LSM880 共聚焦显微镜蔡司-
-B

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

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