活体荧光、倒置成像观察细胞皱褶形成及巨胞饮作用

摘要

本方案通过连续摄取和反向成像技术，展示在活细胞中对葡聚糖进行成像的方法，以优化细胞皱褶、大胞饮体成熟过程的可视化，以及葡聚糖和其他细胞标记物的分析。

摘要

巨胞饮是一种高度保守但尚未完全阐明的过程，对细胞摄取液体、液相营养物质及其他物质至关重要。细胞表面皱褶的显著延伸、皱褶闭合形成巨胞饮体，以及内化后的巨胞饮体成熟，是该通路中的关键事件。使用传统共聚焦成像技术追踪荧光示踪物团块时，这些过程往往难以捕捉。实验中通常采用荧光葡聚糖作为巨胞饮体及其他内吞通路的液相标记物。本实验室采用的一种优化葡聚糖摄取成像的方法是：将细胞置于含有高浓度荧光葡聚糖的培养基中进行活细胞成像，未标记的细胞以对比形式（呈黑色）显现。该方法可突出显示细胞皱褶，便于观察皱褶闭合过程，而内化的巨胞饮体则表现为细胞内部的荧光空泡。此方法非常适合可视化巨胞饮体的特征，并有利于后续的分割与定量分析。本文描述了使用不同大小的葡聚糖对通路进行双标记，以及共表达脂质探针和荧光膜蛋白以区分巨胞饮体与其他内体的方法。同时展示了利用光镜与电镜关联成像技术（CLEM）在超微结构水平检测内化葡聚糖的方法。这些细胞过程可通过多种活细胞成像方式观察，包括三维成像。综上所述，这些方法可针对多种实验条件和体系优化巨胞饮体的成像效果。

引言

大多数脊椎动物的细胞类型都具有非选择性摄取液体的先天能力，这种能力在进化过程中与其祖先一脉相承，可追溯至单细胞的阿米巴原虫¹。这种通过巨胞饮作用（“大量饮水”）进行液体相摄取的高度保守过程，在阿米巴原虫中主要用于获取营养物质¹，而在脊椎动物细胞中，它同样可在应激条件下作为获取营养的供应途径，并被免疫细胞用于对组织环境的取样与监视²。巨胞饮作用具有一些区别于其他内吞形式的特征，包括独特的大尺寸（直径>0.2 mm）空泡样巨胞饮体、对液体和溶质的非选择性摄取，以及伴随大量质膜被机会性地内化进入巨胞饮体³。由于这种摄取具有非选择性，细胞必须迅速进行分选和再循环，将重要的可溶性蛋白和质膜蛋白回收至细胞表面。进入巨胞饮体的大部分物质最终将被运送至溶酶体中降解，并通过巨胞饮体的成熟及其与其他内体的融合，被导入内体/溶酶体通路。质膜蛋白也可从巨胞饮体被再循环回细胞表面。在癌症研究领域，人们对巨胞饮作用过程的兴趣日益浓厚，因为该过程在癌细胞中被激活，有助于维持其营养供给和增殖能力^2,4,5,6。巨....

方案

1. 在35 mm玻璃底培养皿中接种细胞（第0天）

1. 在含10%热灭活（用于RAW264.7）或普通胎牛血清及1% L-谷氨酰胺的完全培养基中，于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养和传代细胞系。
2. 将适量细胞接种于35 mm玻璃底培养皿中，使其在24 h内达到60%融合度。
   ​注意：本实验所描述的RAW264.7、BV2小胶质细胞和MDA-MB 231乳腺癌细胞推荐接种密度为每毫升0.15 × 10⁶ 至 0.25 × 10⁶ 个细胞，接种体积为2 mL。

2. 荧光DNA质粒转染（第1天）——可选步骤

注意：不同的荧光标记蛋白和探针可以在克隆细胞系中瞬时或稳定表达，以特异性地标记肌动蛋白皱褶以及内吞途径中的区室，例如早期内体、晚期内体或溶酶体。

1. 转染前一天在组织培养罩内接种细胞，然后使用脂质体转染试剂盒按照生产商说明书进行细胞转染。
2. 将2 µg无内毒素的纯化DNA质粒溶于125 µL最低必需培养基（减血清）中。轻轻混匀，室温静置5分钟。
3. 将5 µL转染试剂加入125 µL最低必需培养基（减血清）中稀释。轻轻混匀，室温静置5分钟。
4. 将稀释后的DNA质粒与稀释后的转染试剂混合，室温孵育10....

结果

采用成像浸没在高浓度荧光葡聚糖溶液中的无标记活细胞的方法，在追踪巨胞饮作用方面相较于传统成像技术具有多项优势。通过以浮雕形式呈现图像，细胞本体呈现为黑色，从而在明亮的荧光背景下更清晰地观察到显著的细胞表面皱褶活动，并可追踪液相内吞的TMR标记葡聚糖（70 kDa）填充的巨胞饮体，如图1A所示。在此最大强度投影图像中，可记录到癌细胞从皱褶边缘摄取巨胞饮体的过程。细胞内部呈黑色，无背景荧光或离焦荧光干扰，从而实现了对巨胞饮体的高对比度成像，精确展示其大小和形态，并揭示其在成熟过程中发生的变化，如图1B所示，并在图1C的动态影像序列中加以突出显示。同型融合伴随体积增大现象（图1C），巨胞饮体的管状结构亦可清晰观察到（图1D）。因此，我们现可对巨胞饮体携带液相货物进入细胞及其后续成熟过程的动态轨迹进行成像。活细胞成像避免了化学固定步骤可能引起的囊泡结.......

讨论

本文介绍了一种对传统葡聚糖标记法的改进，用于通过持续将细胞浸泡在荧光葡聚糖溶液中并结合活细胞成像，追踪巨胞饮作用。该方法可在无标记细胞的暗背景上直观显示胞吞过程。优化后的实验方案能够区分不同的细胞内囊泡，并实现对多种巨胞饮和内吞货物及蛋白的时空动态追踪。将细胞浸入葡聚糖培养基以监测液相内吞动态过程的方法最早在 盘基网柄菌²³. 其他先前研究的示例也采用浮雕成像观察细胞摄取情况^15,16本文所述方案对该方法提供了更全面的处理与分析，将有助于在未来多种细胞和组织环境中的研究。该方法同样适用于浸泡在葡聚糖中的类器官 体内 在右旋糖酐通常被灌注或注射到难以清洗的组织、胚胎和完整生物体的实验环境中。

分别或同时摄取小分子和大分子葡聚糖，可为定量分析以及巨胞饮作用与其他内吞途径的比较提供有力的实验体系。在双标记样品中，可通过红色和绿色通道分别区分早期内体群体，或进行图像合并以实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 四氧化锇	ProSciTech	EMS19192
647-转铁蛋白	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 细胞	由利维乌·博迪亚博士（昆士兰脑研究所）慷慨馈赠	-
CpG（B类）B	Integrated DNA Technologies	定制订单
10 kDa 分子量的葡聚糖 Alexa Fluor 488	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
10 kDa 分子量的葡聚糖 Alexa Fluor 647	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
70 kDa 分子量的葡聚糖 Oregon Green 488	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
70 kDa 分子量的葡聚糖四甲基罗丹明	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基	Gibco Invitrogen	#11995
胎牛血清	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
25% 水溶液戊二醛，电镜级	ProSciTech	C002
Jeol 1011 电子显微镜	JEOL	-
L-谷氨酰胺	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  35 mm 无涂层网格玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek 35 mm 无涂层玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 细胞	ATCC	HTB-26
Opti-MEM 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985088
质粒 mCherry-2XFYVE	由弗雷德里克·穆尼耶博士（昆士兰大学）慷慨馈赠	-
质粒 mCherry-PLCδ-PH	由弗雷德里克·穆尼耶博士（昆士兰大学）慷慨馈赠	-
Raw264.7 细胞	ATCC	TIB-71
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	Gibco Invitrogen	#21870
超纯 LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
醋酸铀酰	ProSciTech	C079
蔡司 LSM880 倒置共聚焦显微镜	Zeiss	-