方法文章

杂交 从头 基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

DOI：

10.3791/62872

⸱

2021年8月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案详细介绍了尿液细菌培养、测序及从头杂合基因组组装的综合方法。该方法提供了一种可重复的操作流程，用于生成完整的环状基因组序列，有助于研究参与尿路定植、致病机制以及抗菌药物耐药性传播的染色体和染色体外遗传元件。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

完整的基因组序列可为了解尿路微生物的遗传多样性及独特的定植因子提供宝贵数据。这些数据可能包含移动遗传元件，如质粒和染色体外噬菌体，它们可促进抗菌药物耐药性的传播，进一步增加尿路感染（UTI）治疗的复杂性。除了能够精细解析基因组结构外，完整且闭合的基因组还可实现详细的比较基因组学和进化分析。由于测序技术的局限性，长期以来从头（de novo）生成完整基因组一直是一项具有挑战性的任务。配对末端的高通量测序（NGS）可产生高质量的短读长序列，通常导致准确但片段化的基因组组装。相反，Nanopore测序可提供质量较低的长读长序列，通常导致易出错的完整组装。此类错误可能阻碍全基因组关联研究，或导致变异分析结果产生误导。因此，结合短读长和长读长的混合策略已成为获得高精度闭合细菌基因组的可靠方法。本文报道了一种综合性方法，包括多种尿路细菌的培养、通过16S rRNA基因测序进行物种鉴定、基因组DNA（gDNA）提取，以及分别利用NGS和Nanopore平台生成短读长和长读长序列。此外，该方法还描述了一个包含质量控制、基因组组装和基因预测算法的生物信息学分析流程，用于生成注释完整的基因组序列。结合多种生物信息学工具，可筛选高质量的测序数据用于混合基因组组装及后续分析。本方案中所述的混合从头（de novo）基因组组装的简化流程，可适用于任何可培养细菌的研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尿液微生物组是一个新兴的研究领域，它打破了长期以来认为健康个体的泌尿道是无菌环境的错误观念。尿液微生物群的成员可能有助于维持泌尿环境的平衡，并预防尿路感染（UTI）1,2。尿路致病菌会侵入泌尿道，并利用多种毒力机制取代常驻微生物群、定植于尿路上皮、逃避免疫应答并抵抗环境压力3,4。尿液是一种营养相对匮乏的培养基，具有高渗透压、氮源和碳水化合物供应有限、低氧以及低pH值等特点5,6,7。此外，尿液还被认为具有抗菌特性，含有高浓度的抑制性尿素以及抗菌肽，例如人源防御素LL-378。研究常驻细菌与尿路致病菌在泌尿道定植过程中所采用的机制，对于深入理解泌尿道健康状况以及开发新的尿路感染治疗策略至关重要。此外，随着一线抗菌疗法失效的情况日益普遍，监测携带抗菌素耐药决定因子的可移动遗传元件在尿液细菌种群中的传播也变得愈发重要9,10。

为了研究尿液细菌的基因型和表型，必须成功培养这些细菌并进行全基因组测序（WGS）。依赖培养的方法对于检测和鉴定尿液样本中的可存活微生物至关重要11。标准的临床尿液培养包括将尿液接种至5%羊血琼脂（BAP）和麦康凯琼脂上，并在35 °C下有氧培养24小时12。然而，由于其检测阈值为≥105 CFU/mL13，该方法无法检出尿液微生物群中的许多成员。改进的培养技术，例如增强型定量尿液培养（EQUC）11，通过采用不同尿液体积、培养时间、培养基种类和大气条件的组合，能够识别出标准尿液培养常遗漏的微生物。本方案描述了一种EQUC的改良版本，称为改良增强型尿液培养法，该方法利用选择性培养基和最佳大气条件，实现多种尿液细菌及尿路致病菌的培养，但本身不具备定量能力。成功分离尿液细菌后，可提取基因组DNA（gDNA），用于后续的全基因组测序和基因组组装。

基因组组装，尤其是完整组装，有助于发现可能在常驻微生物群和尿路致病菌的定植、生态位维持及毒力中起作用的遗传因子。草图基因组组装包含数量不等的连续序列（contigs），这些序列可能含有测序错误，并缺乏方向性信息。在完整基因组组装中，每个碱基对的方向和准确性均已得到验证14此外，获得完整的基因组序列有助于深入了解基因组结构、遗传多样性以及可移动遗传元件15仅依靠短读长测序可能能够鉴定重要基因的存在或缺失，但无法精确定位其基因组背景。16。随着Oxford Nanopore和PacBio等长读长测序技术的发展，生成 关闭 从头合成 细菌基因组组装不再需要手动闭合等繁琐方法 从头合成 通过多重PCR组装17,18短读长测序技术与纳米孔长读长测序技术的结合，使得以相对较低的成本快速获得准确、完整且闭环的细菌基因组组装成为可能。19短读长测序可产生准确但片段化的基因组组装结果，通常由平均40–100个重叠群（contigs）组成；而Nanopore测序可生成长度约为5–100 kb的长读长，准确性较低，但可作为骨架用于连接重叠群并解析基因组共线性。结合短读长和长读长技术的混合策略能够获得准确且完整的细菌基因组19.

本文介绍了一种从人类尿液中分离和鉴定细菌、提取基因组DNA、测序并利用混合组装方法进行完整基因组组装的综合实验方案。本方案特别强调了为准确组装闭合的细菌染色体及质粒等染色体外元件，对短读长和长读长测序所产生的数据进行适当处理所必需的关键步骤。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌培养自签署知情同意书的女性所采集的尿液，该研究已获得机构审查委员会批准，批准号分别为19MR0011（UTD）和STU 032016-006（UTSW）。

1. 改良增强尿液培养

注意：所有培养步骤必须在无菌条件下进行。对所有器械、溶液和培养基进行灭菌。用70%乙醇清洁工作区域，然后点燃本生灯，并在火焰附近小心操作，以降低污染风险。或者，也可使用II级生物安全柜来维持无菌环境。穿戴适当个人防护装备（PPE），避免接触可能具有致病性的微生物。

  1. 接种甘油保存的尿液及菌落分离
    1. 在室温（RT）下解冻甘油保存的尿液。解冻后，涡旋振荡样品5秒以混匀。在无菌微量离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）将尿液进行1:3和1:30稀释，最终体积为100 µL。
      注：甘油保存的尿液制备方法为：将500 µL未稀释尿液与500 µL 50%无菌甘油混合于冻存管中，并于-80 °C保存。
    2. 使用前将琼脂平板在37 °C预热15分钟。有关适用于常见尿路细菌属的培养基类型和培养条件，请参见图1。接种前通过移液充分混匀稀释后的尿液，取100 µL稀释液接种至目标琼脂平板，使用无菌玻璃珠涂布均匀。另取100 µL 1× PBS稀释液接种至单独平板作为无菌生长对照。
      注：若旨在培养常见尿路致病菌（如Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterococcus faecalis等），建议使用显色琼脂（材料表），因其可便于识别尿路致病菌种（图1）。Colistin Nalidixic Acid（CNA）或MRS琼脂适用于从已知含有革兰阴性尿路致病菌的尿液样本中分离营养要求较高的革兰阳性菌（如Lactobacillus spp.），因为这些苛养菌在非选择性琼脂上可能被竞争抑制。
    3. 将平板倒置，在35 °C下按所需大气环境培养24小时（用于尿路致病菌）或3–5天（用于苛养菌）（图1）。
    4. 培养结束后，从培养箱中取出平板，挑取各平板上呈现独特颜色、形态或溶血模式的菌落。
    5. 使用无菌接种环将细菌菌落重新划线接种至相应的琼脂平板，并在所需大气环境下倒置培养2–5天，以获得分离良好的单菌落。
      注：若使用BAP进行初代培养，在显色琼脂上点种菌落可能有助于了解样本中细菌种群的异质性。
  2. 液体培养基培养及细菌分离株的甘油保存
    1. 获得形态与原始菌落一致的纯菌落后，挑取单个菌落，用无菌接种环接种至3 mL液体培养基中。有关支持常见尿路微生物属生长的培养基类型，请参见图1。用封口膜密封琼脂平板，并于4 °C保存2–4天。将液体培养物在所需大气条件下培养1–5天，直至培养液明显浑浊。
    2. 观察到生长后，涡旋振荡培养物，然后取1 mL过夜培养物加入含有500 µL无菌50%甘油的2 mL冻存管中；密封后轻轻颠倒混匀。每种菌落制备两份甘油保存液（其中一份作为备份），并于-80 °C保存。

2. 通过16S rRNA基因Sanger测序鉴定细菌物种

注意：也可使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）20 来确认微生物的种类。

  1. 菌落聚合酶链式反应（PCR）
    1. 在PCR管中加入12.5 µL的2x Taq聚合酶预混液、0.5 µL的10 µM 8F引物和0.5 µL的10 µM 1492R引物，配制25 µL的PCR反应体系材料表)，以及 11.5 µL 无核酸酶水21.
      注意：若对多个样本进行PCR，需先配制Taq聚合酶混合液、引物和无菌无核酸酶水的反应主混合液，然后将25 µL分装至各PCR管中。
    2. 进行菌落PCR时，使用无菌牙签或移液器吸头从重新划线的平板上挑取分离良好的单菌落，将菌落重悬于步骤2.1.1中配制的PCR反应混合液中，轻轻混匀。短暂离心（2000 × g）使液体集中于离心管底部。 g.
      注意：确保样品中无气泡。设置不含模板的阴性对照（NTC）样品，仅包含PCR反应混合液。
    3. 将样本管放入热循环仪中，运行以下程序：95 °C 预变性 3 min；40 个循环：95 °C 变性 30 s，51 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min 30 s；72 °C 最终延伸 10 min；10 °C 保存。
  2. 凝胶回收与物种鉴定
    1. PCR反应结束后，将PCR产物在含有0.5×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液的1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。在制胶前加入溴化乙锭（EtBr），然后使用可容纳至少20 µL样品体积的梳子制备凝胶。
      警告：溴化乙锭（EtBr）是一种嵌入性试剂，疑似具有致癌性。操作时务必佩戴手套和个人防护装备，并根据机构规定处理含溴化乙锭的材料。
    2. 当凝胶完全凝固后，将其放入盛有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中，并拔去梳子。在第一孔中加入1 kb DNA标记物，随后各孔中加入10–20 µL PCR反应产物。以100–140 V电压电泳至条带分离清晰。在紫外光下观察凝胶，确认在约1.5 kb处出现清晰条带，且该条带在阴性对照（NTC）孔中不存在。
      警告：紫外线对皮肤和眼睛有害，在观察凝胶时应使用适当的防护罩，并穿戴合适的个人防护装备（PPE）。
      注意：某些细菌可能无法成功进行菌落PCR；此时可选择从分离的基因组DNA进行PCR作为替代方案22.
    3. 使用剃刀切下约 1.5 kb 的条带，并将凝胶片段转移至洁净的微量离心管中。随后按照制造商说明书进行凝胶回收操作（材料表). 使用微量分光光度计测定纯化后DNA的浓度。
      注意：浓度 >10 ng/µL 为理想浓度，A260/280 在 1.7–2.0 之间可接受。
    4. 为每个样本准备两组Sanger测序反应，一组使用8F引物，另一组使用1492R引物，均按照所选Sanger测序服务的指南在无核酸酶水中进行。
    5. 测序数据收到后，将DNA序列上传至NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST）网站（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），选择核酸BLAST（blastn），选取rRNA/ITS数据库中的16S核糖体RNA序列（细菌和古菌），运行Megablast程序。可通过与数据库中参考序列最高质量的匹配结果来鉴定分离株。
      ​注意：某些细菌物种的16S rRNA序列具有高度相似性，仅通过此方法可能无法区分。对于同一属内的物种鉴定，需结合DNA同源性分析和生化分析才能可靠区分23.

3. 基因组DNA（gDNA）的提取

注意：本部分使用了文中所引用的基因组DNA提取试剂盒中提供的试剂和离心柱。 材料表 用于从多种细菌物种中高效提取高质量基因组DNA。以下是推荐的修改方案和操作说明。

  1. 按照制造商说明书准备试剂盒试剂。
  2. 通过将细菌从分离良好的单菌落接种至适宜的无菌培养基中，在 图1 所示的温度和大气条件下培养，直至观察到充分生长，制备 3–10 mL 的培养物（图1）。
  3. 培养结束后 ，使用分光光度计测定培养物在 600 nm 处的光密度（OD600）24。
    1. 将过夜培养物按 1:10 比例稀释，制备用于定量的样品；同时设置无菌培养基作为空白对照。通过从样品读数中减去空白读数，并乘以 10 倍稀释系数，计算光密度值。
  4. 根据测得的 OD600 值以及该物种预先建立的 OD600 与 CFU/mL 的换算比例，计算获得 2 × 109 个细胞所需的培养物体积（mL）。
  5. 将所需体积的培养物在 5000 × g 条件下离心 5 分钟以收集菌体沉淀。吸除上清液后，将沉淀重悬于 200 µL 冰冷的 TE 缓冲液中（在实验开始前预先冰上预冷）。
  6. 将样品在 5000 × g 条件下离心 2 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 180 µL 酶解裂解缓冲液（ELB）中，并加入 20 µL 预先煮沸的 RNase A（10 mg/mL）。为有效裂解革兰氏阳性菌，需额外加入 18 µL 的溶菌酶（mutanolysin，25 kU/mL）。充分涡旋混匀后，将样品置于 37 °C 摇床上孵育 2 小时。
    注意：建议使用制造商说明书所述的 ELB 缓冲液，适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的裂解。
  7. 按照制造商说明书继续后续操作。
    注意：如需提高基因组 DNA 产量，可根据需要重复洗脱步骤一至两次。
  8. 按照第 4 节所述方法评估提取的基因组 DNA 质量。若在 1 周内使用，可将 DNA 置于 4 °C 保存；如需长期保存，则应置于 -20 °C。

4. 评估提取的基因组DNA质量

  1. 为了通过凝胶电泳评估质量，按照2.2小节所述制备1%琼脂糖凝胶。在洁净离心管中准备样品：混合1–2 µL提取的gDNA与 在石蜡膜上加入3 µL的2倍上样染料。上样后电泳，然后在紫外光下观察凝胶。
    注意：成功的基因组DNA提取在凝胶顶部可见一条清晰的条带，且拖尾现象极少。图2A）。弥散现象表明DNA发生剪切。如果未观察到基因组DNA条带和/或弥散现象严重，应重新提取基因组DNA。可考虑缩短RNase A和蛋白酶K的孵育时间。若在1.5–3 kb附近出现两条条带，则提示存在RNA污染图2B）。配制新鲜的RNase A并重复提取。
  2. 使用微量分光光度计评估质量，通过微量分光光度计测定基因组DNA（gDNA）浓度及吸光度比值A260/280。浓度 >50 ng/µL，且 A260/280 在 1.7–2.0 之间为可接受范围。
    注意：基因组DNA得率低可能由以下原因导致：起始样本量过低或过高、核酸酶污染、裂解不充分。若吸光度比值超出正常范围，提示存在RNA污染。若基因组DNA质量不佳，应重复提取步骤。
  3. 使用荧光计评估质量时，按照制造商说明，采用高灵敏度检测试剂盒和荧光计仪器对基因组DNA浓度进行定量材料表浓度 >理想的浓度为 50 ng/µL。

5. 双端新一代短读长测序及文库构建

注意：短读长测序可在不同仪器上以不同的读长和方向进行。对于细菌全基因组测序（WGS），推荐使用150 bp（300循环）的双端测序。文库制备和测序均可外包给核心设施或商业实验室。

  1. 根据制造商说明制备测序文库（材料表）。遵循制造商推荐的最终上样文库浓度；但建议进行一项优化：在NextSeq仪器上，将混合文库以上样浓度1.8 pM上样，以获得最佳的测序读长产量。
  2. 尽管为可选步骤，建议使用Bioanalyzer（材料表）评估混合文库的片段分布情况，并确保平均片段长度为600 bp。

6. Nanopore MinION 测序文库制备

  1. 根据制造商的说明书制备测序文库（材料表）。使用两个条形码扩增试剂盒可在单个流动池上实现最多24个样本的多重测序。当进行24个样本的多重测序时，建议将文库制备分为两部分，每次处理12个样本。所有24个样本可按照下述方法合并。
    注意：完成原生条形码连接后，样本可在4 °C下保存过夜——如有需要，这可作为实验流程中的一个暂停点。在文库制备流程的原生条形码连接步骤结束时，建议将每个样本等摩尔量合并，直至达到最大可能的DNA质量（ng）。
    1. 为此，请按照制造商说明使用荧光计（材料表）对条形码连接后的所有样本进行定量。估算双链DNA（dsDNA）浓度最低的样本体积，然后计算该样本中的总dsDNA量。使用此数值确定其余所有待合并样本的等摩尔量。
      注意：由于等摩尔计算会最大化合并后dsDNA的总量，从而产生较高体积的合并液（>65 µL），因此需要进行纯化以浓缩合并液。
  2. dsDNA合并液的纯化与浓缩
    1. 向DNA合并液中加入2.5倍体积的顺磁性磁珠（材料表），轻轻弹击管壁以混匀内容物。将管子置于旋转仪上，在室温下旋转5分钟。在2000 × g 条件下离心，然后将管子置于磁力架上使磁珠沉淀。
    2. 加入250 µL新配制的70%乙醇（使用无核酸酶水配制），注意不要扰动沉淀。吸除乙醇，并重复乙醇洗涤一次。
    3. 第二次吸除乙醇后，在2000 × g 条件下短暂离心，再将管子放回磁力架。用移液器吸除残留乙醇，并让样本干燥约30秒。
    4. 将管子从磁力架上取下，用60–70 µL无核酸酶水重悬沉淀。在室温下孵育2分钟。将样本置于磁力架上直至上清澄清，然后转移上清至新的1.5 mL离心管中。
    5. 使用荧光计对浓缩后的合并液进行定量，然后准备一份用于接头连接步骤的等分样本：最终体积为65 µL，含700 ng样本。将剩余合并液保存于4 °C，用于第二次测序运行，在第一次运行完成后使用。
    6. 按照制造商说明进行接头连接，并将样本加载至流动池。启动测序运行。
      注意：在加载样本前，需从流动池的引物口抽吸空气和约200 µL储存缓冲液。这对流动池的正确引物处理和样本加载至关重要。通过流动池引物口吸取或加入溶液时，请使用P1000移液器及配套吸头。
  3. 根据制造商说明对文库进行测序。
    1. 打开测序操作软件，点击开始。为实验输入名称，建议命名方式包括运行日期和用户姓名。点击继续至试剂盒选择，选择所使用的相应文库制备试剂盒和条形码扩增包，然后点击继续至运行选项。
    2. 如果计划为第二次运行准备足够的文库，则将运行时间调整为48小时（否则保持默认的72小时）。点击继续至碱基识别。
    3. 勾选碱基识别选项配置：快速碱基识别，并确保条形码设置为启用，以便输出的FASTQ文件自动去除条形码序列，并根据条形码将数据拆分为不同的目录。点击继续至输出。
    4. 选择测序数据的保存位置。若仅保存FASTQ输出，预计数据量约为30–50 Gb；若同时保存FAST5输出，则预计数据量超过>500 Gb。如果计划进行第7.2节所述的过滤步骤，请取消勾选过滤选项Qscore: 7 | Readlength: Unfiltered；否则保持勾选，并将Readlength调整为200。
    5. 点击继续至运行设置 并检查所有设置。若设置正确，点击开始；否则点击返回并进行必要的调整。
    6. 如有需要，可根据制造商说明清洗流动池，并用剩余合并液重新加载。在第一次运行完成后且流动池已清洗的情况下，对剩余合并液重复6.2节中的步骤。
      注意：设置第二次运行时，根据制造商建议，对于此前已运行超过48小时的流动池，应将偏置电压调整为-250 mV。

7. 评估与准备测序读段

注意：推荐的目录结构如图4所示。在进行以下计算步骤之前，请先在桌面创建相应的目录，即 Long_Reads、Short_Reads 和 Trimmed_Reads。

  1. 短读长数据（图3）
    注意：短读长数据以 FASTQ 格式生成。每个 FASTQ 文件最多包含 4000 条读长。这些文件通常被压缩（.gz 压缩包）并组织成多个文件。根据测序平台的不同，条形码通常需要被切除。某些程序可直接接受压缩格式文件，而其他程序可能需要在导入前先解压。读长数据必须通过质量控制（QC）步骤，以确保基因组组装过程中的数据准确性。如果无法使用 CLC Genomics Workbench，也可采用其他程序对短读长数据进行修剪和质量控制，例如 Trimmomatic25 或 Trim Galore（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/） 用于修剪，FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/） 用于评估读长质量。建议的平均短读长覆盖度通过将读长数量乘以平均读长长度，再除以基因组大小来估算，应达到>100x。
    1. 打开 Genomics Workbench 软件（材料表），导入所有成对末端的短读长 FASTQ 文件。成对文件将自动生成。
      1. 点击顶部工具栏的 新建 按钮，选择 文件夹... 创建一个新文件夹，用于存储文件。可按需命名，推荐使用样本编号作为命名规范。将后续所有步骤的输出文件均保存至该文件夹中。
      2. 在顶部工具栏中点击 导入 按钮，选择 Illumina... 浏览并选择与样本对应的所有短读长文件。确保选中“成对读长”选项，并取消勾选 移除失败读长 选项。点击 下一步，选择 保存，再次点击 下一步。选择将导入的文件保存至前一步创建的新文件夹中，然后点击 完成。
    2. 为该分离株的所有成对文件创建一个序列列表；这将把读长数据合并为单个文件，便于后续分析。
      1. 在顶部工具栏中点击 新建 按钮，选择 序列列表... 在左侧目录列表中选择要合并的文件，使用箭头将其移至右侧的“已选文件”列表中。点击 下一步，选择 保存，再次点击 下一步。选择保存序列列表的位置，然后点击 完成。
      2. 序列列表生成后，立即使用样本编号重命名。
    3. 对序列列表运行 测序读长质量控制 工具：该步骤将评估短读长高通量测序所产生的读长的整体质量参数。
      1. 在工具箱菜单（左下窗口）中搜索 测序读长质量控制 工具。双击该工具，选择要分析的序列列表，然后点击 下一步。
      2. 确保所有输出选项均已勾选，并在 结果处理 下选择 保存。点击 下一步，指定输出文件的保存位置，然后点击 完成。
    4. 对序列列表运行 修剪读长 工具：修剪将基于质量、长度和模糊碱基进行。此步骤假设测序所用的条形码已在本步骤之前被切除。
      1. 在工具箱（左下窗口）中搜索 修剪读长 工具。双击 修剪读长，选择要分析的序列列表，然后点击 下一步。
      2. 质量修剪：将质量分数阈值设为 0.01，模糊核苷酸数量保持默认值 2。点击 下一步。
        注意：参数可根据用户需求调整；此处为推荐设置。
      3. 取消勾选 自动穿通接头修剪 （仅当在导入 CLC 前已从读长中切除接头时才执行此操作）。点击 下一步，勾选 丢弃长度不足的读长，使用默认值 15。
      4. 点击 下一步，勾选 生成报告，然后选择 保存。点击 下一步，指定输出文件的保存位置。点击 完成。
    5. 导出修剪后的序列列表：后续的混合组装和分析将在 CLC 外完成，因此需要将修剪后的短读长文件导出。
      1. 从左上角的目录导航中选择第 7.1.4 步生成的修剪后文件，然后点击顶部工具栏的 导出 按钮。选择导出文件类型为 Fastq ，点击 下一步。勾选 将成对序列列表导出为两个文件。然后点击 下一步，选择 Trimmed_Reads 目录作为导出目标路径。点击 完成。确保修剪后的短读长文件成功导出为两个文件（R1 和 R2），扩展名为 .fastq。
        注意：修剪后的序列列表必须导出为两个文件，通常由 CLC 标记为 R1 和 R2。这一点至关重要，因为下游的混合组装要求短读长数据以这种形式输入。
      2. 重命名导出的文件，请避免在文件名中使用空格和特殊字符。为简化操作，推荐格式为 trimmed_short_file.R1.fastq。
  2. 长读长（MinION）数据（图3）
    注意：以下用于准备长读长（MinION）测序数据以进行混合组装的流程，使用命令行执行 NanoFilt 和 Nanostat 程序26。在开始前请先安装相关工具，并熟悉 UNIX 基本操作以执行这些命令。推荐使用默认终端和 Bash Shell。有关常见 终端命令和用法的教学指南可参见 Software Carpentry27。以下说明假设生成的文件将使用条形码命名规范（NB01、NB02 等）保存在 Long_Reads 目录中。或者，也可在设置测序运行时使用 MinKNOW 完成读长筛选。建议的平均长读长覆盖度为>100x。建议的平均读长长度为>2000 bp；因此，所需长读长的数量少于短读长。
    1. 在 Long_Reads 目录中为测序运行中使用的每个条形码创建新目录（barcode01、barcode02 等）（图4）。将每个条形码对应的 .fastq 文件复制到相应文件夹中。合并每次运行中每个条形码的所有 .fastq 文件。
    2. 打开 终端 ，使用 cd 命令进入 Long_Reads 目录下的条形码子目录：cd Desktop/Long_Reads/barcode01
    3. 通过执行以下命令将每个条形码的所有 .fastq 文件合并为单个 .fastq 文件：cat *.fastq > NB01.fastq
      注意：该命令将所有 FASTQ 文件中的读长合并为一个名为 NB01.fastq 的大型单一 FASTQ 文件。
    4. 执行以下命令，使用 NanoStat 评估样本的读长质量：NanoStat --fastq NB01.fastq
    5. 将输出结果复制到文本文件或 Word 文档中，以便后续参考。
    6. 执行以下命令，使用 NanoFilt 筛选 MinION 读长，剔除质量值 Q < 7 或长度 < 200 的读长：NanoFilt -q 7 -l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz
    7. 对第 7.2.6 步生成的修剪后文件运行 NanoStat，执行命令： NanoStat --fastq NB01 _trimmed.fastq.gz
    8. 将结果复制到文本或 Word 文件中，并与第 7.2.4 步的结果进行比较，以确认筛选成功（表1）。
    9. 对测序运行中使用的所有条形码重复执行第 7.2.2 至 7.2.8 步。
      ​注意：第 7.2.6 步生成的 NB01_trimmed.fastq.gz 文件将用于混合组装。

8. 生成杂合基因组组装

注意：以下组装流程使用 Unicycler19,28,29,30 来整合第 7.1 和 7.2 节中制备的短读长和长读长数据（图 3）。请安装 Unicycler 及其依赖程序，并执行以下命令。为简化起见，假设在步骤 7.1.5 中导出的短读长文件命名为 trimmed_short_file.R1.fastq 和 trimmed_short_file.R2.fastq。

  1. 将短读长文件和长读长文件整理到一个名为 Trimmed_Reads 的目录中。该目录必须包含以下内容：
    1. 一个用于修剪后长读长的 .fastq.gz 文件（在步骤 7.2.6 中生成）。
    2. 两个用于修剪后短读长的 .fastq 文件（R1 和 R2，于步骤 7.1.5 中生成）。
  2. 使用终端中的 cd 命令进入存储读长文件的 Trimmed_Reads 目录：cd Desktop/Trimmed_Reads
    1. 进入正确目录后，执行以下命令将两个短读长文件压缩，使其也转换为 .fastq.gz 格式：gzip trimmed_short_file.R1.fastq
  3. 对 R1 和 R2 均重复步骤 8.2。检查所有读长文件是否均已为 .fastq.gz 格式，并确认所有文件对应同一菌株。
  4. 通过运行以下命令，使用 Unicycler 开始混合组装：
    unicycler -1 trimmed_short_file.R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file.R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directory
    ​注意：-o 指定 Unicycler 输出结果的保存目录，Unicycler 将在执行命令时自动创建该目录；请勿预先手动创建该目录。运行时间取决于所用计算机的计算能力、基因组大小以及读长数量，可能需要 4 小时至 1 或 2 天不等。本方案在一台配备 250 Gb 内存、2.5 GHz 12 核（48 个虚拟核）Intel Xeon (R) CPU 的 CentOS Linux 7 系统上完成。也可使用配备 16 Gb 内存和 2.6 GHz 6 核处理器的个人计算机进行计算，但处理时间将更长。
  5. 运行完成后，查看 unicycler.log 文件以确认无错误，并记录生成的重叠群（contig）的数量、大小及其状态（完整、不完整）。
    1. 若发现不完整重叠群（在 Unicycler 日志中被标记为 incomplete），则通过在步骤 8.4 的命令中添加以下参数，以“bold”模式重新运行 Unicycler：--mode bold。
      ​注意：bold 模式会降低组装过程中对长读长连接桥接的质量阈值；这可能获得完整的组装结果，但组装质量可能下降。建议仅在必要时使用 bold 模式，并将其结果作为初步证据，后续需通过 PCR 验证重叠群的连接。

9. 评估组装质量

注意：以下实验方案使用 Bandage31 和 QUAST32 两个程序，这两个程序必须在使用前完成设置（图 2 和 图 4）。Bandage 下载后无需安装，而 QUAST 需要掌握基本的命令行操作。此外，建议使用通用单拷贝直系同源基因评估（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs, BUSCO）33 来评估基因组的完整性。

  1. Bandage：点击 文件，然后选择 加载图谱，并选中在步骤 8.4 中由 Unicycler 生成并保存在 unicycler_output_directory 目录中的 assembly.gfa 文件。加载完成后，点击左侧工具栏上的 绘制图谱 按钮，查看重叠群（称为节点）之间的连接和组织方式，以评估组装是否完整（图 5）。
    注意：完整的组装表现为单个首尾相连的环状重叠群（图 5A、B）；不完整的组装则包含多个连接在一起的重叠群，或呈线性结构（图 5C）。较小的线性重叠群可能并非不完整，而可能代表线性质粒或其他线性染色体外元件。覆盖度（也称为深度）将在 Bandage 中标出，表示各重叠群相对于染色体的相对丰度，该值已在 Unicycler 中标准化为 1x。
  2. QUAST
    1. 在终端中，使用 cd 命令进入存储 Unicycler 输出结果的文件夹：cd Desktop/Trimmed_Reads/unicycler_output_directory
      ​注意：组装文件所在路径中不允许包含空格，即通往 Unicycler 输出目录的任何文件夹名称中均不能含有空格。或者，可将 assembly.fasta 文件复制到桌面以便快速访问。
    2. 通过执行以下命令运行 QUAST：quast assembly.fasta -o quast_output_directory
    3. 查看 QUAST 在输出目录 quast_output_directory 中生成的报告。

10. 基因组注释

注意：以下注释流程使用 Prokka34，这是一种必须在使用前安装的命令行工具。或者，可通过自动化图形用户界面 K-Base（材料表）使用 Prokka，或通过网络服务器 RAST35 进行基因组注释。若将基因组提交至 NCBI，将使用原核基因组注释流程（PGAP）36 自动进行注释。

  1. 使用 cd 命令在终端中导航至存储 Unicycler 输出结果的文件夹（参见步骤 9.2.1）。然后通过执行以下命令运行 Prokka：prokka --prefix sample_ID --outdir prokka_output_directory assembly.fasta
    注意：--prefix 将根据指定的 sample_ID 为所有输出文件命名；--outdir 将创建一个指定名称的输出目录，用于保存所有 Prokka 输出文件；请勿预先手动创建 Prokka 的输出目录。
  2. 通过打开 .tsv 表格文件，或上传生成的 .gff 文件至序列分析软件中，以可视化并分析注释结果（图 6）。
  3. 可根据感兴趣的遗传因素生成特定类型的注释。建议首先使用基因组流行病学中心（www.genomicepidemiology.org/）网站服务器上易于操作的工具进行初步分析37,38,39,40,41。此外还可使用其他工具检测 CRISPR-cas 系统和前噬菌体（图 3）42,43。

11. 数据民主化的建议实践

  1. 在可能的情况下，将所有原始测序数据以及组装后的基因组存入公共数据库，例如美国国家生物技术信息中心（NCBI）的序列读取存档（SRA）和Genbank。在NCBI提交过程中，基因组将通过PGAP流程自动完成注释。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案已针对属于下述属的尿液细菌的培养与测序进行了优化 图1并非所有尿液中的细菌都能通过此方法培养。培养基和培养条件根据菌属的不同而有所规定。 图1. 典型的基因组DNA完整性凝胶电泳评估结果如图所示 图2测序读长处理、基因组组装和注释的生物信息学分析流程概述如以下所述。 图3. 计算目录结构的指南见于 图4 以简化对实验方案的理解，并为成功开展实验提供框架。此外，还包括两种克雷伯菌的代表性完整基因组 spp., K. pneumoniae 和 K. oxytoca，由本方案生成。这些组装产物的示意图如下所示 图5 还包括一个额外的不完整示例 K. pneumoniae 基因组。每个完全注释的完整基因组的详细概述如下所示 图6最后，提供了测序读长统计信息的汇总。 表1 以全面理解原始数据和修剪后数据，足以生成高质量的闭环基因组组装。此外，还包括两种代表性完整肺炎克雷伯菌的关键参数 种（复数形式）基因组已列出。基因组和原始数据已存入GenBank，登录号为BioProject PRJNA683049。

细菌生长条件比较图表；厌氧、常温环境；琼脂、肉汤培养基类型。
图1：多种尿源性菌属的改良增强尿液培养方法。 用于培养多种尿源性菌属的琼脂和液体肉汤培养基示意图。所有培养均建议在35 °C下进行，具体如1.1节所述。圆圈表示适用于特定菌属培养的培养基，颜色为任意选择，以便区分不同类型的培养基。CDC-AN BAP（红色），CDC厌氧羊血琼脂；5% Sheep-BAP（橙色），羊血琼脂；BHI（绿色），脑心浸液培养基；TSB（黄色），胰蛋白胨大豆肉汤；CHROMagar Orientation（蓝色）。aGardnerella vaginalis 应在微需氧环境下使用HBT双层G. vaginalis选择性琼脂及特殊肉汤培养条件进行培养44。 bLactobacillus iners 应在微需氧环境下使用5%兔血琼脂（Rabbit-BAP）平板和NYCIII肉汤进行培养。 cLactobacillus spp. 可在微需氧条件下使用MRS培养基进行培养。 请点击此处查看该图的放大版本。

电泳凝胶示意图，DNA分离结果，比较样本A1-3和B1-3。
图2：基因组DNA提取琼脂糖凝胶图像。 代表性凝胶图像展示gDNA提取结果。（A）泳道1：1 kb DNA标记，泳道2：完整gDNA，表示提取成功，泳道3：弥散条带，提示gDNA发生片段化。（B）泳道1：1 kb DNA标记，泳道2和3：在1.5 kb至3 kb之间出现两条条带，提示存在rRNA污染。请点击此处查看该图的放大版本。

基因组组装工作流程图；包括测序质控、混合从头组装、评估和注释。
图3：混合基因组组装工作流程。从读段质量控制与预处理到组装注释的各步骤示意图。读段修剪可去除不确定和低质量的读段。图中标明了Q值和长度参数，代表被保留的读段。组装过程同时利用短读段和长读段生成混合的de novo基因组组装结果。通过指定工具和参数，基于完整性和准确性对组装质量进行评估。最终的基因组组装结果对所有基因及特定感兴趣位点进行注释。请点击此处查看该图的放大版本。

生物信息学工作流程图：原始测序数据处理与分析的文件组织。
图 4：生物信息学目录结构指南。 本图示展示了短读长和长读长数据处理、混合组装以及基因组注释与质量控制过程中推荐使用的目录和文件组织方式。关键的命令行数据处理步骤在相应文件和目录旁进行了标注。其中突出显示了命令和参数（粗体）、输入文件（蓝色）、输出文件或目录（红色）、用户输入（如文件命名规范，洋红色）。请点击此处查看此图的放大版本。

基因组组装示意图：染色体、质粒图谱、序列长度；比较分析。
图 5：通过 Bandage 生成的基因组组装图。 代表性完整基因组组装图包括（A）Klebsiella oxytoca KoPF10 和（B）Klebsiella pneumoniae KpPF25，以及不完整的基因组组装图（C）Klebsiella pneumoniae KpPF46。KoPF10 的完整基因组显示为一条闭合的染色体，KpPF25 的完整基因组由一条闭合染色体和五个闭合质粒组成。KpPF46 的不完整染色体由两个相互连接的重叠群（contig）构成。Unicycler 混合 de novo 组装生成的组装图由 Bandage 可视化呈现。该组装图以简化的示意图形式展示基因组结构，通过连接单个重叠群两端的连接线来表示闭合的染色体或质粒。若存在多个相互连接的重叠群，则表明组装不完整。在 Bandage 中还可观察重叠群的大小和测序深度。请点击此处查看此图的放大版本。

环形基因组图谱、rRNA、tRNA位置；染色体、质粒图谱、遗传分析。
图6：注释后的杂合组装完整基因组图谱。 由Geneious Prime生成的完整基因组组装图谱，分别展示（A）K. oxytoca KoPF10 和（B）K. pneumoniae KpPF25 的注释基因，以沿质粒骨架分布的彩色箭头表示。为简化图示，染色体上仅显示rRNA和tRNA基因。基因组注释按照本实验方案第10节所述，使用Prokka完成。请点击此处查看该图的放大版本。

Genome sequencing data table showing strain, accession numbers, read depth, MLST, and GC content.
表1：代表性克雷伯菌 种（spp）完整的组装特征 组装参数 K. oxytoca 菌株 KoPF10 和 K. pneumoniae 菌株 KpPF25。在 NCBI 上提交数据的登录号已提供。两种测序技术在修剪前后读段数量均已注明。N50 仅针对长读段提供，因为短读段长度是固定的。质粒复制子使用 PlasmidFinder v2.1 的 Enterobacteriaceae 数据库预测，参数设置为 80% 相似性和 60% 覆盖度。 a MLST，多位点序列分型。 b CDS，编码序列。 c 使用PlasmidFinder v2.1的Enterobacteriaceae数据库，以80%序列一致性与60%覆盖长度为参数，预测质粒复制子类型。 d Oxford Nanopore Technologies (ONT) 存入的测序读长数据 e Illumina 测序读长数据 请点击此处下载此表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述的综合性杂合基因组组装方案提供了一种简化的流程，可用于成功培养多种尿液微生物群和尿路致病菌，并完成其基因组的完整组装。细菌基因组的全基因组测序（WGS）始于多样且有时难以培养的微生物的分离，以提取其基因组DNA。迄今为止，现有的尿液培养方案要么缺乏检测多种尿液菌种所需的灵敏度，要么涉及耗时较长且复杂的操作，需要大量时间和资源11。本文描述的改良增强型尿液培养方法提供了一种简化而全面的方案，可成功分离属于17种常见尿液细菌属的细菌，包括潜在致病菌或有益的共生菌，以及兼性或专性需氧菌和厌氧菌。这为细菌基因组的精确测序与组装，以及关键的表型实验提供了必要的起始材料，有助于深入理解泌尿系统健康与疾病。此外，这种改良的培养方法可更明确地实现对尿液样本中可存活微生物的临床诊断，并支持其生物样本保藏，以用于未来的基因组学研究。然而，该方案也存在一定的局限性。根据具体微生物的不同，可能需要较长的孵育时间，并依赖缺氧培养箱或可控温培养箱等未必普遍可用的资源。使用厌氧GasPak可作为替代方案，但成本较高，且无法始终维持稳定可控的环境。最后，由于培养过程中的选择性偏倚以及样本多样性差异，某些特定微生物或尿路致病菌可能在培养中占据优势，从而抑制难养菌的生长。尽管存在这些局限性，该方法仍使得多种尿液细菌的培养成为可能。

随着新一代测序技术的发展，基因组测序日益普及，这些技术极大地提高了测序数据的产量和准确性14,15。结合数据处理和从头组装（de novo assembly）算法的进步，完整的基因组序列已触手可及，无论是新手还是经验丰富的科研人员均可获得15,45。完整基因组所提供的整体基因组结构信息能够带来重要的进化和生物学见解，包括基因重复、基因丢失以及水平基因转移14。此外，与抗菌耐药性和毒力相关的重要基因通常位于可移动遗传元件上，而这些元件在草图基因组组装中通常无法被准确解析15,16。

本方案采用一种混合策略，结合短读长和长读长测序平台的测序数据，以生成完整的基因组组装结果。尽管本方案主要针对尿液来源的细菌基因组，但也可根据需要调整用于来自不同分离来源的多种细菌。该方法中的关键步骤包括严格遵循无菌操作技术，并使用适当的培养基和培养条件以分离纯化的尿液细菌。此外，提取完整且高产量的基因组DNA（gDNA）对于获得无污染序列读段的测序数据至关重要，可避免因污染读段干扰而导致组装失败。后续的文库制备流程对于生成足够长度和测序深度的高质量读段同样至关重要。因此，在文库构建过程中尤其需要小心处理gDNA，特别是用于长读长测序时，因为该技术的最大优势在于能够产生无理论长度上限的长读段。本文还概述了测序读段适当的质量控制（QC）步骤，以去除噪声数据并提高基因组组装效果。

尽管DNA提取、文库制备和测序已成功完成，某些物种的基因组结构特性仍可能成为获得完整闭合基因组组装的障碍45,46。重复序列常常使组装计算复杂化，即使使用长读长数据，这些区域也可能仅以低置信度被解析，甚至完全无法解析。因此，长读长的平均长度通常需超过基因组中最长的重复区域，或测序深度必须足够高（>100x）19。某些基因组可能仍不完整，需要通过人工方法完成补全。然而，混合组装获得的不完整基因组通常比短读长草图基因组包含更少的重叠群（contig）。调整组装算法的默认参数，或对测序读段的质量控制采用更严格的截断标准，可能有助于改善组装结果。另一种建议的方法是将长读长序列比对到不完整的区域，寻找最可能组装路径的证据，然后通过PCR扩增目标区域并进行Sanger测序来验证该路径。建议使用Minimap2进行读段比对，而Bandage则提供了一种有效工具，可用于可视化比对到已组装重叠群上的读段，从而为重叠群之间的连接关系提供证据47。

获得完整基因组的另一个挑战在于对命令行工具的熟悉程度和使用熟练度。许多生物信息学工具的开发旨在为所有用户提供计算分析的机会；然而，这些工具的使用依赖于对 UNIX 基础知识和编程的基本理解。本实验方案旨在提供足够详细的指导，使无命令行使用经验的人员也能够完成闭环基因组组装并进行注释。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢Moutusee Jubaida Islam博士和Luke Joyce博士对本实验方案的贡献。我们还要感谢德克萨斯大学达拉斯分校基因组中心提供的反馈与支持。本研究由Welch基金会资助（授予N.J.D.的奖项编号为AT-2030-20200401），美国国立卫生研究院资助（授予K.P.的奖项编号为R01AI116610），以及由P.E.Z.担任的Felecia and John Cain女性健康讲席基金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>设备：
Bioanalyzer 2100安捷伦G29398A可选但推荐
离心Eppendorf--可用于离心锥形管和微量离心管的任何离心机（例如型号 5810R/5424R）
电泳伯乐生命科学公司1645070
凝胶成像系统伯乐生命科学公司ChemiDoc 型号
培养箱赛默飞世尔科技--任何 CO2 培养箱（例如 Thermo Forma model 3110）
磁力架New England BioLabsS1509512孔试管架
MinIONOxford Nanopore Technologies--
Nanodrop赛默飞世尔科技ND-ONE-W
NextSeq 500IlluminaSY-415-1002其他 Illumina 型号也可接受
酶标仪BioTek--Synergy H1
Qubit 荧光仪赛默飞世尔科技Q33238
旋转器Benchmark ScientificH2024
PCR仪赛默飞世尔科技--用于PCR反应的任何热循环仪（例如ProFlex PCR系统）
<强>材料：
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP3991
10X TBE 缓冲液----1M Tris，1M 硼酸，0.2M EDTA（pH 8.0）
1429R 引物Sigma Aldrich（定制寡核苷酸）--GGTTACCTTGTTACGACTT
1kb LadderVWR101228-494
1 M Tris-Cl（pH 7.5）赛默飞世尔科技15567027
6x 上样缓冲液Fisher ScientificNC0783588
8F 引物Sigma Aldrich（定制寡核苷酸）--AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
琼脂Fisher ScientificBP1423-2
琼脂糖伯乐生命科学公司63001
AMPure XP 磁珠贝克曼库尔特A63880
厌氧袋系统 - GasPak EZBD诊断系统B260683
硼酸Fisher ScientificA73-500
脑心浸液肉汤BD 诊断系统212304
CDC厌氧菌5%羊血琼脂BD诊断系统L007357
CHROMagar 显色培养基用于尿液菌群鉴定BD诊断系统PA-257481.04
DNeasy 血液 &和组织QIAGEN69504
DreamTaq预混液赛默飞世尔科技K1081
干燥厌氧指示条BD诊断系统271051
EDTAFisher ScientificS311-500
乙醇 200 ProofSigma AldrichE7023用于分子生物学
溴化乙锭赛默飞世尔科技BP130210
流动池预处理试剂盒Oxford Nanopore TechnologiesEXP-FLP002
流动池清洗试剂盒Oxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH003
凝胶回收小提试剂盒BioBasicBS654
连接测序试剂盒Oxford Nanopore TechnologiesSQK-LSK109
溶菌酶Research Products International CorpL381005.05
溶菌酶Sigma AldrichM9901-5KU
原生条形码扩展 1-12Oxford Nanopore TechnologiesEXP-NBD104
NEB 平末端/TA 连接酶预混液New England BioLabsM0367L
NEBNext FFPE DNA修复混合液New England BioLabsM6630L
NEBNext快速连接缓冲液New England BioLabsB6058S
NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块New England BioLabsE7546L
Nextera DNA CD IndexesIllumina20018708
Nextera DNA Flex 文库构建 - (M) 标签化剪切Illumina20018705
无核酸酶水Sigma AldrichW4502
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒赛默飞世尔科技Q33230
Qubit 检测管赛默飞世尔科技Q32856
快速T4 DNA连接酶New England BioLabsE6056L
R9 流动池Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN106D
RNase A赛默飞世尔科技EN0531
绵羊血止血实验室DS13250
TE缓冲液----10 mM Tris，1 mM EDTA（pH 8.0）
Triton X-100Sigma AldrichT8787
胰蛋白胨大豆肉汤BD诊断系统211825
<强>软件 &与生物信息学工具：
绷带----https://rrwick.github.io/Bandage/
基因组流行病学中心----http://www.genomicepidemiology.org/
CLC Genomics Workbench 12QIAGEN--
CRISPRcasFinder----https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/
FastQC----https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Geneious PrimeGeneious--
gVolante（BUSCO）----https://gvolante.riken.jp/
Kbase Prokka 封装器----https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release
Minimap2----https://github.com/lh3/minimap2
MinKNOWOxford Nanopore Technologies--
NanoFilt----https://github.com/wdecoster/nanofilt
NanoStat----https://github.com/wdecoster/nanostat
PHASTER----https://phaster.ca/
Prokka----https://github.com/tseemann/prokka
QUAST----http://quast.sourceforge.net/quast
Trim Galore----https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
Trimmomatic----http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Unicycler----https://github.com/rrwick/Unicycler#必要的读长

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brubaker, L., Wolfe, A. The urinary microbiota: a paradigm shift for bladder disorders. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 28 (5), 407-412 (2016).
  2. Neugent, M. L., Hulyalkar, N. V., Nguyen, V. H., Zimmern, P. E., De Nisco, N. J. Advances in understanding the human urinary microbiome and its potential role in urinary tract infection. mBio. 11 (2), (2020).
  3. Klein, R. D., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: microbial pathogenesis, host-pathogen interactions and new treatment strategies. Nature Reviews. Microbiology. 18 (4), 211-226 (2020).
  4. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), 83637(2013).
  5. Reitzer, L., Zimmern, P. Rapid growth and metabolism of uropathogenic Escherichia coli in relation to urine composition. Clinical Microbiology Reviews. 33 (1), 00101-00119 (2019).
  6. Snyder, J. A., et al. Transcriptome of uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infection. Infection and Immunity. 72 (11), 6373-6381 (2004).
  7. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 14(2016).
  8. Babikir, I. H., et al. The impact of cathelicidin, the human antimicrobial peptide LL-37 in urinary tract infections. BMC Infectious Diseases. 18 (1), 17(2018).
  9. Jancel, T., Dudas, V. Management of uncomplicated urinary tract infections. The Western Journal of Medicine. 176 (1), 51-55 (2002).
  10. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T. 40 (4), 277-283 (2015).
  11. Price, T. K., et al. The clinical urine culture: Enhanced techniques improve detection of clinically relevant microorganisms. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1216-1222 (2016).
  12. Kass, E. H. Asymptomatic infections of the urinary tract. Transactions of the Association of American Physicians. 69, 56-64 (1956).
  13. Garcia, L. S. Clinical microbiology procedures handbook. 3rd edn. , ASM Press. (2010).
  14. Fraser, C. M., Eisen, J. A., Nelson, K. E., Paulsen, I. T., Salzberg, S. L. The value of complete microbial genome sequencing (you get what you pay for). Journal of Bacteriology. 184 (23), 6403-6405 (2002).
  15. Chen, Z., Erickson, D. L., Meng, J. Benchmarking hybrid assembly approaches for genomic analyses of bacterial pathogens using Illumina and Oxford Nanopore sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 631(2020).
  16. Greig, D. R., Dallman, T. J., Hopkins, K. L., Jenkins, C. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of bacterial antibiotic resistance determinants in a multidrug-resistant strain of enteroaggregative Escherichia coli. Microbial Genomics. 4 (10), 000213(2018).
  17. Carraro, D. M., et al. PCR-assisted contig extension: stepwise strategy for bacterial genome closure. Biotechniques. 34 (3), 626-628 (2003).
  18. Tettelin, H., Radune, D., Kasif, S., Khouri, H., Salzberg, S. L. Optimized multiplex PCR: efficiently closing a whole-genome shotgun sequencing project. Genomics. 62 (3), 500-507 (1999).
  19. Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L., Holt, K. E. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Computational Biology. 13 (6), 1005595(2017).
  20. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791(2015).
  21. Turner, S., Pryer, K. M., Miao, V. P., Palmer, J. D. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 46 (4), 327-338 (1999).
  22. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  23. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  24. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Science Reports. 6, 38828(2016).
  25. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  26. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34 (15), 2666-2669 (2018).
  27. Wilson, G., et al. The UNIX Shell. Zenodo. , (2019).
  28. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  29. Vaser, R., Sovic, I., Nagarajan, N., Sikic, M. Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads. Genome Research. 27 (5), 737-746 (2017).
  30. Walker, B. J., et al. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 9 (11), 112963(2014).
  31. Wick, R. R., Schultz, M. B., Zobel, J., Holt, K. E. Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics. 31 (20), 3350-3352 (2015).
  32. Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N., Tesler, G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 29 (8), 1072-1075 (2013).
  33. Simao, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31 (19), 3210-3212 (2015).
  34. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  35. Aziz, R. K., et al. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 9, 75(2008).
  36. Tatusova, T., et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6614-6624 (2016).
  37. Carattoli, A., Hasman, H. PlasmidFinder and In Silico pMLST: Identification and Typing of Plasmid Replicons in Whole-Genome Sequencing (WGS). Methods in Molecular Biology. 2075, 285-294 (2020).
  38. Carattoli, A., et al. In silico detection and typing of plasmids using PlasmidFinder and plasmid multilocus sequence typing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 3895-3903 (2014).
  39. Larsen, M. V., et al. Multilocus sequence typing of total-genome-sequenced bacteria. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1355-1361 (2012).
  40. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  41. Joensen, K. G., et al. Real-time whole-genome sequencing for routine typing, surveillance, and outbreak detection of verotoxigenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. 52 (5), 1501-1510 (2014).
  42. Arndt, D., et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44 (1), 16-21 (2016).
  43. Couvin, D., et al. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Research. 46 (1), 246-251 (2018).
  44. Totten, P. A., Amsel, R., Hale, J., Piot, P., Holmes, K. K. Selective differential human blood bilayer media for isolation of Gardnerella (Haemophilus) vaginalis. Journal of Clinical Microbiology. 15 (1), 141-147 (1982).
  45. Nagarajan, N., Pop, M. Sequence assembly demystified. Nat Reviews. Genetics. 14 (3), 157-167 (2013).
  46. Phillippy, A. M., Schatz, M. C., Pop, M. Genome assembly forensics: finding the elusive mis-assembly. Genome Biology. 9 (3), 55(2008).
  47. Wick, R. R. Unicycler Wiki. , Available from: https://github.com/rrwick/Unicycler/wiki (2017).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Nanopore

相关文章