本方案描述了一种高效且可重复的小鼠脑组织学研究方法，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。
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摘要
摘要
小鼠脑组织的免疫组织化学染色是神经科学领域常用的一种常规技术，用于研究调控能量代谢及其他神经生物学过程的中枢机制。然而，不同实验室之间脑组织学结果的质量、可靠性和可重复性可能存在差异。针对每次染色实验，均需根据物种、组织类型、靶蛋白以及试剂工作条件的差异，对关键步骤进行优化。本文详细展示了一套可靠的实验流程，包括主动脉内灌注、脑组织切片、游离漂浮式免疫染色、组织贴片及成像，可供本领域研究人员便捷地参考和实施。
此外，还讨论了如何修改这些步骤以满足研究人员的个性化需求。为了说明本方案的可靠性和高效性，使用生物素标记的紫藤花凝集素（WFA）对小鼠脑组织中的神经元周网进行染色，并使用抗精氨酸加压素（AVP）抗体对AVP进行染色。最后，本文阐述了整个操作流程中的关键细节，并比较了本方案相较于其他方案的优势。综上所述，本文提供了一种优化的小鼠脑组织游离免疫染色方案。遵循该方案可帮助初级和资深科研人员更便捷地提升免疫染色研究的质量、可靠性和可重复性。
引言
肥胖症及其相关合并症的流行率已达到流行病水平，造成了巨大的社会经济负担1,2。为了更好地理解导致肥胖的生物学过程，已开发出多种小鼠模型3,4。由于中枢机制在这些动物模型的能量稳态调节中具有重要作用，小鼠脑部的神经解剖学研究已成为该领域的必要技术。然而，由于多种因素（如抗体、组织、处理方法、物种和研究目标）的影响，不同实验室之间甚至同一实验室内的研究人员之间，脑组织学技术的质量、可靠性和可重复性存在显著差异。因此，有必要建立一套通用的小鼠脑组织学研究方案，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。同时，初学者可以快速学习、掌握并根据自身需求调整该方案。
免疫组织化学染色是一种成熟的方法，已广泛用于在多种组织（如脑组织和外周组织）中可视化特定细胞类型、mRNA 和蛋白质5,6更具体而言，可通过特异性的一抗和与酶（如显色免疫组织化学中的酶）或荧光染料（异硫氰酸荧光素）偶联的相应二抗来标记目标抗原。6以这些技术的应用为例，对弓状核中的β-内啡肽［前阿黑皮素原（POMC）编码的一种....
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方案
本研究使用了两种性别的 C57BL/6J 小鼠（8-16 周龄）。所有动物的护理和实验程序均经贝勒医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 灌注
注意：步骤 1.1 - 1.6 需在通风橱中进行。
- 麻醉
- 将 5 mL 异氟烷（参见材料表）倒入置于干燥器底部的纸巾上。将小鼠 放入干燥器内带孔的隔板上 ，等待其呼吸迹象消失。
注意：在呼吸停止后，小鼠 仍会短暂维持心跳，灌注操作应在心跳消失前完成。 - 操作前需确认小鼠对脚趾夹捏无反射反应。
- 用针穿过每只脚将小鼠固定在泡沫板上。确保泡沫板放置于托盘中，以收集溢出的液体。
- 将 5 mL 异氟烷（参见材料表）倒入置于干燥器底部的纸巾上。将小鼠 放入干燥器内带孔的隔板上 ，等待其呼吸迹象消失。
- 暴露心脏
- 沿胸腹部中线做一纵向浅表切口，将皮肤向两侧推开，暴露胸腹部的肌层。随后切开肌层，暴露肝脏和肠管。最后用剪刀剪开肋骨，打开胸腔，暴露心脏和肺。使用止血钳将肋骨向两侧拉开，以扩大操作区域。
- 终末血液采集（可选）
- 将 1 mL 注射器（参见材料表）小心插入心脏右心房，直至针尖完全进入。固定注射器，缓慢抽吸血液，直至达到所需体积。<....
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结果
本方案的流程图简要展示于图1中。本实验室的冷冻切片操作流程见图2A，其中同时对5个脑组织样本进行了切片。脑切片的贴片过程如图2B所示，完整贴附脑切片的载玻片示意图见图2C。在图3中，展示了小鼠脑切片经WFA与AVP共染色后在Bregma -0.82 mm位置的代表性荧光免疫组织化学图像，包括低倍和高倍放大图像。AVP信号主要出现在室旁核和视上核，WFA信号则出现在下丘脑前部的室周区以及网状核区域。
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讨论
本方案为小鼠脑组织的神经解剖学研究提供了一种成熟的方法，包括灌注、组织切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。然而，为获得稳定且可靠的结果，必须优化若干关键细节。
灌注质量对于成功染色至关重要。如果脑组织中残留血液，可能会影响染色结果，因为血细胞（例如红细胞）可能产生人为的“阳性”染色信号10。我们通过观察肝脏是否呈现棕灰色来判断灌注质量，该颜色特征通常表明灌注充分，可获得无血的脑组织。本方案中使用的自动灌注泵有助于在较短时间内成功完成单只动物的灌注。固定不足会导致后续步骤中脑组织切片柔软且易碎，而过度固定则会因甲醛对蛋白质的交联作用增强，降低抗原反应的敏感性。我们测试了不同条件，发现小鼠脑组织在4 °C下过夜固定即可满足后固定要求。除本方案所用的10%中性缓冲福尔马林（NBF）作为固定液外，含4%（w/v）新鲜配制的多聚甲醛（PFA）的PBS溶液也广泛用于组织固定11。
关于冷冻切片，切片厚度需根据具体实验需求来决定。例如，RNA.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（CW 获资助号 K01DK119471；YX 获资助号 P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480 和 R01DK120858）、美国农业部/CRIS（YX 获资助号 51000-064-01S）以及美国心脏协会博士后奖学金（LT 获资助号 #829565）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Flour 594 驴抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% 蔗糖 | VWR | 470302 | 将30 g蔗糖溶解于100 mL PBS中 |
| 中性缓冲福尔马林 | VWR | 16004-128 | 10%，25 °C，pH 6.8–7.2 |
| 1 mL 皮下注射器 | BD | 309597 | |
| 48孔细胞培养板 | Corning | 3548 | |
| 6孔细胞培养板 | Corning | 3516 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 可高压灭菌的塑料干燥器 | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP抗体 | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| 细胞滤网 | Corning | 431752 | |
| 冷冻保护液缓冲液 | 用户自选 | 不适用 | 20% 甘油、30% 乙二醇和50% PBS |
| 异氟烷 | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX 显微镜 | Leica | 不适用 | |
| 显微镜载玻片盒（50片装） | VWR | 不适用 | |
| PBT | 用户自选 | 不适用 | 将2.5 mL Triton X-100溶解于1000 mL PBS中 |
| Perfusion two 自动灌流系统 | Leica | 39471005 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C，pH 7.3–7.5，1x浓度：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，9.8 mM 磷酸盐缓冲液 |
| 滑动式切片机 Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| 氯化钠 | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%，25 °C，pH 7.4 |
| 链霉亲和素蛋白，DyLight 488标记 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA抗体 | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 扫描仪 | Zeiss | 不适用 | |
| Zen 3.1 软件 | 扫描仪软件 |
参考文献
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The Am....
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重印与许可
