本方案描述了一种高效且可重复的小鼠脑组织学研究方法，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。
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摘要
摘要
小鼠脑组织的免疫组织化学染色是神经科学领域常用的一种常规技术，用于研究调控能量代谢及其他神经生物学过程的中枢机制。然而，不同实验室之间脑组织学结果的质量、可靠性和可重复性可能存在差异。针对每次染色实验，均需根据物种、组织类型、靶蛋白以及试剂工作条件的差异，对关键步骤进行优化。本文详细展示了一套可靠的实验流程，包括主动脉内灌注、脑组织切片、游离漂浮式免疫染色、组织贴片及成像，可供本领域研究人员便捷地参考和实施。
此外，还讨论了如何修改这些步骤以满足研究人员的个性化需求。为了说明本方案的可靠性和高效性，使用生物素标记的紫藤花凝集素（WFA）对小鼠脑组织中的神经元周网进行染色，并使用抗精氨酸加压素（AVP）抗体对AVP进行染色。最后，本文阐述了整个操作流程中的关键细节，并比较了本方案相较于其他方案的优势。综上所述，本文提供了一种优化的小鼠脑组织游离免疫染色方案。遵循该方案可帮助初级和资深科研人员更便捷地提升免疫染色研究的质量、可靠性和可重复性。
引言
肥胖症及其相关合并症的流行率已达到流行病水平，造成了巨大的社会经济负担1,2。为了更好地理解导致肥胖的生物学过程，已开发出多种小鼠模型3,4。由于中枢机制在这些动物模型的能量稳态调节中具有重要作用，小鼠脑部的神经解剖学研究已成为该领域的必要技术。然而，由于多种因素（如抗体、组织、处理方法、物种和研究目标）的影响，不同实验室之间甚至同一实验室内的研究人员之间，脑组织学技术的质量、可靠性和可重复性存在显著差异。因此，有必要建立一套通用的小鼠脑组织学研究方案，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。同时，初学者可以快速学习、掌握并根据自身需求调整该方案。
免疫组织化学染色是一种成熟的方法，已广泛用于在多种组织（如脑组织和外周组织）中可视化特定细胞类型、mRNA 和蛋白质5,6更具体而言，可通过特异性的一抗和与酶（如显色免疫组织化学中的酶）或荧光染料（异硫氰酸荧光素）偶联的相应二抗来标记目标抗原。6以这些技术的应用为例，对弓状核中的β-内啡肽［前阿黑皮素原（POMC）编码的一种肽］和c-fos（神经元活动的标志物）进行了染色。结果显示，中缝背核中色氨酸羟化酶2（一种参与5-羟色胺合成的关键酶）的缺失可导致弓状核POMC神经元中c-fos表达降低7此外，通过小鼠脑组织中维生素D受体mRNA的分布进行定位研究 原位 杂交（RNAscope）8本文介绍了一种可靠且高效的自由漂浮免疫染色方法，并提供了逐步操作流程，旨在提高小鼠脑组织学研究的质量与可重复性。
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方案
本研究使用了两种性别的 C57BL/6J 小鼠（8-16 周龄）。所有动物的护理和实验程序均经贝勒医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 灌注
注意：步骤 1.1 - 1.6 需在通风橱中进行。
- 麻醉
- 将 5 mL 异氟烷（参见材料表）倒入置于干燥器底部的纸巾上。将小鼠 放入干燥器内带孔的隔板上 ，等待其呼吸迹象消失。
注意：在呼吸停止后，小鼠 仍会短暂维持心跳，灌注操作应在心跳消失前完成。 - 操作前需确认小鼠对脚趾夹捏无反射反应。
- 用针穿过每只脚将小鼠固定在泡沫板上。确保泡沫板放置于托盘中，以收集溢出的液体。
- 将 5 mL 异氟烷（参见材料表）倒入置于干燥器底部的纸巾上。将小鼠 放入干燥器内带孔的隔板上 ，等待其呼吸迹象消失。
- 暴露心脏
- 沿胸腹部中线做一纵向浅表切口，将皮肤向两侧推开，暴露胸腹部的肌层。随后切开肌层，暴露肝脏和肠管。最后用剪刀剪开肋骨，打开胸腔，暴露心脏和肺。使用止血钳将肋骨向两侧拉开，以扩大操作区域。
- 终末血液采集（可选）
- 将 1 mL 注射器（参见材料表）小心插入心脏右心房，直至针尖完全进入。固定注射器，缓慢抽吸血液，直至达到所需体积。
注意：注意避免穿透右心房；每只成年小鼠可采集 300–400 µL 血液。根据采血目的，可使用促凝剂或抗凝剂等添加剂。
- 将 1 mL 注射器（参见材料表）小心插入心脏右心房，直至针尖完全进入。固定注射器，缓慢抽吸血液，直至达到所需体积。
- 灌注导管的放置
- 对于初学者，用剪刀在心脏左心室剪开一个小孔（<1 mm），将钝头导管（幼鼠使用 18 G 针头，老龄鼠使用 21 G 针头）经左心室插入升主动脉。对于经验丰富的实验人员，可直接用钝头导管穿刺左心室，并小心将其插入升主动脉。
- 在泡沫板上用针固定导管与连接管的连接处，防止灌注过程中移动。也可使用止血钳固定导管。随后剪开右心房，以允许循环血液流出。
注意：灌注导管与连接管已连接至灌注泵。
- 生理盐水灌注
- 打开生理盐水压力开关，经心脏向小鼠灌注 40–60 mL 生理盐水（0.9% NaCl：25 °C，pH 7.4）。密切观察右心房的流出液及肝脏颜色。
注意：使用自动灌注泵（参见材料表）可在 1–2 分钟内完成血液冲洗。由于泵的压力范围为 1–300 mmHg，可据此调节流速。若发现鼻腔漏液和/或肺部膨胀，应降低压力并调整导管位置。当流出液不再含有血液时，表明脑组织已充分冲洗。此时肝脏血液排空，颜色变为棕灰色。
- 打开生理盐水压力开关，经心脏向小鼠灌注 40–60 mL 生理盐水（0.9% NaCl：25 °C，pH 7.4）。密切观察右心房的流出液及肝脏颜色。
- 甲醛灌注
- 关闭生理盐水压力开关，打开甲醛压力开关，向小鼠灌注 40 mL 10% 中性缓冲甲醛溶液（10% NBF：25 °C，pH 6.8–7.2，参见材料表）。观察动物四肢是否出现震颤。
注意：灌注 10% NBF 后可能观察到尾部运动。警告：NBF 具有危害性，建议研究人员在整个操作过程中佩戴个人防护装备（如合适的呼吸器、面罩）。
- 关闭生理盐水压力开关，打开甲醛压力开关，向小鼠灌注 40 mL 10% 中性缓冲甲醛溶液（10% NBF：25 °C，pH 6.8–7.2，参见材料表）。观察动物四肢是否出现震颤。
- 脑组织分离9
- 用剪刀剪下头部。沿头顶部正中线切开皮肤，暴露颅骨。用剪刀剪除皮肤及附着的肌肉组织。
- 在眶嵴处做一切口，将虹膜剪的尖端插入枕骨大孔。沿颅骨内表面推进剪刀，保持向上施压，避免损伤脑组织。小心移除顶骨/额骨及脑膜。最后轻柔地将脑组织从打开的颅腔中取出。
- 后固定
- 将脑组织置于装有 10 mL 5% NBF 和 15% 蔗糖的 15 mL 离心管中，在 4 °C 下过夜固定。
注意：配制 10 mL 5% NBF 和 15% 蔗糖溶液时，混合 5 mL 10% NBF 与 5 mL 30% 蔗糖（w/v，溶于磷酸盐缓冲液（PBS），参见材料表）。确保固定液体积至少为样本体积的 10 倍以上。初始时脑组织会漂浮于缓冲液中，过夜固定后将沉至管底。
- 将脑组织置于装有 10 mL 5% NBF 和 15% 蔗糖的 15 mL 离心管中，在 4 °C 下过夜固定。
- 脱水
- 将脑组织转移至装有 10 mL 30% 蔗糖的 15 mL 离心管中，在 4 °C 下脱水至组织完全下沉。
2. 冷冻切片（冠状切面）
- 制备
- 将干冰置于滑动式切片机的高度调节板上，等待至出现白色霜层。在板上小心地铺展5 mL 30%蔗糖溶液，待其完全冻结后形成固体基底。将所有脑样本（每批最多5个脑样本）水平排成一列放置于蔗糖上，然后在每个脑样本底部添加0.5 mL 30%蔗糖溶液。
注意：脑组织会立即粘附于冻结的蔗糖基底，并自下而上逐渐冻结。在固定部位的脑组织周围添加额外的蔗糖，以形成更稳固的切片基底。
- 将干冰置于滑动式切片机的高度调节板上，等待至出现白色霜层。在板上小心地铺展5 mL 30%蔗糖溶液，待其完全冻结后形成固体基底。将所有脑样本（每批最多5个脑样本）水平排成一列放置于蔗糖上，然后在每个脑样本底部添加0.5 mL 30%蔗糖溶液。
- 切片
- 冷冻5–10分钟后，当脑组织变硬且呈白色时，修整脑组织直至达到目标层面/区域。
注意：通过调节板上干冰的量来控制温度。当脑组织表面出现冰晶时，表明温度过低；当脑组织变软且不再呈白色时，表明温度过高。 - 从修整模式切换至进样模式，将脑组织切片至25 µm厚度。准备一个装有1× PBS的48孔板，并为每只小鼠脑组织标记5个孔。使用画笔收集来自同一只小鼠的每个切片，并将其放入第一个孔中。将同一只小鼠的下一个切片放入第2nd孔中。
- 重复步骤2.2.2，直至第5th孔，将第6–10个切片依次放入第1st–5th孔，依此类推。同时对剩余脑组织重复相同操作。重复此过程，直至同一只小鼠的所有切片按解剖顺序收集至5个孔中。
注意：通过此方法，每只小鼠的脑切片被分装为5个系列，可用于最多5项不同的组织学研究。
- 冷冻5–10分钟后，当脑组织变硬且呈白色时，修整脑组织直至达到目标层面/区域。
- 储存
- 使用画笔将各孔中的切片转移至装有冷冻保护液（20%甘油、30%乙二醇和50% PBS）的1.5 mL微量离心管中，并将样本储存在-20 °C条件下。
注意：将切片储存在小管（1.5 mL）中可节省冰箱空间，且切片完整性可保持数月之久。
- 使用画笔将各孔中的切片转移至装有冷冻保护液（20%甘油、30%乙二醇和50% PBS）的1.5 mL微量离心管中，并将样本储存在-20 °C条件下。
3. 游离漂浮式 WFA 染色与抗 AVP 免疫染色
- 将细胞筛置于已加入 PBS 的 6 孔细胞培养板的一个孔中，用画笔将一组脑切片转移至细胞筛内。通过将细胞筛转移至另一个装有 PBS 的孔中，在摇床上清洗切片：对于保存在冷冻保护液中的切片，以 6 次 × 10 分钟进行清洗；对于新鲜切片，则以 3 次 × 10 分钟进行清洗。
注意：所有洗涤步骤均在 6 孔细胞培养板中进行，每孔内放置一个细胞筛（参见 材料表）。每个细胞筛承载来自同一只小鼠的脑切片。为节约试剂，下述所有孵育步骤均在 1.5 mL 微离心管中进行。在洗涤与孵育步骤之间，使用画笔将脑切片在细胞筛与各管之间转移。PBS 洗涤时，每孔使用 12 mL 即可。 - 在 1.5 mL 管中，用 PBT 缓冲液（将 2.5 mL Triton X-100 溶解于 1,000 mL PBS 中）配制 1 mL 生物素标记的 WFA 溶液（1:1,000）。将脑切片从细胞筛转移至该管中，在室温下于摇床（约 50 rpm）孵育过夜。
- 按照步骤 3.1 所述，用 PBS 对脑切片进行 3 次 × 10 分钟的清洗。
- 在 1.5 mL 管中，用 PBT 缓冲液配制 1 mL 链霉亲和素-Dylight 488 溶液（1:500）。将脑切片转移至该管中，在室温下于摇床（约 50 rpm）孵育 2 小时。
注意：从本步骤开始，需用铝箔覆盖容器以避免光照。 - 用 PBS 对脑切片进行 3 次 × 10 分钟的清洗。随后将脑切片在封闭缓冲液（含 3% 正常驴血清的 PBT 缓冲液）中，于室温孵育 2 小时。
注意：封闭血清的选择取决于二抗的来源物种。例如，若二抗来源于山羊，则应使用正常山羊血清。 - 将脑切片在含一抗（兔抗 AVP 抗体，1:500）的封闭缓冲液中，于室温下于摇床（约 50 rpm）孵育过夜。
注意：一抗和二抗均应使用封闭缓冲液配制。抗体浓度、孵育时间及温度需在预实验中优化。 - 用 PBS 对脑切片进行 3 次 × 10 分钟的清洗。随后将脑切片在含二抗（Alexa Fluor 594 标记的驴抗兔 IgG (H+L)，1:500）的封闭缓冲液中，于室温下于摇床（约 50 rpm）孵育 2 小时。最后再用 PBS 对脑切片进行 3 次 × 10 分钟的清洗。
4. 封片
- 在两个培养皿（直径150 mm）中各加入100 mL的1×PBS。将一个滤网中的所有脑切片转移至第一个培养皿中，并按照从尾侧到头侧的神经解剖学顺序排列脑切片。
注意：为避免不同动物的切片混淆，请一次仅处理来自同一只动物的一套脑切片。 - 当所有脑切片在第一个培养皿中排列完毕后，将一张载玻片浸入第二个培养皿中，并用支架将其一端略微倾斜（见图1和图2）。使用细毛刷轻轻将一片脑切片置于气-液界面下方的倾斜载玻片上。重复此操作，将另一片脑切片并排置于第一片旁边。
- 使用移液管缓慢而轻柔地吸出缓冲液，降低液面高度，直至两片脑切片完全处于气-液界面上方。
注意：操作时应尽量减少对缓冲液表面的扰动，否则脑切片可能漂走。干燥后，这一排脑切片将牢固地附着在载玻片上。如有必要，在切片仍湿润时可轻轻调整其位置，确保组织无皱褶或折叠。 - 重复此过程，直至载玻片底部区域完成。继续重复操作，直到所有切片均被 mounted 到载玻片上。
5. 盖片
- 所有切片干燥后（室温下放置 1-24 小时），在载玻片上滴加 80-100 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（参见材料表），然后轻轻盖上玻璃盖玻片以覆盖样品。
注意：应小心缓慢地加盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。 - 将载玻片放入显微镜载玻片盒中（参见材料表），并于 4 °C 下保存。
注意：建议在 1-3 天内完成所有切片的成像，以避免荧光信号淬灭及自发荧光的产生。
6. 成像
- 打开扫描仪和计算机（参见材料表）。使用加载装置将载玻片放入载片架中，并将载片架插入扫描仪。
注意：该扫描仪支持同时扫描多个通道（例如，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、绿色和红色通道）。扫描仪仅以20倍放大倍率扫描载玻片；当需要更高放大倍率（例如40倍）时，可使用传统的荧光显微镜（参见材料表）。 - 启动扫描仪配套软件（参见材料表）。选择适当的存储位置和扫描配置文件。
- 点击开始预览扫描按钮以启动预览扫描。完成预览扫描后，打开组织检测向导，并圈选出成像所需的感兴趣区域。
- 选择成像区域后，点击开始扫描按钮。等待设备完成扫描过程。检查结果文件并导出图像。
注意：如果当前配置文件不适用于该载玻片，可通过重新对焦以及调整曝光时间或光照强度来优化配置文件以适应组织特性。更多技术细节请参考扫描仪使用说明（材料表）。
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结果
本方案的流程图简要展示于图1中。本实验室的冷冻切片操作流程见图2A，其中同时对5个脑组织样本进行了切片。脑切片的贴片过程如图2B所示，完整贴附脑切片的载玻片示意图见图2C。在图3中，展示了小鼠脑切片经WFA与AVP共染色后在Bregma -0.82 mm位置的代表性荧光免疫组织化学图像，包括低倍和高倍放大图像。AVP信号主要出现在室旁核和视上核，WFA信号则出现在下丘脑前部的室周区以及网状核区域。
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讨论
本方案为小鼠脑组织的神经解剖学研究提供了一种成熟的方法，包括灌注、组织切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。然而，为获得稳定且可靠的结果，必须优化若干关键细节。
灌注质量对于成功染色至关重要。如果脑组织中残留血液，可能会影响染色结果，因为血细胞（例如红细胞）可能产生人为的“阳性”染色信号10。我们通过观察肝脏是否呈现棕灰色来判断灌注质量，该颜色特征通常表明灌注充分，可获得无血的脑组织。本方案中使用的自动灌注泵有助于在较短时间内成功完成单只动物的灌注。固定不足会导致后续步骤中脑组织切片柔软且易碎，而过度固定则会因甲醛对蛋白质的交联作用增强，降低抗原反应的敏感性。我们测试了不同条件，发现小鼠脑组织在4 °C下过夜固定即可满足后固定要求。除本方案所用的10%中性缓冲福尔马林（NBF）作为固定液外，含4%（w/v）新鲜配制的多聚甲醛（PFA）的PBS溶液也广泛用于组织固定11。
关于冷冻切片，切片厚度需根据具体实验需求来决定。例如，RNA...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（CW 获资助号 K01DK119471；YX 获资助号 P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480 和 R01DK120858）、美国农业部/CRIS（YX 获资助号 51000-064-01S）以及美国心脏协会博士后奖学金（LT 获资助号 #829565）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Flour 594 驴抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% 蔗糖 | VWR | 470302 | 将30 g蔗糖溶解于100 mL PBS中 |
| 中性缓冲福尔马林 | VWR | 16004-128 | 10%，25 °C，pH 6.8–7.2 |
| 1 mL 皮下注射器 | BD | 309597 | |
| 48孔细胞培养板 | Corning | 3548 | |
| 6孔细胞培养板 | Corning | 3516 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 可高压灭菌的塑料干燥器 | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP抗体 | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| 细胞滤网 | Corning | 431752 | |
| 冷冻保护液缓冲液 | 用户自选 | 不适用 | 20% 甘油、30% 乙二醇和50% PBS |
| 异氟烷 | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX 显微镜 | Leica | 不适用 | |
| 显微镜载玻片盒（50片装） | VWR | 不适用 | |
| PBT | 用户自选 | 不适用 | 将2.5 mL Triton X-100溶解于1000 mL PBS中 |
| Perfusion two 自动灌流系统 | Leica | 39471005 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C，pH 7.3–7.5，1x浓度：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，9.8 mM 磷酸盐缓冲液 |
| 滑动式切片机 Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| 氯化钠 | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%，25 °C，pH 7.4 |
| 链霉亲和素蛋白，DyLight 488标记 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA抗体 | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 扫描仪 | Zeiss | 不适用 | |
| Zen 3.1 软件 | 扫描仪软件 |
参考文献
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
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