通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

摘要

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces cerevisiae中对这些相互作用进行体内直接分析的方法。

摘要

近年来，研究发现核糖体不仅负责解码mRNA，还指导多肽链进入拥挤的细胞环境。核糖体为膜靶向因子、修饰酶和折叠伴侣蛋白提供了在空间和动力学上受控结合的平台。甚至高等级寡聚复合物的组装以及蛋白质-蛋白质相互作用网络的形成步骤，也被发现与蛋白质的合成过程相协调。

在此，我们介绍选择性核糖体谱分析法（Selective Ribosome Profiling），一种用于捕获共翻译相互作用的方法。 体内我们将详细阐述用于捕获核糖体-新生肽链复合物及其共翻译相互作用因子的各种亲和纯化步骤，以及为解析接近密码子分辨率的共翻译相互作用所必需的mRNA提取、尺寸排阻、逆转录、深度测序和大数据分析步骤。

引言

选择性核糖体谱析（Selective Ribosome Profiling，SeRP）是迄今为止唯一能够以直接方式在活体（in vivo）条件下捕获并表征共翻译相互作用的方法^1,2,3,4,5,6。SeRP 能够以接近密码子分辨率对任何因子与正在翻译的核糖体之间的相互作用进行全基因组水平的谱析^2,7。

该方法依赖于对生长中的细胞进行速冻，以保存正在进行的翻译活性。随后用RNase I处理细胞裂解液，降解细胞内所有mRNA，仅保留核糖体保护的mRNA片段，这些片段称为“核糖体足迹”。然后将样品分为两部分：一部分直接用于分离细胞内全部的核糖体足迹，代表细胞中所有正在进行的翻译过程；另一部分则用于亲和纯化与特定目标因子相关联的核糖体亚群，例如：修饰酶、转位因子、折叠伴侣蛋白以及复合物组装相互作用因子。经亲和纯化获得的核糖体足迹 collectively 称为相互作用组（interactome）。随后，提取核糖体保护的mRNA并用于cDNA文库构建，继而进行深度测序。

对总翻译组和相互作用组样本进行比较分析，可鉴定出所有与目标因子相关联的orfs，并表征每个orf的相互作用谱型。该谱型可报告精确的结合起始与终止序列，据此可推断出被解码的密码子以及新生多肽链的相应残基，还可揭示相互作用过程中核糖体移动速度的变化^7,8。图1以示意图形式展示了该实验流程。

图1：SeRP实验流程概览。 本实验流程可在7至10天内完成。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 用于选择性核糖体谱分析的菌株构建

注意：Selective Ribosome Profiling（选择性核糖体谱分析，SeRP）是一种依赖于目标因子亲和纯化的方法，用于评估这些因子与核糖体-新生肽链复合物的相互作用模式。近年来常用同源重组⁹以及基于CRISPR/Cas9¹⁰的方法，将各种目标因子与用于亲和纯化的标签进行融合。这些标签包括用于GFP-trap亲和纯化的GFP标签、用于IgG-Sepharose磁珠纯化的TAP标签，以及由亲和素或链霉亲和素纯化的AVI标签等，以上均为近年来成功应用的实例。

1. 进行生长或功能检测，以验证标记是否影响了蛋白质的功能。应评估N端与C端标记的效果。
   ​注意：核糖体（rRNA）以及多种因子中的核糖体结合结构域带有高度电荷，因此不宜使用高电荷标签（如多聚组氨酸），因为这可能导致假阳性发现或改变结合模式。

2. 培养物生长

1. 在液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）丰富培养基或合成葡萄糖（SD）最低限度培养基（1.7 g/L 含硫酸铵的酵母氮源基础培养基，或1.7 g/L 不含硫酸铵的酵母氮源基础培养基加1 g/L 单钠谷氨酸，2% 葡萄糖，并补充完全或适当的氨基酸混合物）中培养构建的酵母菌株（基于BY4741菌株），使其表达目标标记蛋白。
2. 在适当的培养基中，于30 °C条件下将250–500 mL细胞培养物培养至OD₆₀₀为0.5（对数中期）。

3. 细胞收集与裂解

1. 使用玻璃过滤系统（玻璃滤器支架配1 L玻璃漏斗、真空底座和盖帽、不锈钢筛网、垫圈和弹簧夹，90 mm；磨口1 L抽滤瓶）在0.45 µm硝酸纤维素印迹膜上通过真空过滤快速收集细胞。
2. 用刮刀刮取沉淀的细胞，并立即浸入装有液氮的50 mL离心管中，快速冷冻收集的细胞。
   暂停点： 细胞可在-80 °C保存长达3-4周。
3. 在混合研磨仪中进行低温研磨以裂解细胞：加入1 mL裂解缓冲液（见表1），以30 Hz频率研磨两次，每次2分钟，两次之间用液氮冷却样品。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
10 mg/mL CHX (cycloheximide)	220	0.5 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8.0	88	20 mM
3M KCl	205.7	140 mM
1M MgCl2	26.4	6 mM
1M PMSF	4.4	1 mM
NP-40	4.4	0.10%
蛋白酶抑制剂	2 片
DNase I	8.8	0.02 U/mL
终体积	4,400

表1：裂解缓冲液主混合液配方。

注意：如果目标蛋白非常不稳定，可以向裂解缓冲液中添加更多蛋白酶抑制剂（例如亮抑酶肽、亮肽素、抑肽酶等），但重要的是避免使用EDTA，以确保在后续步骤中核糖体的小亚基和大亚基保持结合状态。出于类似原因，缓冲液中应始终维持至少6 mM的MgCl₂。

警告：盐酸具有强腐蚀性，PMSF 有毒。请佩戴手套并小心操作。

4. 在 4 °C 条件下，以 30,000 × g 离心 2 分钟，以澄清裂解液并收集上清液。

4. 用于SeRP的核糖体-新生肽链复合物的纯化

1. 每次实验中，将上清液分为两部分，分别置于不同的微量离心管中：总RNA样品（约200 µL）和免疫沉淀（IP）样品（约700 µL）转译组样品。
2. 处理总RNA样品
   1. 使用10 U的RNase I在4 °C下消化总RNA样品25分钟，同时以30 RPM在旋转混合架上旋转。
      注意：可通过多聚核糖体分析校准消化条件，以确保单体核糖体峰无过度或不足消化。
   2. 按照表2所述配制蔗糖缓冲液主混合液。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
50% 蔗糖	200	25%
1M Tris-HCl pH 8.0	8	20 mM
3M KCl	18.7	140 mM
1M MgCl2	4	10 mM
100 mg/mL CHX	0.4	0.1 mg/mL
蛋白酶抑制剂	1 片
终体积	400

表2：蔗糖垫层主混合液配方。

3. 将样品加入400 µL蔗糖垫层上，使用TLA120转子在4 °C条件下以245,000 × g 离心90分钟。
4. 用真空泵迅速吸除上清液，并在沉淀中加入150 µL裂解缓冲液。在4 °C、300 RPM条件下振荡1小时，重悬沉淀。
5. 通过移液重悬残留沉淀，并转移至新的1.5 mL离心管中。
   注意：通常100–200 µg总RNA足以用于全翻译组的核糖体分析。可增加核糖体RNA（rRNA）去除步骤，以减少rRNA污染，后者是核糖体-新生肽链复合物亲和纯化过程中最常见的污染物¹¹（详见讨论部分）。

3. 免疫纯化样品的处理
   1. 每份样品用 3 × 1 mL 裂解缓冲液（不含 DNase I 和蛋白酶抑制剂）洗涤 100–400 µL 亲和结合基质（1:1 抗体偶联磁珠，溶于 70% 乙醇中）；将亲和基质重悬于裂解缓冲液中，然后在 4 °C 下以 30 RPM 在旋转混合仪上旋转孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 30 秒，沉淀基质。弃去上清液。重复洗涤三次。
   2. 使用每 A260 nm 单位 10 U 的 RNase I 对免疫纯化样品进行消化，同时加入亲和结合基质（例如，每份样品加入 100–400 µL GFP-TRAP）。
   3. 在 4 °C 下以 30 RPM 在旋转混合仪上旋转孵育 25 分钟，使蛋白与亲和基质充分结合。
   4. 按照 表 3 中的说明配制洗涤缓冲液主混合液。

试剂	每样品用量 (µL)	终浓度
10 mg/mL CHX	50	0.1 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8.0	100	20 mM
3M KCl	233	140 mM
1M MgCl2	50	10 mM
1M PMSF	5	1 mM
NP-40	0.5	0.01%
蛋白酶抑制剂	2 片
50% 甘油	1,000	10%
终体积	5,000

表3：洗涤缓冲液主混合液配方。

5. 用1 mL洗涤缓冲液将亲和结合基质洗涤3次，每次约1分钟，在4 °C下以30 RPM在混合架上旋转。
6. 在4 °C下以3,000 × g离心30秒，沉淀基质，弃去上清液。
7. 再用1 mL洗涤缓冲液洗涤2次，每次5分钟，在4 °C下以30 RPM在混合架上旋转。
8. 在4 °C下以3,000 × g离心30秒，沉淀基质。
9. 取50 µL珠子用于蛋白洗脱，加入等体积的2×上样缓冲液；其余珠子用于RNA提取。
10. 在4 °C下以3,000 × g离心30秒，使珠子沉淀，弃去上清液。
11. 在液氮中速冻后于-80 °C保存。后续RNA提取使用这些样品。
    暂停点：样品可在-80 °C保存过夜或更长时间。此处可作为实验暂停点。
12. 通过Western印迹或考马斯亮蓝染色检测各步骤取样（混匀后取总体积的约10%）以评估亲和纯化步骤的成功程度。始终以非标签野生型菌株进行模拟免疫沉淀（mock IP）作为对照，以排除非特异性结合至亲和基质的情况。
    注意：可通过增加盐浓度或去垢剂浓度进行额外洗涤步骤，以降低非特异性背景信号。瞬时相互作用可通过多种交联剂 处理加以稳定，例如对活细胞进行甲醛（PFA）交联处理——在培养基中加入0.4%-1% PFA作用2-5分钟，随后用0.3 M甘氨酸淬灭3分钟，此方法强烈推荐。
    ​警告：甲醛为疑似致癌物，且易挥发、具有腐蚀性，操作时须在化学安全通风橱中进行，并佩戴两层手套。

5. 深度测序用 cDNA 文库的制备

1. RNA 提取
   注意：使用无 RNase 的不粘性 1.5 mL 离心管，以防止可能的 RNA 或 DNA 损耗。
   1. 将步骤 4.2.5 和 4.3.12 的样品在冰上解冻，并用 10 mM Tris-HCl（pH 7.0）重悬至终体积为 700 µL。
      注意：酸性酚和氯仿具有挥发性和毒性，需在化学安全通风橱中操作。
   2. 向 0.7 mL 总 RNA 或免疫沉淀（IP）洗脱液中加入 40 µL 20% SDS。盖紧管盖并轻轻颠倒数次。蛋白质沉淀应使样品变为白色。
   3. 向样品中加入 0.75 mL 预热的酸性酚:氯仿。密封离心管后，在 65 °C 下以 1,400 RPM 在恒温混匀仪中震荡 5 分钟。随后将样品在冰上冷却 5 分钟。
   4. 将步骤 5.1.3 的离心管在 20,000 x g 下离心 2 分钟。将上层水相转移至新离心管，并加入 0.7 mL 酸性酚:氯仿。
   5. 室温孵育 5 分钟，期间偶尔涡旋震荡。在 20,000 x g 下离心 2 分钟。将上层水相转移至新离心管，加入 0.6 mL 氯仿并涡旋震荡。
   6. 在 20,000 x g 下离心 1 分钟。将上层水相转移至新离心管。
   7. 通过加入 78 µL 3 M NaOAc（pH 5.5）、2 µL GlycoBlue 和 0.75 mL 异丙醇沉淀核酸。充分涡旋震荡 5 分钟。在 -80 °C 下孵育至少 1 小时，或在 -20 °C 下孵育 16 小时。
   8. 在 4 °C、20,000 x g 下离心 30 分钟，弃去上清液。用 0.75 mL 冰冷的 80% 乙醇洗涤沉淀。颠倒离心管以充分清洗。在 4 °C、20,000 x g 下离心 5 分钟，然后弃去上清液。
   9. 在 450 x g、4 °C 下离心 20 秒，去除残留乙醇并弃去液体。在 65 °C 下敞盖干燥沉淀 5 分钟。按以下方式重悬样品：对于免疫沉淀样品，用 10 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.0）重悬；对于总翻译组分析，用 20 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.0）重悬。
      暂停点： RNA 可在 -80 °C 下保存数月。
2. 通过荧光法测定总 RNA 浓度
   注意：在构建下一代测序用 cDNA 文库时，所有材料和表面均应无 RNase。操作 RNA 样品时应佩戴手套。
   1. 将 1 µL 酸性酚提取的总 RNA 用 9 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.0）稀释。按照制造商网站上的说明使用荧光计进行定量。
   2. 用 10 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.0）稀释含 50 µg RNA 的样品。
      注意：无需对免疫沉淀样品进行定量，直接用于下一步。
3. 凝胶纯化核糖体保护的足迹片段
   1. 制备 15% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并浸入 1x TBE 电泳缓冲液中。在上样前以 200 V 电压预电泳 30 分钟。向每个样品中加入 20 µL 2x TBE-尿素上样缓冲液。
      注意：预期条带 大小约为 25–35 nt。
   2. 解冻 10 bp DNA Marker，并将样品（不含 Marker）在 80 °C 下变性 2 分钟，然后在冰上冷却。将每个样品加样至间隔的泳道中。以 200 V 电压电泳 50–70 分钟。
   3. 将 6 µL SYBR Gold（10,000 倍浓缩液）稀释于 60 mL 1x TBE 缓冲液中，在避光容器中振荡染色 15–20 分钟。染色期间，准备无菌手术刀和已标记的 0.5 mL 凝胶破碎管（置于 1.5 mL 管中）。
   4. 使用无菌手术刀切下目标条带（每处理一个样品应更换新刀片或彻底清洁），并将每块凝胶放入对应的凝胶破碎管中。
   5. 拍摄凝胶图像，确保凝胶中无样品残留。
   6. 将含有切下凝胶片的离心管在 4 °C、20,000 x g 下离心 5 分钟，将剩余凝胶碎片从凝胶破碎管转移至 1.5 mL 管中。
   7. 加入 0.5 mL 10 mM Tris（pH 7.0）。在 70 °C 下以 1,400 RPM 在恒温混匀仪中震荡 10 分钟。
   8. 使用宽口移液器吸头将溶液转移至醋酸纤维素柱中，在 4 °C、20,000 x g 下离心 3 分钟。
   9. 将穿流液转移至新的 1.5 mL 管中，并在冰上冷却。
   10. 为沉淀核酸，加入：550 µL 异丙醇（IPA）、55 µL 3 M NaOAc 和 2 µL GlycoBlue，涡旋混匀。将样品置于 -80 °C 下至少 1 小时。
   11. 在 4 °C、20,000 x g 下离心至少 1 小时，弃去上清液。用 0.75 mL 冰冷的 80% 乙醇洗涤沉淀。颠倒离心管彻底清洗，直至沉淀从管底脱离。再次在 4 °C、20,000 x g 下离心 5 分钟，弃去上清液。
   12. 在 450 x g、4 °C 下离心 20 秒，去除残留乙醇。在 65 °C 下敞盖干燥沉淀 5 分钟。
   13. 加入 15 µL 10 mM Tris（pH 7.0），充分重悬沉淀。在 450 x g、4 °C 下离心 20 秒，将样品转移至新的 1.5 mL 管中。
       暂停点： 纯化的 RNA 可在 -80 °C 下保存数月。
4. 去磷酸化
   1. 每个样品使用 3 µL 下列混合液：将 1 µL RNase 抑制剂加入 2 µL 不含 ATP 的 10x T4 多核苷酸激酶反应缓冲液中。向每个样品中加入 2 µL T4 多核苷酸激酶。轻轻吹打混匀，在 37 °C 下孵育 2 小时，期间不震荡。
   2. 为灭活酶活性，将样品在 75 °C 下孵育 10 分钟，在 450 x g、4 °C 下离心 20 秒。加入 0.5 mL 10 mM Tris（pH 7.0）。
   3. 为沉淀核酸，加入 2 µL GlycoBlue、550 µL 异丙醇和 55 µL 3 M NaOAc。
   4. 涡旋混匀后，将样品在 -80 °C 下冷却至少 1 小时。
      暂停点：样品可在 -80 °C 下保存过夜或更长时间。
   5. 重复步骤 5.3.11–5.3.13。
      暂停点： 去磷酸化的 RNA 可在 -80 °C 下保存数月。
5. 使用 Bioanalyzer 进行定量
   1. 将每个 RNA 样品用 DEPC 处理水按 1:4 比例稀释（1 µL 样品 + 4 µL 水）。
      注意：DEPC 为致癌物，操作时应戴手套并小心谨慎。
   2. 运行 Bioanalyzer 小 RNA 芯片或 TapeStation，遵循制造商的操作说明。
      注意：预期的核糖体保护 RNA 片段大小约为 28–30 nt。
6. 使用 Linker-1 连接 3' 末端
   1. 用 10 mM Tris（pH 7.0）将 5 pmol 小 RNA 片段稀释至 10 µL。在 80 °C 下变性 2 分钟，然后在冰上冷却。
   2. 按照表 4中的详细说明配制主混合液，每样品使用 29 µL。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
50% 无菌过滤 PEG 8000	16	20%
DMSO	4	10%
10× T4 RNA 连接酶 2 缓冲液	4	1×
SUPERase-In RNase 抑制剂	2	2 U
10 mM 腺苷酸化接头 3-L1	0.1	25 µM
DEPC 处理水	2.9
终体积	29

表4：3'末端连接主混合液配方。

3. 加入 1 µL T4 RNA 连接酶 2，轻轻吹打混匀。在 23 °C 下孵育 2 小时。
4. 为沉淀核酸，加入：550 µL 异丙醇（IPA）、500 µL 10 mM Tris（pH 7.0）、55 µL 3 M NaOAc 和 2 µL GlycoBlue。涡旋充分混匀，将样品置于 -80 °C 至少 1 小时。
   暂停点：样品可在 -80 °C 保存过夜或更长时间。
5. 重复步骤 5.3.2–5.3.12。
6. 将沉淀重悬于 6 µL 10 mM Tris（pH 7.0）中。在 450 × g、4 °C 条件下离心 20 秒，将样品转移至新的 1.5 mL 离心管中。
   暂停点：样品可在 -80 °C 保存数月。

7. 3' 连接的足迹片段的凝胶纯化
   1. 配制10% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并浸入1x TBE电泳缓冲液中。上样前在200 V电压下预电泳30分钟。向每个样品中加入6 µL 2x TBE-尿素上样缓冲液。
      注意：预期条带大小约为71-73 nt。
   2. 重复步骤5.3.2-5.3.13。
      暂停点：样品可在-80 °C保存数月。
8. 将3ʹ连接的足迹片段反转录以生成ssDNA
   1. 按照表5中详细说明配制主混合液，每样品使用3 µL。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
10 mM dNTPs	1	0.5 mM
25 µM Linker L(rt)	0.5	625 nM
DEPC处理水	1.5
终体积	3

表5：核酸变性前逆转录缓冲液主混合液的配制配方。

2. 涡旋振荡样品，并短暂离心。
3. 将样品在 65 °C 下孵育 5 分钟。
4. 将样品置于冰上冷却。
5. 按照 表6 中的说明配制主混合液，每份样品使用 6 µL。涡旋振荡并短暂离心。向每份样品中加入 1 µL Superscript III，轻轻吹打混匀，于 50 °C 孵育 30 分钟。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
5× FS 缓冲液	4	1x
SUPERase-In RNase 抑制剂	1	2 U
DTT 0.1 M	1	5 mM
终体积	6

表6：核酸变性后逆转录缓冲液主混合液配方。

6. 加入 2.3 µL 的 1 N NaOH，以水解 RNA 并终止逆转录反应。
   警告：NaOH 具有强腐蚀性。操作时需佩戴手套和护目设备。
7. 在 95 °C 下孵育 15 分钟，直至样品变为粉红色。
8. 制备一块 10% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并将其浸入 1x TBE 电泳缓冲液中。在上样前，以 200 V 电压预电泳 30 分钟。向每个样品中加入 23 µL 的 2x TBE-尿素上样缓冲液。
   注意：预期的 DNA 条带大小为 115–117 nt。
9. 重复步骤 5.3.2–5.3.12。
10. 将沉淀重悬于 15 µL 的 10 mM Tris（pH 8.0）中，在 4 °C 下以 450 × g 离心 20 秒，然后将样品转移至新的 1.5 mL 离心管中。
    暂停点：样品可在 -80 °C 下保存数月。

9. ssDNA 环化
   1. 按照 表 7 中的详细说明，配制以下主混合液，并为每个样本加入 4 µL。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
10× CircLigase II 缓冲液	2	1x
5 M 甜菜碱（可选）	1	0.25 M
50 mM MnCl2	1	2.5 mM
终体积	4

表7：ssDNA 环化反应主混合液配方。

2. 向每个样品中加入 1 µL CircLigase II ssDNA 连接酶，在 60 °C 下孵育 1 小时。
   注意：在孵育 1 小时后，向每个样品中再加入 1 µL CircLigase II ssDNA 连接酶，可提高此步骤的效率。
3. 在 80 °C 下孵育 10 分钟以灭活酶。
4. 冰上冷却，随后进行 PCR 扩增或于 -80 °C 保存。
   暂停点：样品可在 -80 °C 下保存数年。

10. PCR 扩增
    1. 按照 表 8 中的详细说明，配制以下 PCR 主混合液，并为每个样本加入 82 µL。

试剂	每样本用量 (µL)	终浓度
DEPC处理水	61.6
5× Phusion HF 反应缓冲液	17.6	1x
10 mM dNTPs	1.8	200 µM
100 µM PCR 正向引物	0.2	225 nM
HF Phusion 聚合酶	0.8	1.6 U
终体积	82

表8： PCR扩增主混合液配方。

2. 向每管含有主混合液的试管中加入 5 µL 环状 DNA。
   注意：将剩余的环状 DNA 样品储存于 -80 °C。
3. 向每个样品中分别加入 1 µL 不同的 20 µM PCR 反向条形码引物（见表 9），并涡旋振荡以充分混匀。
4. 将每管样品分装至四个独立的 PCR 管中，每管将用于不同循环数的 PCR 扩增。
5. 按照 表 10 中详细列出的程序运行 PCR 反应。

循环	变性 (98 °C)	退火 (60 °C)	延伸 (72 °C)
1	30 s
2-16	10 s	10 s	5 s

表10：PCR反应的PCR程序。

6. 在第8、9、10和11个循环后（对于IP样本，循环数范围为9至15）作为首次尝试取出PCR管。每次循环后暂停程序，取出一份等分试样并置于冰上，然后迅速恢复程序运行。
   注意：循环次数应根据每个反应中环化DNA的量进行调整。示例及进一步说明请参见图4。
7. 向每个17 µL的反应体系中加入3.5 µL的6x DNA上样染料。
8. 解冻10 bp DNA Marker。
9. 进行凝胶电泳以实现按大小分离，将8% TBE聚丙烯酰胺凝胶浸入1x TBE电泳缓冲液中，将不同循环数的样品分别上样至相邻加样孔，并在180 V电压下电泳50分钟。
10. 将6 µL SYBR Gold（10,000倍浓缩液）稀释于60 mL的1x TBE缓冲液中，在避光容器中摇动染色15–20分钟。
11. 染色过程中，准备一支无菌手术刀以及装有0.5 mL凝胶破碎管的已标记1.5 mL离心管。
12. 拍摄染色后的核酸图像。
13. 使用无菌手术刀切下预期大小为174–176 bp的目标条带，并将凝胶切片放入已准备好的0.5 mL凝胶破碎管中（每处理一个样品之间需彻底清洁，使用RNase失活剂或更换新刀片）。
14. 将离心管在20,000 x g、4 °C条件下离心5分钟，然后将0.5 mL凝胶破碎管中剩余的凝胶碎片转移至1.5 mL离心管中。
15. 加入500 µL 10 mM Tris（pH 8.0），在热混仪中以1,400 RPM转速振荡10分钟，并在70 °C下孵育。
16. 使用宽口移液器吸头将溶解的凝胶转移至纤维素乙酸酯柱中。
17. 将柱子在20,000 x g、4 °C条件下离心3分钟，收集穿流液并转移至新的1.5 mL离心管中，置于冰上冷却。
18. 为沉淀核酸，加入以下试剂：550 µL异丙醇（IPA）、32 µL 5 M NaCl、1 µL 0.5 M EDTA和2 µL GlycoBlue，涡旋混匀。
19. 将样品在-80 °C下保存至少1小时，或在-20 °C下过夜。
    暂停点：样品可在-80 °C下保存过夜或更长时间。
20. 重复步骤5.3.11–5.3.12。
21. 用11 µL 10 mM Tris（pH 8.0）重悬沉淀物。在450 x g、4 °C条件下离心20秒，将样品转移至新的1.5 mL离心管中。
    暂停点：样品可在-80 °C下长期保存数年。

11. 通过Bioanalyzer分析片段大小分布
    1. 将1 µL样品与4 µL经DEPC处理的水混合，对每个样品进行1:4稀释。
    2. 运行Bioanalyzer小RNA芯片，按照制造商提供的操作说明进行。
       注意：预期片段长度为175 ± 5 bp。
12. 使用荧光计测定DNA浓度
    1. 根据制造商的建议，使用荧光计进行双链DNA（dsDNA）高灵敏度浓度检测。
    2. 按照Illumina的建议进行样本的多重化（multiplexing）和测序（参见Index Adapters Pooling Guide¹²）。

6. 数据分析

1. 按照补充文件中的详细步骤进行分析。

结果

如本实验方案的流程图所示（图1），将细胞培养至对数生长期，随后通过过滤快速收集，并采用低温研磨法进行裂解。裂解液被分为两部分：一部分用于获取总核糖体保护的mRNA足迹，另一部分用于获取特定的核糖体保护的mRNA足迹，在后者中我们通过亲和纯化富集带有标签的蛋白-核糖体-新生肽链复合物。我们通过Western印迹分析验证了标签蛋白的表达以及富集实验的成功，结果如图2所示。我们通过小RNA电泳（2100 BioAnalyzer系统）验证了核糖体保护的mRNA足迹的分离效果，其长度通常为20–45 nt，根据仪器说明书，允许检测尺寸存在5–10 nt的偏移（图3）。随后，我们构建了用于深度测序和大数据分析的cDNA文库。在构建cDNA文库过程中需注意，循环次数不足可能导致产量偏低（如图3中第2泳道所示），但可通过重新扩增以回收已生成的文库。当PCR引物耗尽而反应继续进行时，可能发生过度扩增。若此时dNTP仍存...

讨论

本文详细介绍了选择性核糖体谱分析（SeRP）方法，该方法可用于在接近密码子分辨率下捕获共翻译相互作用。 由于核糖体在协调新生肽链进入拥挤的细胞质环境中发挥着核心枢纽作用，因此该方法对于识别和表征确保功能蛋白质组所必需的多种共翻译相互作用至关重要，同时也可用于研究多种疾病。迄今为止，SeRP 是唯一能够在体内直接捕获并表征这些相互作用的方法in vivo^14,15,16。

第一步也是最关键的一步是细胞收集与裂解。必须在数秒内通过瞬时冷冻并随后在冷冻状态下裂解，以快速捕获正在进行的翻译过程。细胞收集必须迅速完成，以避免核糖体脱离以及诱导应激性翻译反应，这些变化可能迅速发生。第二步关键步骤是亲和纯化。必须通过严格的洗涤减少背景结合，同时确保共翻译相互作用得以保留，这一点可通过体内交联（in vivo cross-linking）加以促进。由于本方案基于高灵敏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3'-磷酸化28 nt RNA对照寡核苷酸	IDT	定制订购	无RNase HPLC纯化；5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
无水乙醇	VWR	20821
酸性苯酚–氯仿	Ambion	AM9722
抗体：小鼠单克隆抗HA抗体	Merck	11583816001	12CA5
抑肽酶	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
细菌琼脂	BD	214030
细菌蛋白胨	BD	211820
细菌胰蛋白胨	BD	211699
细菌酵母提取物	BD	212720
盐酸抑氨肽酶素	Roth	2937.2
氯仿	Merck	102445
CircLigase II ssDNA连接酶*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
胶体考马斯亮蓝染色液	Roth	4829
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche Diagnostics	29384100
放线菌酮	Biological Industries	A0879
DEPC处理且无菌过滤的水*	Sigma	95284
无水D-葡萄糖	Merck	G5767-500G
焦碳酸二乙酯	Roth	K028
二甲基亚砜*	Sigma-Aldrich	276855
DNA分子量标准，10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA上样缓冲液*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I，重组	Roche	4716728001	无RNA酶
dNTP溶液混合物*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
甘油	VWR	24388.260.
甘氨酸溶液	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion聚合酶*	NEB	M0530L
来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的己糖激酶	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
盐酸	AppliChem	A1305
异丙醇	Sigma-Aldrich	33539
异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Roth	CN08
卡那霉素	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
亮抑蛋白酶肽	Roth	CN33.4
连接子L(rt)	IDT	定制订购
液氮
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS活化Sepharose 4快速流动珠	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40替代物	Sigma	74385
胃蛋白酶抑制剂A	Roth	2936.2
苯甲基磺酰氟	Roth	6367
预制胶	Bio-Rad	5671034	10% 和 12%
RNA酶I	Ambion	AM2294
SDS，20%	Ambion	AM9820	无RNA酶
乙酸钠*	Ambion	AM9740	3 M，pH 5.5
叠氮化钠	Merck	S8032-100G
氯化钠	Roth	9265
氢氧化钠*	Sigma	S2770	1 N
蔗糖	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNA酶抑制剂	Ambion	AM2694
Superscript III 逆转录酶*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4多核苷酸激酶*	NEB	M0201L
T4 RNA连接酶2*	NEB	M0242L
TBE聚丙烯酰胺凝胶*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–尿素聚丙烯酰胺凝胶*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–尿素聚丙烯酰胺凝胶*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–尿素上样缓冲液*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M，pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M，pH 8.0
UltraPure 10× TBE缓冲液*	Invitrogen	15581-044
* - 用于文库制备
垫圈和弹簧夹，90 mm	Millipore	XX1009020
磨口烧瓶 1 L	Millipore	XX1504705