体内评估大动物视网膜神经节细胞及视神经功能与结构的方法

摘要

本文演示了在山羊和恒河猴中进行的多种体内检测方法（闪光视觉诱发电位、图形视网膜电图和光学相干断层扫描），以研究视神经及其神经元的结构与功能。

摘要

视神经收集来自视网膜神经节细胞的轴突信号，并将视觉信号传递至大脑。由于大型动物模型在体型和解剖结构上更接近人类，因此在将新型治疗策略从啮齿类动物模型转化为临床应用的过程中，视神经损伤的大型动物模型至关重要。本文介绍了一些用于评估大型动物视网膜神经节细胞（RGCs）和视神经（ON）功能与结构的体内方法，包括视觉诱发电位（VEP）、图形视网膜电图（PERG）和光学相干断层扫描（OCT）。本研究采用了山羊和非人灵长类动物。通过逐步展示这些体内方法，我们希望提高不同实验室之间的实验可重复性，并促进视神经病变大型动物模型的应用。

引言

视神经（ON）由视网膜神经节细胞（RGC）的轴突组成，负责将视觉信号从视网膜传递至大脑。视神经疾病，例如青光眼、外伤性或缺血性视神经病变，常导致不可逆的视神经/RGC退变及严重的视力丧失。尽管目前在啮齿类动物模型中已取得多项视神经再生和RGC保护的突破性进展^1,2,3,4,5,6，但大多数视神经疾病的临床治疗在过去半个世纪中基本未变，疗效仍不理想^7,8。为了弥合基础研究与临床实践之间的差距，利用大动物视神经疾病模型开展转化研究通常是必要且有益的，因为大动物模型在解剖结构上比啮齿类动物更接近人类。

山羊和恒河猴是本实验室用于模拟人类视神经疾病的两种大型动物模型。根据颅骨CT扫描结果，山羊眼球、视神经及其邻近结构（如眼眶、鼻腔、颅底等）的尺寸与人类相似⁹。因此，山羊模型为在人类应用前....

方案

实验严格遵循 ARRIVE 指南以及美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南，并符合温州医科大学（WMU）和集运实验室（苏州）机构动物护理与使用委员会批准的协议。4 至 6 月龄、体重为 19–23 kg 的雄性萨能山羊饲养于温州医科大学动物实验中心。5 至 6 岁、体重为 5–7 kg 的雄性恒河猴饲养于集运动物实验中心。所有动物均饲养在温度受控（21 ± 2 °C）的空调房间内，采用 12 小时光照/12 小时黑暗循环，自由进食。

1. 山羊闪光视觉诱发电位（FVEP）

1. 全身麻醉
   1. 使用电动剃刀剃除踝关节处的毛发。
   2. 用70%酒精棉球擦拭皮肤三次以清洁皮肤，随后暴露皮下静脉。
   3. 静脉插入外周静脉导管（0.9 mm × 25 mm），然后注射阿托品（0.025 mg/kg）和丙泊酚（5 mg/kg）。
   4. 使用6 mm气管插管对山羊进行气管插管，并连接至人工呼吸机。
   5. 以2 L/min的恒定流速，通过氧气输送3.5%异氟烷维持麻醉。
      注意：丙泊酚诱导的麻醉在数分钟内即可消退，因此需迅速完成气管插管。
2. 心肺功能监测
   1. 将温度传感器置于舌下。
   2. 将脉搏血氧仪连接至耳部近端。
   3. 将血压袖带绑缚于....

结果

图1A展示了山羊FVEP的代表性结果。尽管相同闪光强度下的波形具有相对相似性，我们仍建议对波形进行两次检查。电子设备产生的电磁波会干扰所采集的电信号，导致基线噪声较高且波形重复性差。因此，建议在进行电生理检查时，确保周围环境中没有多余的电子设备插电运行，以避免此类干扰，并建议至少重复测量两次，以确定实验结果的稳定性和可重复性。当双眼均被遮盖时，双眼记录的波形完全平坦，表明波形确实来源于我们的闪光刺激。图1B展示了山羊PERG的代表性结果。由于其信号稳定且强度高，我们在每个空间频率下仅需一次测量即可获得可靠的波形。随着空间频率的增加，棋盘格的尺寸将逐渐超出山羊眼睛的分辨能力。因此，我们可以看到在12.7 cpd时，PVEP波形已显著下降。与FVEP类似，当我们关闭屏幕时，波形消失。图1C展示了恒河猴PVEP的代表性结果。我们在每个空间频率下重复测量两次。随着空间频率的增加，波幅会下降。这是由于空间频率已超过眼睛的感知能力所致。

讨论

本研究中，我们介绍了山羊和恒河猴的视觉诱发电位（VEP）、图形视网膜电图（PERG）和光学相干断层扫描（OCT）的操作方案。这些体内方法可应用于多种视神经病变的大型动物模型，如青光眼、缺血性或创伤性视神经病变以及视神经炎⁹。

PVEP 比 FVEP 更稳定且更敏感¹⁷；然而，在山羊中无法诱发出 PVEP⁹。因此，在本实验室中，我们对山羊进行 FVEP 检测，对恒河猴进行 PVEP 检测，以评估视网膜-外侧膝状体-皮层通路的完整性。据我们所知，目前尚不清楚为何在山羊中可以诱发出 PERG 而不能诱发出 PVEP。可能的原因是山羊的视神经功能和结构与人类存在差异。

由于FVEP的振幅可能受瞳孔大小和环境光照的影响，我们在记录FVEP时会散大瞳孔，并在山羊头部覆盖一条黑色毯子。需要注意的是，在临床FVEP检查中无需散瞳¹⁷。类.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
47.6 x 26.8 cm 显示器	DELL Inc.	E2216HV	对比反转的黑白棋盘格视觉刺激呈现在屏幕上
6.0 mm 气管插管	河南拓人医疗器械有限公司	PVC 6.0	确保气道通畅
鳄鱼夹
阿托品	广东揭阳龙阳动物药业有限公司		减少支气管分泌物并保护心脏免受迷走神经激活的影响
卡波姆眼用凝胶	Fabrik GmbH，Bausch 的子公司 && 罗姆		润湿角膜并稳定记录电极
ERG-Jet 记录电极	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 拉绍德封	ERG 记录
眼睑撑开器	上海金钟医疗器械有限公司	ZYD020	睁眼裂
海德堡Spectralis OCT系统	海德堡工程公司		OCT 系统
成像			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
异氟烷	RWD生命科学有限公司	R510-22	异氟烷麻醉
雄性萨能山羊	中国杭州，蔡牧畜牧有限公司		4至6月龄、体重19公斤的雄性萨能山羊–23 kg
针电极	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	用于FVEP接地电极和PERG参考电极
外周静脉导管静脉输注	BD 上海医疗器械有限公司	383019	静脉通路用于阿托品和异丙酚
丙泊酚	贤力邦企业联合会管理有限公司		在山羊中诱导异氟烷麻醉
复方托吡卡胺滴眼液	SANTEN OY，日本		5% 托吡卡胺和5% 盐酸去氧肾上腺素
视觉电生理设备	高特克有限公司	GT-2008V-III	用于FVEP &和 PERG
赛拉嗪	华牧动物保健品有限公司		赛拉嗪麻醉：按3 mg/kg剂量行肌肉注射赛拉嗪
zoletil50	Virbac		在猴子中诱导异氟烷麻醉