利用活性氧敏感型荧光探针对小鼠肠道类器官中的氧化应激进行分析

摘要

本实验方案描述了一种利用定性成像和定量流式细胞术检测小鼠肠道类器官中活性氧（ROS）的方法。该方法可进一步扩展至其他荧光探针，用于检测特定化合物对活性氧的影响。

摘要

活性氧（ROS）在肠道稳态中发挥着重要作用。ROS 是细胞代谢的天然副产物，可在黏膜水平响应感染或损伤而产生，参与抗菌反应和伤口愈合过程。它们也是关键的第二信使，调控包括细胞生长和分化在内的多种信号通路。另一方面，过量的 ROS 会导致氧化应激，对细胞产生有害影响，并促进慢性炎症或癌症等肠道疾病的发生。本研究提供了一种简便的方法，利用 commercially available 的荧光探针，通过活体成像和流式细胞术检测小鼠肠道类器官中的 ROS。本文所述方案描述了检测调节肠道类器官氧化还原平衡的化合物效应，并在特定肠道细胞类型中检测 ROS 水平的操作流程，以 GFP 遗传标记的肠道干细胞分析为例进行说明。该方案也可与其他荧光探针联合使用。

引言

活性氧（ROS）是细胞代谢的天然副产物。它们也可以由特定的酶复合物主动产生，例如膜结合的NADPH氧化酶（NOX）和双氧化酶（DUOX），这些酶可生成超氧阴离子和过氧化氢¹。细胞通过表达抗氧化酶和活性氧清除剂，能够精细调节其氧化还原平衡，从而维持组织稳态²。尽管活性氧对细胞具有高度毒性，并可损伤DNA、蛋白质和脂质，但它们也是关键的信号分子²。在肠上皮中，适度的活性氧水平是干细胞和祖细胞增殖所必需的³；而高水平的活性氧则会导致这些细胞发生凋亡⁴。慢性氧化应激与多种胃肠道疾病相关，例如炎症性肠病或癌症。例如，在Wnt驱动的肠癌小鼠模型中，NADPH氧化酶激活导致活性氧产生增加，而这一过程被发现是癌细胞过度增殖所必需的^{5, 6}。明确肠细胞（特别是干细胞）如何应对氧化应激，以及细胞微环境如何影响这种能力，对于深入理解该疾病的发病机制至关重要⁷。

在组织中，不同类型的细胞具有基础氧化状态，这种状态可能因其功能和代谢的不同，以及氧化分子和抗氧化分子表达水平的差异而有所变化^4,7监测ROS 体内 具有很大挑战性。已开发出可根据其氧化还原状态发射荧光的细胞通透性染料，用于在活细胞和活体动物中可视化和检测细胞内活性氧（ROS）。然而，其效果依赖于染料在活体组织中的扩散能力及其快速的信号读出，这使得它们在动物模型中的应用较为困难⁸.

过去，化合物对活性氧生成影响的研究通常使用细胞系进行，但这可能无法真实反映 体内 情况。由Clevers团队开发的肠道类器官模型⁹，能够促进肠道原代细胞的生长 离体在含有特定生长因子的基质中培养肠道隐窝，可形成三维结构，称为类器官（迷你肠），该结构可重现隐窝-绒毛样组织，其内腔由不同上皮细胞谱系的细胞排列构成，肠干细胞则位于类似隐窝的小突起中。

在此，利用该模型，通过将一种市售的活性氧敏感性染料加入类器官培养基中，描述了一种在单细胞分辨率下研究原代肠细胞氧化应激的简单方法。

酶标仪常用于检测整个细胞群体中的活性氧（ROS）产生情况。本实验方案采用流式细胞术或成像分析方法，结合基因改造细胞或特异性抗体染色，以检测特定细胞类型中的活性氧水平。本研究涉及小鼠肠道类器官的培养，并通过共聚焦成像实现活性氧的可视化，以及通过流式细胞术进行定量分析。利用Lgr5-GFP小鼠来源的小肠类器官，可针对不同处理条件下肠道干细胞的氧化应激水平进行特异性分析。该方案可进一步调整，用于检测外源性分子（如微生物群衍生的胞壁酰二肽（MDP）¹⁰）在刺激类器官后对活性氧平衡的影响。

方案

所有动物实验均在获得巴斯德研究所使用委员会和法国农业部（编号：2016-0022）批准后进行。所有步骤均在组织培养罩内操作。

1. 肠道类器官培养所需试剂与材料的准备

1. 配制培养基：将高级DMEM/F-12培养基与1×谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素（P/S）溶液、10 mM HEPES、50 ng/mL小鼠EGF、20 µg/mL小鼠Noggin和500 ng/mL小鼠R-Spondin1混合（见材料表）。在隐窝提取过程中，将培养基置于室温（RT）下备用。
   注意：未使用的培养基分装后于-20 °C冷冻保存，避免反复冻融。
2. 取一个50 mL离心管，加入40 mL高级DMEM/F-12培养基，并置于冰上备用。
   注意：未使用的培养基保存于4 °C，用于类器官传代。
3. 将细胞培养板（8孔µ-Slide腔室和/或96孔圆底板）在37 °C培养箱中预热。
4. 将基底膜基质（BMM）（见材料表）分装样品置于冰上解冻（在开始实验前或至少在接种隐窝前1小时进行）。
   注意：若未保持低温，BMM会迅速凝固。
5. 在DPBS中加入1%青霉素-链霉素溶液，配制洗涤/灌注溶液（DPBS-P/S）。
6. 在100 mm培养皿中加入10 mL冷DPBS-P/S。另取六个15 mL离心管，每管加入10 mL DPBS，并标记为F1至F6。
7. 用DPBS将0.5 M EDTA稀释，配制30 mL 10 mM EDTA溶液。取两个15 mL离心管，每管加入10 mL 10 mM EDTA溶液，并标记为E1和E2。
8. 所有溶液均需预先冷却至4 °C，并在操作过程中始终置于冰上。

2. 肠道类器官培养

1. 根据国家法规，处死一只8-10周龄的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）小鼠。
2. 采集空肠5-8 cm，范围包括十二指肠（距胃5 cm）至回肠（距盲肠10 cm）之间的区域，并将其置于冰上预冷的含青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（DPBS-P/S）中保存。
3. 用5-10 mL预冷的DPBS-P/S冲洗以清除肠腔内容物。
   注意：可使用自制冲洗注射器，方法是将200 µL枪头插入10 mL注射器喷嘴中。
4. 使用圆头剪刀纵向剖开肠道（参见材料表），以避免组织损伤。
5. 用镊子将组织转移至含有预冷DPBS-P/S的培养皿中，在室温下轻轻振荡清洗。
6. 用塑料巴斯德吸管通过抽吸方式抓取肠道，并转移至标记为E1、含有10 mL预冷10 mM EDTA的15 mL离心管中。
7. 将离心管轻轻颠倒3次，冰上孵育10分钟。
8. 用塑料巴斯德吸管将组织转移至含有10 mL DPBS的F1管中，涡旋振荡2分钟（使用普通涡旋仪，用手握住离心管，确保肠道充分旋转）。
9. 取10 µL液体滴入培养皿中，在显微镜下评估该组分的质量。
   注意：所有涡旋步骤均以最大速度进行，每一步的组分均需在显微镜下评估质量（图1）。
10. 用塑料巴斯德吸管通过抽吸方式抓取肠道，转移至含有10 mL DPBS的F2管中，涡旋振荡2分钟。
11. 重复步骤2.10，将组织转移至含有10 mL DPBS的F3管中，涡旋振荡2分钟。
12. 重复步骤2.6中的EDTA孵育过程，将组织转移至含有10 mM EDTA的E2管中。
13. 将离心管轻轻颠倒3次，冰上孵育5分钟。
14. 重复步骤2.10，将组织转移至含有10 mL DPBS的F4管中，涡旋振荡3分钟。
15. 重复步骤2.14，将组织转移至含有10 mL DPBS的F5管中，涡旋振荡3分钟。
16. 重复步骤2.15，将组织转移至含有10 mL DPBS的F6管中，涡旋振荡3分钟。
17. 将质量最佳的组分通过重力过滤，经70 µm细胞筛网收集至50 mL离心管（置于冰上），以去除绒毛和较大碎片。
    注意：通常F5和F6组分含有较多隐窝且碎片较少。
18. 在4 °C条件下以150 × g离心3分钟收集隐窝。
19. 弃去上清液，机械性吹打重悬沉淀，并加入5 mL预冷的DMEM/F12培养基。
20. 取10 µL悬液滴入培养皿中，在显微镜下手动计数该分样中隐窝的数量。
    注意：不要计数单个细胞或微小碎片。
21. 计算所需隐窝悬液的体积（V，单位为µL），假设每孔接种300个隐窝，W为所需孔数，N为10 µL悬液中计数得到的隐窝数量。将隐窝转移至新的15 mL离心管中。
    注意：V = 300 × W × 10/N。 若实验所需体积较小，可使用1.5 mL离心管。
22. 在4 °C条件下以200 × g离心3分钟收集隐窝。
23. 小心使用移液器吸除上清液。
24. 机械性吹打重悬沉淀，并轻柔加入生长培养基，使隐窝浓度达到90个/µL。
25. 加入两倍体积未稀释的基底膜基质（BMM），使最终浓度为30个隐窝/µL。轻柔吹打混匀，避免引入气泡。
    注意：始终将离心管置于冰上，以防BMM凝固。
26. 将10 µL隐窝/BMM混合液接种至每个孔中。用于流式细胞术分析时，使用圆底96孔板；将10 µL液体准确加至每孔中央，形成圆顶状。用于成像实验时，使用µ-slide 8孔板（参见材料表），并将10 µL液体铺成薄层。
    注意：成像实验应将类器官接种为薄层，以便实现深层成像。
27. 将培养板在室温下静置5分钟，使BMM凝固。随后将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育15分钟。
28. 向每孔中加入250 µL生长培养基，注意避免冲散BMM。
29. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养。
30. 在培养第4至第6天之间进行活性氧（ROS）分析。否则，当出现多个长出芽结构且类器官腔内积累死亡细胞时，更换培养基并传代类器官。

3. 类器官传代

1. 从小肠类器官第6代开始进行传代^th 培养第几天，当出现明显的出芽结构且类器官腔隙变暗时。
   注意：类器官腔内会因死亡细胞、碎片和黏液的积聚而变暗。在传代前应避免类器官过度生长。传代比例取决于类器官的生长情况，建议在第6天以1:2的比例传代，第10天以1:3的比例传代。
2. 将4 mL冷的Advanced DMEM/F-12加入15 mL离心管中，并置于冰上保存。
   注意：此处提供的是96孔培养板的体积。若使用其他规格的培养板，需相应调整体积。
3. 用移液管或真空泵小心吸去孔中的培养基，避免接触BMM半球状结构，并弃去。
4. 每孔加入 100 µL 冷的 Advanced DMEM/F-12。用移液器吹打数次以破碎 BMM，然后将孔内液体转移至 15 mL 离心管中。
5. 用 200 µL 冷的 Advanced DMEM/F-12 洗涤孔板，并将洗液收集至同一离心管中。
   注意：若对同一实验条件下多个孔中的细胞进行传代，可将各孔内容物汇集至同一个15 mL收集管中。
6. 将15 mL收集管以100 x g离心 g 4°C 下离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，向沉淀中加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12培养基。使用P1000枪头吸取一个无滤芯的P10枪头，上下吹打至少20次。
8. 加入4 mL冷的Advanced DMEM/F-12至离心管中。在300 x g 4°C 下 5 分钟
9. 用移液器或真空泵吸去上清液，注意不要扰动沉淀。随后，通过机械方式将沉淀打散。
10. 加入用生长培养基稀释的BMM（2:1比例）。轻轻吹打混匀，避免在混合物中引入气泡。
11. 将10 µL隐窝/BMM混合物接种至每个孔中。
12. 室温放置 5 分钟，使 BMM 凝固。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中₂ 15 分钟。
13. 每孔加入 250 µL 培养基。
    注意：小心操作，避免使BMM脱落。
14. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂.

4. 肠类器官中氧化应激评估所用试剂与材料的制备

1. 配制250 mM的抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）储备液（参见材料表），用245 µL DPBS重悬10 mg NAC。使用时终浓度为1 mM。
2. 配制50 mM的诱导剂叔丁基过氧化氢（tBHP，70%水溶液）储备液，取3.22 µL用496.8 µL DPBS稀释。使用时终浓度为200 µM。
3. 进行流式细胞术检测时，将荧光探针的储备液用DMSO按1:10稀释，配制成250 µM的工作液（参见材料表）。使用时终浓度为1 µM。
   注意：根据生产商说明书，该荧光探针对光和氧敏感。储备液和分装样品不应反复多次开启和关闭。
4. 进行成像检测时，将荧光探针的储备液用DMSO按1:2稀释，配制成1.25 mM的工作液。使用时终浓度为5 µM。
5. 用DPBS配制终浓度为0.1 µg/mL的DAPI溶液，用于流式细胞术检测中区分死细胞。
6. 将Hoechst 33342用DPBS稀释至1.25 mg/mL。使用时终浓度为5 µg/mL，用于成像检测中的细胞核染色。
7. 将不含酚红的DMEM在37 °C预热。
   ​注意：这些步骤描述了任何实验中必须包含的阴性对照和阳性对照的使用方法，具体条件见图2A。该实验可用于检测抗氧化或促氧化化合物。实验步骤相同，唯一区别在于待测化合物是在加入荧光探针之前添加。

5. 通过共聚焦显微镜观察三维类器官中的氧化应激

1. 取接种于 µ-Slide 8 孔板中的类器官，在相应孔中加入 1 µL NAC 储存液，使终浓度为 1 mM。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。
3. 在相应孔中加入 1 µL tBHP 储存液，使终浓度为 200 µM。
4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
5. 每孔加入 1 µL 浓度为 1.25 mM 的荧光探针稀释液，使终浓度为 5 µM。
6. 每孔加入 1 µL 浓度为 1.25 mg/mL 的 Hoechst 稀释液，使终浓度为 5 µg/mL。
7. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
8. 小心移除培养基，避免扰动基底膜基质（BMM）。轻柔加入 250 µL 预热的无酚红 DMEM 培养基。
   注意：若计划进行长时间成像，应在无酚红 DMEM 中添加生长因子类化合物。
9. 使用配备温控腔室和气体供应系统的共聚焦显微镜对类器官进行成像，检测荧光探针（ROS）信号。
   注意：荧光探针的激发/发射波长（ex/em）为 644/665，Hoechst（细胞核）为 361/486，GFP（来自 Lgr5-GFP 小鼠的肠干细胞）为 488/510。检测干细胞信号时使用 63 倍油浸物镜。不同样本间不得更改激光设置。可使用 20 倍物镜以获得 ROS 产生的整体视图。
10. 利用阳性对照设定 ROS 信号的激光强度和曝光时间，并确认该信号在阴性对照中较低。
11. 通过目镜观察载片，识别表达 GFP 的类器官，并 调整激光强度。
    注意：此步骤需手动完成。
12. 设定成像位置，以获得整个类器官的拼接图像。设置 z 轴层扫为 25 µm（步长 5 µm），以获取显示单层细胞的类器官切片。
    注意：请参考显微镜用户手册优化设置。活细胞成像应在孵育结束后 1 小时内完成。
13. 在开源图像处理软件中打开图像（参见 材料表）。
14. 浏览 z 轴层扫图像，选择类器官中部结构清晰的层面，并基于选定区域创建新图像。
15. 按照步骤 5.15.1–5.15.5 对图像进行定量分析。
    1. 选择自由手绘线工具。
    2. 沿细胞核轮廓绘制线条。
       注意：若仅分析干细胞，应仅选择含有 GFP 阳性细胞的区域。
    3. 增加线宽，使线条覆盖整个细胞层，但避免包含管腔内的碎片。
    4. 选择 ROS 信号通道，测量所选区域的荧光强度，并记录数值。
    5. 在无信号区域绘制线条，测量背景荧光强度，并将该值从先前测得的数值中扣除，以获得最终荧光强度。

6. 使用流式细胞仪定量分析解离类器官中的氧化应激水平

1. 在阴性对照孔中加入 1 µL NAC 储存液，使终浓度为 1 mM。
   注意：使用接种于 96 孔圆底培养板中的类器官。
2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。
3. 在相应孔中加入 1 µL tBHP 储存液，使终浓度为 200 µM。
4. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
5. 使用多通道移液器小心移除培养基，避免扰动贴壁的 BMM，并将其转移至另一个 96 孔圆底培养板中。将该板暂置一旁。
6. 加入 100 µL 胰蛋白酶溶液，使用多通道移液器反复吹打至少五次，以破坏 BMM 结构。
7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育不超过 5 分钟。
8. 使用多通道移液器反复吹打至少五次，以解离类器官。
9. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
10. 将培养板倒置弃去上清液。将步骤 6.3 中收集的培养基重新加回到相应孔中，并通过上下吹打 5 次重悬细胞。
11. 加入终浓度为 1 µM 的荧光探针。每孔加入 1 µL 250 µM 稀释液，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
    注意：请勿向用于仪器设置的孔中添加荧光探针（图 2B）。
12. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
13. 用 250 µL 浓度为 0.1 µg/mL 的 DAPI 溶液重悬细胞。将样品转移至相应的流式细胞仪检测管中，置于冰上，并立即进行分析。
    注意：向用于仪器设置的孔中加入 PBS 代替 DAPI（图 2B）。
14. 使用单染样品优化未染色对照的前向散射和侧向散射电压设置，以及每种荧光染料的激光电压。
15. 采用适当的设门策略（图 4A），至少采集 20,000 个事件。
    注意：推荐采集 50,000 个事件。具体采集参数根据所用仪器的不同而有所调整。

结果

作为所述方案的概念验证，采用了来自 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 小鼠品系的隐窝组织，该品系中肠干细胞呈现嵌合性 GFP 表达，这一模型最初由 Barker 等人建立，用于表征肠干细胞¹⁰，并可根据其 GFP 表达对这些细胞进行示踪。该模型可用于比较特定细胞群体在不同处理条件下活性氧（ROS）水平的变化。实验中使用了一种 ROS 抑制剂（NAC）和一种已知可作用于细胞内 ROS 的诱导剂（tBHP），以可视化其水平的变化。

图1A 和 1B 展示了在肠类器官培养过程中进行隐窝提取时获得的 F1 和 F4 部分的代表性图像。在提取过程中，每个部分都必须在显微镜或双目镜下进行检查，以观察隐窝的脱落情况，并确定富含隐窝的部分，而非绒毛、单个细胞或碎片。选择出的富含隐窝的部分将被合并，并通过 70 µm 细胞滤网，以去除残留的绒毛碎片，从而获得仅含隐窝的制备物（图1C）。隐窝...

讨论

本研究提供了一种分步操作方案，用于分离小鼠空肠隐窝，将其培养为三维类器官，并通过结合活性氧（ROS）敏感型荧光探针，对完整类器官进行定性显微成像，以及在类器官解离为单细胞后，利用流式细胞术进行单细胞水平的活性氧定量检测。

该方法的第一步关键操作是隐窝提取过程。实际上，隐窝制备的质量是类器官成功形成的关键。因此，获得富含隐窝且细胞碎片或死亡细胞较少的组分至关重要。由于解离程度可能因小鼠的年龄和健康状况而异，隐窝可能出现在与本方案所述不同的组分中。可根据实际情况调整EDTA孵育的次数。如果在第4组分后隐窝仍未明显脱落，则需要重复一次3分钟的EDTA孵育。相反，如果在第一次EDTA孵育后隐窝已开始脱落，则可能无需进行第二次EDTA孵育，此时应继续在DPBS中依次进行涡旋操作，直至获得含有足够数量且无碎片的隐窝组分。若未发生解离，请确保用于制备收集管的DPBS不含Ca²⁺和Mg²⁺，并更换新的EDTA溶液。隐窝结构较为脆弱，因此在分离过程中应尽可能保持在冰上，并在分离后迅速接种。

可使用不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>小鼠
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）	杰克逊实验室
<强>生长培养基
高级DMEM/F12（DMEM/F12）	赛默飞世尔科技	12634010
B-27添加剂，不含维生素A	赛默飞世尔科技	12587010	储存浓度：50倍
GlutaMAX (谷氨酰胺)	ThermoFisher	35050038	储存浓度：100倍
Hepes	赛默飞世尔科技	15630056	储存浓度：1 M
小鼠EGF	R&研发	2028-EG-200	储存浓度：500 µg/mL 在 PBS 中
小鼠Noggin	R&研发	1967-NG/CF	储存浓度：100 µg/mL 在 PBS 中
小鼠 R-spondin1	R&研发	3474-RS-050	储存浓度：50 µg/mL in PBS
N-2 补充剂	赛默飞世尔科技	17502048	储存浓度：100倍
青霉素-链霉素（P/S）	ThermoFisher	15140122	储存浓度：100倍浓缩液（每毫升含10,000单位青霉素和10,000 µg/mL 的链霉素
<强>材料
70 µm细胞滤筛	康宁	352350
96孔圆底板	康宁	3799
球头剪	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® 深红试剂	赛默飞世尔科技	C10422
DAPI（4’,6-二氨基-2-苯并咪唑啉é尼吲哚二盐酸盐) (荧光探针)	赛默飞世尔科技	D1306	10 mg/mL 的储备液
不含钙不含镁的1×DPBS缓冲液（DPBS）	赛默飞世尔科技	14190144
FLuoroBrite DMEM无酚红DMEM)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	赛默飞世尔科技	H3570	10 mg/mL 储存液
基质胶生长因子减少型，无酚红（基底膜基质)	康宁	356231	收到后在冰箱中过夜解冻，置于冰上保持1小时，分装成500 mL等份，于-20 °C保存 °C
µ-第8号载玻片培养室	Ibidi	80826
N-乙酰半胱氨酸（NAC）	Sigma	A9165
过氧化叔丁基（tBCHP）溶液（70% wt.，以 H2O2 计）	Sigma	458139
TrypLE Express 酶（1X），无酚红（胰蛋白酶)	赛默飞世尔科技	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	赛默飞世尔科技	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	用于组织解离过程中减少细胞死亡的ROCK抑制剂
<强>项目与设备
Attune NxT（流式细胞仪）	ThermoFischer		流式细胞仪分析仪
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		图像生成
FlowJo	BD 生物科学		FACS 分析
Observer.Z1	Zeiss		共聚焦系统
Opterra（扫描场共聚焦）	布鲁克		共聚焦系统
高灵敏度EMCCD相机Evolve Delta 512	Photometrics		共聚焦系统
Prism	GraphPad Software		统计分析