利用活性氧敏感型荧光探针对小鼠肠道类器官中的氧化应激进行分析

摘要

本实验方案描述了一种利用定性成像和定量流式细胞术检测小鼠肠道类器官中活性氧（ROS）的方法。该方法可进一步扩展至其他荧光探针，用于检测特定化合物对活性氧的影响。

摘要

活性氧（ROS）在肠道稳态中发挥着重要作用。ROS 是细胞代谢的天然副产物，可在黏膜水平响应感染或损伤而产生，参与抗菌反应和伤口愈合过程。它们也是关键的第二信使，调控包括细胞生长和分化在内的多种信号通路。另一方面，过量的 ROS 会导致氧化应激，对细胞产生有害影响，并促进慢性炎症或癌症等肠道疾病的发生。本研究提供了一种简便的方法，利用 commercially available 的荧光探针，通过活体成像和流式细胞术检测小鼠肠道类器官中的 ROS。本文所述方案描述了检测调节肠道类器官氧化还原平衡的化合物效应，并在特定肠道细胞类型中检测 ROS 水平的操作流程，以 GFP 遗传标记的肠道干细胞分析为例进行说明。该方案也可与其他荧光探针联合使用。

引言

活性氧（ROS）是细胞代谢的天然副产物。它们也可以由特定的酶复合物主动产生，例如膜结合的NADPH氧化酶（NOX）和双氧化酶（DUOX），这些酶可生成超氧阴离子和过氧化氢¹。细胞通过表达抗氧化酶和活性氧清除剂，能够精细调节其氧化还原平衡，从而维持组织稳态²。尽管活性氧对细胞具有高度毒性，并可损伤DNA、蛋白质和脂质，但它们也是关键的信号分子²。在肠上皮中，适度的活性氧水平是干细胞和祖细胞增殖所必需的³；而高水平的活性氧则会导致这些细胞发生凋亡⁴。慢性氧化应激与多种胃肠道疾病相关，例如炎症性肠病或癌症。例如，在Wnt驱动的肠癌小鼠模型中，NADPH氧化酶激活导致活性氧产生增加，而这一过程被发现是癌细胞过度增殖所必需的^{5, 6}。明确肠细胞（特别是干细胞）如何应对氧化应激，以及细胞微环境如何影响这种能力，对于深入理解该疾病的发病机制至关重要⁷。

在组织中，不同类型的细胞具有基础氧化状态，这种状态可能因其功能和代谢的不同，以及氧化分子和抗氧化分子表达水平的差异而有所变化

方案

所有动物实验均在获得巴斯德研究所使用委员会和法国农业部（编号：2016-0022）批准后进行。所有步骤均在组织培养罩内操作。

1. 肠道类器官培养所需试剂与材料的准备

1. 配制培养基：将高级DMEM/F-12培养基与1×谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素（P/S）溶液、10 mM HEPES、50 ng/mL小鼠EGF、20 µg/mL小鼠Noggin和500 ng/mL小鼠R-Spondin1混合（见材料表）。在隐窝提取过程中，将培养基置于室温（RT）下备用。
   注意：未使用的培养基分装后于-20 °C冷冻保存，避免反复冻融。
2. 取一个50 mL离心管，加入40 mL高级DMEM/F-12培养基，并置于冰上备用。
   注意：未使用的培养基保存于4 °C，用于类器官传代。
3. 将细胞培养板（8孔µ-Slide腔室和/或96孔圆底板）在37 °C培养箱中预热。
4. 将基底膜基质（BMM）（见材料表）分装样品置于冰上解冻（在开始实验前或至少在接种隐窝前1小时进行）。
   注意：若未保持低温，BMM会迅速凝固。
5. 在DPBS中加入1%青霉素-链霉素溶液，配制洗涤/灌注溶液（DPBS-P/S）。
6. 在100 mm培养皿中加入10 mL冷DPBS-P/S。另取六个15 mL离心管，每管加入....

结果

作为所述方案的概念验证，采用了来自 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 小鼠品系的隐窝组织，该品系中肠干细胞呈现嵌合性 GFP 表达，这一模型最初由 Barker 等人建立，用于表征肠干细胞¹⁰，并可根据其 GFP 表达对这些细胞进行示踪。该模型可用于比较特定细胞群体在不同处理条件下活性氧（ROS）水平的变化。实验中使用了一种 ROS 抑制剂（NAC）和一种已知可作用于细胞内 ROS 的诱导剂（tBHP），以可视化其水平的变化。

图1A 和 1B 展示了在肠类器官培养过程中进行隐窝提取时获得的 F1 和 F4 部分的代表性图像。在提取过程中，每个部分都必须在显微镜或双目镜下进行检查，以观察隐窝的脱落情况，并确定富含隐窝的部分，而非绒毛、单个细胞或碎片。选择出的富含隐窝的部分将被合并，并通过 70 µm 细胞滤网，以去除残留的绒毛碎片，从而获得仅含隐窝的制备物（图1C）。隐窝.......

讨论

本研究提供了一种分步操作方案，用于分离小鼠空肠隐窝，将其培养为三维类器官，并通过结合活性氧（ROS）敏感型荧光探针，对完整类器官进行定性显微成像，以及在类器官解离为单细胞后，利用流式细胞术进行单细胞水平的活性氧定量检测。

该方法的第一步关键操作是隐窝提取过程。实际上，隐窝制备的质量是类器官成功形成的关键。因此，获得富含隐窝且细胞碎片或死亡细胞较少的组分至关重要。由于解离程度可能因小鼠的年龄和健康状况而异，隐窝可能出现在与本方案所述不同的组分中。可根据实际情况调整EDTA孵育的次数。如果在第4组分后隐窝仍未明显脱落，则需要重复一次3分钟的EDTA孵育。相反，如果在第一次EDTA孵育后隐窝已开始脱落，则可能无需进行第二次EDTA孵育，此时应继续在DPBS中依次进行涡旋操作，直至获得含有足够数量且无碎片的隐窝组分。若未发生解离，请确保用于制备收集管的DPBS不含Ca²⁺和Mg²⁺，并更换新的EDTA溶液。隐窝结构较为脆弱，因此在分离过程中应尽可能保持在冰上，并在分离后迅速接种。

可使用不同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>小鼠
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）	杰克逊实验室
<强>生长培养基
高级DMEM/F12（DMEM/F12）	赛默飞世尔科技	12634010
B-27添加剂，不含维生素A	赛默飞世尔科技	12587010	储存浓度：50倍
GlutaMAX (谷氨酰胺)	ThermoFisher	35050038	储存浓度：100倍
Hepes	赛默飞世尔科技	15630056	储存浓度：1 M
小鼠EGF	R&研发	2028-EG-200	储存浓度：500 µg/mL 在 PBS 中
小鼠Noggin	R&研发	1967-NG/CF	储存浓度：100 µg/mL 在 PBS 中
小鼠 R-spondin1	R&研发	3474-RS-050	储存浓度：50 µg/mL in PBS
N-2 补充剂	赛默飞世尔科技	17502048	储存浓度：100倍
青霉素-链霉素（P/S）	ThermoFisher	15140122	储存浓度：100倍浓缩液（每毫升含10,000单位青霉素和10,000 µg/mL 的链霉素
<强>材料
70 µm细胞滤筛	康宁	352350
96孔圆底板	康宁	3799
球头剪	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® 深红试剂	赛默飞世尔科技	C10422
DAPI（4’,6-二氨基-2-苯并咪唑啉é尼吲哚二盐酸盐) (荧光探针)	赛默飞世尔科技	D1306	10 mg/mL 的储备液
不含钙不含镁的1×DPBS缓冲液（DPBS）	赛默飞世尔科技	14190144
FLuoroBrite DMEM无酚红DMEM)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	赛默飞世尔科技	H3570	10 mg/mL 储存液
基质胶生长因子减少型，无酚红（基底膜基质)	康宁	356231	收到后在冰箱中过夜解冻，置于冰上保持1小时，分装成500 mL等份，于-20 °C保存 °C
µ-第8号载玻片培养室	Ibidi	80826
N-乙酰半胱氨酸（NAC）	Sigma	A9165
过氧化叔丁基（tBCHP）溶液（70% wt.，以 H2O2 计）	Sigma	458139
TrypLE Express 酶（1X），无酚红（胰蛋白酶)	赛默飞世尔科技	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	赛默飞世尔科技	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	用于组织解离过程中减少细胞死亡的ROCK抑制剂
<强>项目与设备
Attune NxT（流式细胞仪）	ThermoFischer		流式细胞仪分析仪
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		图像生成
FlowJo	BD 生物科学		FACS 分析
Observer.Z1	Zeiss		共聚焦系统
Opterra（扫描场共聚焦）	布鲁克		共聚焦系统
高灵敏度EMCCD相机Evolve Delta 512	Photometrics		共聚焦系统
Prism	GraphPad Software		统计分析