荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织法（FACS-RTT）用于确定放射性信号的细胞来源

摘要

荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）是一种强大的工具，用于研究18 kDa转位蛋白或5-羟色胺5HT受体在特定组织中表达细胞的功能。_2A阿尔茨海默病中受体表达的细胞尺度研究。本方案描述了 离体 FACS-RTT 在 TgF344-AD 大鼠模型中的应用

摘要

胶质细胞可能在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的病理生理过程中具有重要影响。这些细胞的改变可能与促炎状态相关。TgF344-AD 大鼠品系被设计用于表达人源 APP 和人源 PS1。_ΔE9 基因，编码淀粉样蛋白 Aβ-40 和 Aβ-42，随年龄增长表现出淀粉样病理改变和认知功能缺陷。本研究采用 TgF344-AD 大鼠模型，评估 18 kDa 转运蛋白（TSPO，胶质细胞活化的标志物）结合的细胞来源以及 5HT_2A受体（5HT_2AR）受体水平，这些受体在阿尔茨海默病（AD）中可能受到干扰。本文介绍的技术是荧光激活细胞分选结合放射性配体标记组织技术（FACS-RTT），一种可定量、特异性针对细胞类型的分析方法，可作为补充手段 体内 PET 或 SPECT 或 离体/体外 自显影技术。该方法利用细胞分选后通过γ计数器对先前成像所用的同种放射性标记示踪剂进行定量，从而以高细胞特异性和灵敏度确定放射性标记蛋白的细胞来源。例如，FACS-RTT研究显示：（i）在脂多糖（LPS）诱导的神经炎症大鼠模型中，TSPO结合增加与小胶质细胞相关；（ii）在TgF344-AD大鼠中，与野生型（WT）大鼠相比，12个月和18个月时TSPO结合的增加首先与星形胶质细胞相关，随后与小胶质细胞相关；（iii）纹状体中5HT的密度_2A在相同的AD大鼠模型中，星形胶质细胞在18个月时R值降低。有趣的是，该技术可几乎推广至所有放射性示踪剂。

引言

神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的特征是神经元丢失，并伴随症状的逐渐加重。AD 是痴呆症最常见的病因，占所有病例的 60%–70%，全球约有 5000 万人受其影响¹。在神经病理学层面，AD 的两个主要特征是细胞外淀粉样β（Aβ）斑块的积聚和细胞内 Tau 蛋白形成的神经原纤维缠结。胶质细胞的改变也与 AD 相关²，并可能涉及多种神经递质系统的功能障碍^3,4。

TgF344-AD 大鼠品系经过基因改造，通过表达人源 APP 和 PS1_ΔE9 转基因来模拟阿尔茨海默病（AD），从而导致可溶性和不可溶性 Aβ-40 与 Aβ-42 的表达以及淀粉样斑块的形成⁵。该模型还表现出 Tau 蛋白的过度磷酸化形式的累积，进而引发 tau 蛋白病。从 9 至 24 个月龄开始，这些大鼠会逐渐发展出 AD 的典型病理特征，并伴随认知功能障碍^5,6,7,8....

方案

所有实验程序均分别符合瑞士日内瓦州人类与动物实验伦理委员会、州级研究伦理委员会（CCER）以及日内瓦州卫生总署的规定。数据报告遵循《动物研究：报告》 体内 实验（ARRIVE）指南

1. SPECT 相机的准备与校准

1. 打开相机，加载操作软件（参见材料表）。点击归零 XYZ 载物台按钮以执行归零操作。
2. 设置实验，包含一次持续 10 分钟的扫描采集。将步进模式设为精细，将采集模式设为列表模式（用于记录完整的发射光谱）。
3. 设置扫描床，并确保加热系统、呼吸传感器和麻醉装置功能正常且固定牢固（图 1A-D）。然后，将一个模体（即含有已知浓度¹²⁵I 的 2 mL 溶液置于 2 mL 微离心管中）放置在动物头部将要定位的位置（居中放置，图 1E）。
4. 通过屏幕底部三个图像辅助，滑动三个维度的光标来设定扫描区域。确保模体与动物的扫描体积相同。
5. 使用步骤 1.2–1.4 中设定的参数开始对模体进行扫描....

结果

野生型大鼠在单侧注射LPS后接受了in vivo SPECT扫描，使用[¹²⁵I]CLINDE放射性示踪剂（图2）。该扫描（采用放射性示踪剂注射后45–60分钟图像的叠加数据）显示，在LPS注射部位的大脑区域（图2A）中，[¹²⁵I]CLINDE的结合信号高于对侧脑区（图2B）。后续对ex vivo样本进行FACS-RTT分析，验证了上述结果，并揭示[¹²⁵I]CLINDE结合位点数量的增加仅存在于小胶质细胞中，表明脑同侧[¹²⁵I]CLINDE信号的细胞来源为小胶质细胞（图3A）¹⁵。

使用相同的[¹²⁵I]CLINDE放射性示踪剂，该方案在老年TgF3.......

讨论

据我们所知，该技术首次描述了一种能够更深入理解放射性示踪剂在活体细胞水平上结合变化的方法。in vivo 结合变化的放射性示踪剂可通过本方案进行量化分析，本方案以[¹²⁵I]CLINDE（TSPO）和[¹²⁵I]R91150（5HT_2AR）为例，介绍了一种在细胞水平上定量放射性示踪剂结合的多尺度方法。

该技术具有足够的稳健性和灵敏度，可精确定位多种胶质细胞改变的细胞来源，其检测范围涵盖由脂多糖（LPS）诱导的强烈炎症反应，到阿尔茨海默病（AD）大鼠模型中观察到的更为细微的胶质细胞变化，从而为研究提供重要的补充信息 体内 核神经影像学，确定了SPECT所获得信号的微胶质细胞来源。该研究进一步表明，FACS-RTT甚至能够以5HT为例，在细胞尺度上分辨神经受体密度的变化_2AR (图3C最后，研究提供了该技术在人类死后组织中应用的证据，显示阿尔茨海默病（AD）受试者星形胶质细胞和小胶质细胞中的TSPO浓度升.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich
乙腈	Sigma-Aldrich
BioVet	BioVet		生命体征检测软件
Bondclone C18 反相色谱柱	Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur	日内瓦大学医院		病毒灭活剂
Fc阻断剂 / 抗CD32抗体	BD Biosciences	BDB550270	适用于大鼠
FITC标记的抗大鼠CD90抗体	Biolegend	202504	适用于大鼠
肝素	B. Braun	B01AB01
高效液相色谱仪（HPLC）	Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm	BD Biosciences	321312	24 G导管
异氟烷	Baxter	ZDG9623
Lacryvisc	Alcon	2160699
LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
美皮护软胶带	3M	F51DA01
MILabs-Uspect II	MILabs		SPECT相机软件
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		细胞分选仪
髓鞘去除磁珠II	Miltenyi Biotec	130-096-733	包含磁珠和髓鞘去除缓冲液
0.9%氯化钠无菌溶液	B. Braun	395202
神经组织解离试剂盒（P型）	Miltenyi Biotec	130-092-628	包含酶混合物、移液管1、2和3
尼龙筛网片	Amazon	CMN-0074-10YD	宽度40英寸，孔径80微米
过氧乙酸	Sigma-Aldrich
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976
R91150 précursor	CERMN
Sep-Pak C18 柱	Waters		浓缩柱
碘化钠 Na125	PerkinElmer
三丁基锡前体	CERMN
U-SPECT Rec2.38c	MILabs	Version Rec2.38c	SPECT图像重建软件
USPECT II	MILabs		SPECT相机
Wizard 3"	PerkinElmer		γ计数器