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方法文章

利用阴道灌洗法监测啮齿类动物动情周期：并不存在所谓的正常周期

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DOI：

10.3791/62884

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2021年8月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

本文内容

摘要

本研究详细阐述了涉及雌性大鼠的实验设计中需要考虑的关键因素。从更广泛的意义上讲，这些数据有助于减少偏见，并推动开发更具包容性的诊断和干预工具。

摘要

本方法建立了一种可重复、标准化且经济有效的监测雌性Sprague Dawley（SD）青春期大鼠动情周期的方法。本研究揭示了激素周期的复杂性，以及构建可靠且有效监测技术所需具备的广泛知识体系。通过对主要实验设计和操作要素的深入探讨， 本文对动情周期及其基本原理的描述为更深入的理解提供了框架，并澄清了常见误解，有助于未来的重复实验。

本文在概述采用阴道灌洗法进行样本采集流程的同时，详细描述了将数据归类为动情前期、动情期、动情后期和动情间期这四个阶段模型的方法。这些阶段的划分依据一种新提出的分类方法，该方法利用采集样本时阴道液体状态、存在的细胞类型、细胞排列方式以及细胞数量这四个分类决定因素。文中还展示了各个阶段的变异情况、优质与劣质样本的区分、周期性与无周期性的区别，并配以所采集分类组分的图示，以及数据解读与组织的有效实践方法。总体而言，这些工具首次实现了可量化数据范围的发表，从而在重复实验中推动分类因素的标准化。

引言

新贡献
啮齿类动物的动情周期 已被确定为健康状况的重要指标。然而，研究人员对女性身体的无意识偏见以及错误解读，阻碍了科学界的发展。该词的词源本身 "动情期" 意味着 自卑感和消极情绪。欧里庇得斯使用该词来描述一种 "狂热" 或疯狂，荷马用以描述恐慌，柏拉图用以描述非理性的冲动。本研究强调了这些原始观点如何影响当今科学界，并通过一种新颖的镶嵌范式来回应这些关切——该范式整合了先前研究过的方法，扩展其范围，以实现更全面的研究途径。

该技术的研究与应用十分必要，原因如下：首先，目前尚无标准化且全面的监测技术，且数据解读方法可能不够明确；其次，尽管动情周期的特征取决于所研究的具体大鼠个体，但这些特征常被过度泛化；第三，尽管激素周期是常规且有益的生理过程，但其周围仍存在诸多误解与争议。 在“向人类转化”部分探讨了有害的污名化问题。本研究旨在从三个方面解决这三个问题——（A） 通过详细描述一种深入的动情周期监测技术，并阐明如何解读结果；（B）通过概述能够保持每个周期完整性和个体特征的方法；（C）通过指出长期存在的误解，以纠正缺乏科学依据的实践。

本研究的独特之处还在于其聚焦于青春期大鼠，这一时期伴随着关键的发育变化，有助于揭示成年期多种行为、解剖和生理表现1。通过建立标准化的实验设计，以监测研究尚不充分的群体中的激素周期，同时解构常见的偏倚，将有助于建立可靠且有效的激素相关性2,3,4，并确定依赖于特定条件的周期紊乱情况5,6,7,8,9,10。最终，这些创新有助于拓展多种健康问题的诊断标准、治疗方法和干预手段。

基本定义与用途
动情周期是一系列动态生理过程的集合，这些过程由三种周期性变化的雌性性类固醇激素引发：雌二醇、黄体生成素（LH）和孕酮（图1A，B）。内分泌系统与中枢神经系统之间的相互作用调控着该周期，该周期通常持续4-5天，并从性成熟开始一直反复出现，直至生殖衰老和/或终止。根据激素水平的不同，动情周期被划分为若干阶段——最常见的是分为四个阶段：动情间期（DIE）、动情前期（PRO）、动情期（EST）和动情后期（MET），各阶段按循环顺序依次进行。划分的阶段数量可从3个11到13个12不等，具体取决于研究的性质13。较少的阶段划分通常不将MET单独列为一个阶段，而是将其视为一个短暂的过渡时期。较多的阶段划分则通常包含更细的亚阶段，以便更细致地观察诸如肿瘤发展或自发性假孕等现象，后者指未发生胚胎着床的妊娠生理状态12,14,15。

在本研究中，通过阴道腔的组分来确定各阶段，这些组分称为三个分类决定因素——存在的细胞类型、细胞排列方式和细胞数量（图2A-D）。尽管本研究未监测阴道分泌物的状态，但建议将其作为第四个分类组分纳入。有关阴道分泌物检查的更多资料可参见参考文献列表16。可通过阴道灌洗提取细胞来观察这些分类组分，这是目前推荐用于动情周期监测的主要技术。虽然各阶段内部的详细生理过程不在本研究范围之内，但相关文献中可提供更多信息17。

该动情周期监测技术的应用与持续发展，源于性类固醇激素与机体系统（如心血管系统18、内分泌系统8和中枢神经系统19,20,21）功能之间的关联。同时，在涉及雌性啮齿类动物的研究中，动情周期监测并非总是必要22,23,24,25。更重要的是，首先应考虑在特定研究领域中是否已有性差异的报道，相关内容可在已发表的综述中进一步查阅22,23。尽管动情周期监测在广泛的研究领域中至关重要，但不应将其视为在实验中纳入雌性啮齿类动物的障碍。虽然该技术看似复杂且耗时，但实际操作可在15分钟内完成（具体时间取决于研究人员），且具有成本效益。总体而言，在科学研究中纳入雌性啮齿类动物有助于更好地理解机体系统、多种疾病状态及病理过程，以及整体健康状况，因为目前的许多研究成果主要基于雄性个体模型。

啮齿类动物中的通用参数与自然变异性
确定被视为"典型"特征的范围，对于定义标准周期模式、设定比较与分析参数，以及识别异常情况和离群值至关重要。同时，也必须认识到每只大鼠的周期均具有独特性，且因动物品系、生理过程及环境条件不同而产生的偏差是正常现象。事实上，动情周期最"正常"的特征之一就是其变异性。这种变异性体现在整个周期长度上，范围可从3至38天26,27；性成熟年龄可从32–34天至数周不等28,29,30；对无周期状态的界定11，以及分类判定模式的差异11,13。总体而言，动情周期并不存在普适性的模板，将这一概念传达给科学界及公众，是实验过程中重要的一环。

实验时间点与发育年龄
认识到这种变异性的原则有助于建立可靠且有效的实验设计。例如，动情周期监测的起始依赖于大鼠的解剖和生理发育，而这些发育过程会因环境和生理因素的不同而存在差异。监测必须等到阴道开口（VO）发育完成后才能开始，VO 是指由外阴包围的外阴道口，通向阴道管的内部区域（图 3A-D）。虽然 VO 通常在 32 至 34 日龄之间完全发育，但其发育时间因个体而异，且该过程的许多方面仍不明确。VO 的出现曾被用于标识性成熟开始的标志，这与雌二醇水平升高31、下丘脑-垂体-卵巢轴的成熟32以及大鼠首次排卵17, 33,34,35相关联。然而，近期的研究发现，VO 仅是生殖发育的间接指标，因为在不利环境中，VO 的发育可能与激素变化和发育事件脱节31，并且可能反映的是雌二醇水平的变化而非真正的性成熟33。因此，建议不应仅依赖 VO 来确定发育年龄或作为动情周期监测的资格标准36，而应同时结合首次 EST 阶段的出现以及上皮细胞角化的现象30，以更准确地标记性成熟的开始。

在啮齿类动物的青春期，体重与发育年龄显著相关30,37，因此也可用于辅助判断该时期的发育年龄。与此现象相关的提出机制包括：生长激素等生殖发育所需激素的刺激作用，以及食欲调节因子瘦素对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的抑制作用30。然而，由于不同品系及供应商来源的大鼠之间体重存在较大差异，不建议将体重作为发育年龄的唯一判断指标38。腹内侧核（VO）发育和体重变化所表现出的变异性，凸显了这一概念在整个实验过程中的重要性。

向人类的转化：文化与科学背景
动物与人类生殖研究之间的转化关系是双向的。基于动物的研究结果会影响人类相关生理过程的评估、研究方法和分析方式39。而人们对人类生殖系统及其相关过程的认知，也会影响动物研究的设计与实施。事实上，该领域进一步研究的最强烈动因之一，源于与激素周期相关的社会文化偏见，这些偏见影响了科学研究的过程。许多此类惯例源于社会文化中普遍对月经话题的回避，导致在经过充分验证的知识方面存在数据空白40,41。这种缺失带来一系列从轻微到致命的后果——从货架高度和智能手机尺寸的设计，到警用防弹衣的合身性以及癌症漏诊等问题42。

在权威典籍、媒体、词典和医学教学中，月经常被描述为不卫生、破坏性和有毒的，这种观念被科学出版物所延续。这种延续体现在对激素周期的不准确和带有偏见的描述、将生殖系统与其神经内分泌系统及环境影响相割裂，以及将周期完成简单地视为“未能受孕”的还原论观点43,44。这导致了不严谨的实验实践，例如忽略影响激素周期的外部变量、仅依据解剖学变化确定实验的起止点，以及以线性而非周期性方式衡量周期进展。尽管社会文化因素与生物学后果之间存在直接关联，但科学文献中却很少纳入这一考量。通过审视更具整体观的研究文献43,44,45，研究人员可以解构这些污名，并建立更可靠、更有效的实验设计。

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方案

本方案中所述的所有操作和实验方法均符合美国国立卫生研究院（NIH）关于动物护理和使用的指南，并已获得佩珀代因大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）的批准。

1. 动物护理与使用

  1. 根据功效分析确定数量，获取雌性大鼠以及用于促进惠滕效应或使动情周期更一致的雄性大鼠46根据研究目的，在已知数据库中确定菌株47.
    注意：当前数据反映了在佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校实验室中，作为合作研究的一部分，与雄性SD大鼠共处的雌性青春期SD国际遗传标准化项目（IGS）大鼠的情况。这些大鼠在28日龄时分批到达，随后经过7天的适应期，自34日龄开始，对其动情周期进展进行持续10天或20天的监测，以揭示急性与慢性水平上的差异。
  2. 处理前，需在新环境中进行检疫和/或适应期，以确保动物在运输后生理状态稳定并适应新环境。
    注意：建议至少3天，推荐7天48,49,50,51,52总体而言，这取决于运输条件、动物品系和研究目标。
  3. 通过使用适应期来减少应激，因为应激可能干扰生殖系统的正常功能53然而，不要试图完全消除压力，因为适度的压力对动物的健康有益。51.
  4. 将实验大鼠饲养于温度（68–79 °F，即 20–26 °C）和湿度（30–70%）受控的环境中，需与动物房或实验室管理人员协调并确保上述条件。提供饮水和标准饲料 随意摄取 营养成分详见公司网站，每周清洁笼具一次。
    注意：本研究中，大鼠按性别分组，每2只一组饲养于19" ×10" 8 倍" 透明可重复使用的塑料笼具，垫有玉米芯垫料，每周更换一次。温度保持在 70 °F，湿度为 35–79%，平均为 62%。
  5. 检查是否存在环尾症或尾部及脚趾缺血性坏死，以评估相对湿度过低和极端温度的影响，这些因素可能引起生物反应的改变。
    注意：温度和湿度对生殖系统、性成熟及动情周期具有重要影响 周期性54,55,56,57,58.
  6. 通过在实验室空间内均匀分布光源，确保饲养区域获得适当且均衡的光照，这些光源需作用于时间控制的明暗循环系统。
    注意：此处，一个 12小时光照：12小时黑暗循环，光照时间为06:00–18:00，由2,550流明的线性LED灯泡控制。
  7. 遵循所提供的光照需求52 根据动物的色素沉着、年龄、品系、性别和激素状态的差异。
    ​注意：研究人员在对收集的细胞样本进行分类时，保持一致的光照条件有助于准确的视觉识别和可靠的分期判断59光照的持续时间和强度与生殖系统、性成熟及动情周期直接相关。54,55,56,57,60,61.

2. 仪器设备与实验准备

  1. 复习分类判定标准（见图2A）：如何识别动情周期的各个阶段，以及如何操作显微镜和摄像设备。
  2. 确保每只待监测动物均已达到性成熟，并表现出适当的发育指标——阴道开口（VO）、体重和年龄。每天在同一时间称量大鼠体重并检查其阴道开口情况，以确保准确比较 ，并采用经批准的操作方法转移动物。若动物体重下降超过此前体重的20%，请咨询大学附属兽医。
    注：阴道开口位于尿道口尾侧、肛门头侧之间，如图3所示。
  3. 由于这些因素具有品系依赖性，应向供应商核实具体参数，并考虑实验室特有的环境因素62。
    注：一般而言，SD大鼠在32至34日龄之间、平均体重介于75至150克时达到性成熟63，表现为此前被膜状鞘覆盖的圆形开口。
  4. 选择适合被监测大鼠群体的采样时间段，以避免采集到过渡阶段样本。首先，在一天中的2至3个不同时间点对少量动物进行采样，以确定各动情周期阶段最常出现的时间（例如，对不同动物分别在12:00、13:00和14:00进行采样）。每天在相同时间完成阴道灌洗，以保证分期结果的一致性和可靠性。
    注：已有报道指出，12:00至14:00是捕捉所有动情周期阶段的最佳时段。本研究中，动情周期监测在12:00至14:00之间进行，并采用按压式抓持法（见步骤3.4）。动情周期监测时间与其他实验干预措施（如行为训练、药物处理）之间的相对关系是当前正在发展的研究领域，可进一步探索11。 动情周期监测持续时间取决于具体研究设计，可参考已发表的研究进一步探讨11,33。
  5. 取下显微镜的保护罩，并通过移除相机镜头的保护盖，将相机镜头对准显微镜目镜，连接至计算机。
  6. 随后，在计算机上打开预选软件。若使用本研究中所选软件，请在屏幕左侧标签为Camera List的选项下，选择连接至USB接口的相机。确保USB相机已正确连接至计算机，否则在标签为Camera List的位置将显示No Device。
  7. 在标签下选择USB相机后，打开位于显微镜底座上的光源开关。
  8. 在计算机上创建一个专门用于存放细胞样本照片的文件夹。每次数据采集日均需预先建立独立的子文件夹，以便在拍摄前完成准备。
  9. 完成设备准备后，从饲养位置取出受试动物的笼子，并将其转移至样本采集工作站。

3. 阴道细胞的采集

  1. 取一个一次性注射器，向每个注射器中加入 0.2 mL 无菌 0.9% NaCl。若存在气泡，轻轻弹击注射器筒身，使所有气泡升至注射器开口端，并排出空气。若仍有气泡，将溶液排回 NaCl 容器中，重新吸取，直至无气泡为止。
    注意：过度弹击可能导致产生更多气泡。
  2. 将每支注射器放回塑料包装内以维持无菌环境，注射器尖端应置于包装的密封部分内。
  3. 打开笼子，通过抓住动物尾部基部或躯干轻轻提起实验对象，并关闭笼盖以防止其他动物逃出。根据个人习惯和动物反应，从以下所列方法中选择一种固定方式。
  4. 对青春期大鼠采用压迫式固定法：将动物紧贴操作者上胸部区域，使其鼻部朝下指向地面。在开始拭子操作前，确保动物被适度固定以防止移动，同时保持其舒适与安全。在插入注射器前，轻轻上抬尾部以暴露阴道口。
  5. 对成年大鼠采用后肢抬高法：将动物前爪置于笼子顶部或侧面，同时用食指与中指轻轻夹住其尾部和后肢进行固定，拇指保持自由以便操作注射器64。
  6. 允许动物适应抓取与观察过程。操作时应轻柔但稳固，以减少不必要的应激反应，并防止动物攻击（如咬伤）对研究人员造成伤害。
    注意：在监测初期几天内，由于动物正在适应环境，可能无法获得理想结果。在适应期间通过抓取动物测量体重，有助于促进这一过渡过程33。
  7. 用食指和中指稳住注射器，将注射器尖端以平行于阴道口的角度插入（深度不超过 2 mm） 。通过向内推动活塞，缓慢将 NaCl 注入阴道口内。切勿将注射器进一步插入阴道，以免干扰动情周期。
  8. 通过将注射器活塞向外拉动（向上），从阴道口内回抽 NaCl 溶液。若在此过程中难以维持动物固定，可将其暂时放回笼中短暂休息，再尝试回抽 NaCl。
  9. 采集完细胞样本后，将动物放回笼中，并在显微镜下评估所有样本前，对每只动物重复上述操作。
    ​注意：也可选择逐个采集并评估样本后再处理下一只动物。若样本无法分类，可对该动物进行第二次灌洗。只要注射器未直接接触容器中的生理盐水，且仅用于同一动物，可重复使用初次采集所用的注射器。

4. 样本评估

  1. 开始分类时，先检查提取的阴道液样本。在描述文档或其他记录系统中记录其黏稠度（黏稠或不黏稠）以及颜色（不透明或透明）。
    注意：本步骤可在样本采集时或之后进行。
  2. 将2–3滴液体挤出至显微镜载玻片上，然后盖上盖玻片。盖玻片应从载玻片的一端缓慢覆盖至另一端，以避免产生气泡。若可能，应保留约一半采集的样本于注射器中，以便后续检查，并防止过多液体被置于载玻片上。
  3. 通过移动显微镜载玻片在载物台上的位置来定位所采集的细胞。若细胞数量过少或碎片过多，可将剩余液体挤出至新的载玻片上并重新观察。若注射器中剩余样本不足，或第二次滴加样本仍存在类似问题，则应在确定动情周期阶段前重新采集样本。
  4. 在找到细胞后、接触计算机或键盘之前，脱去一只手的手套，以防止污染键盘。
  5. 通过点击软件面板左侧标有Snap 的功能按钮，获取细胞样本的图像。
  6. 随后，点击页面左上角File 图标下的Save as保存文件。将照片保存在计算机中预先命名的文件夹内。
    注意：示例标签模板：#样本编号_采集日期_动情周期阶段_所用物镜。
  7. 若每个视野中细胞数量较少，应在每个物镜下拍摄多张照片。
    注意：多张图像的示例标签：#1_01/09/2021_EST_4x1 和 #1_01/09/2021_EST_4x2。
  8. 对每个采集的样本，在多个物镜下重复上述操作。至少包括一个较低倍率的物镜（如4x）和一个较高倍率的物镜（如20x）。
  9. 将图像上传至共享驱动器/文件夹或外接硬盘，以便所有研究人员均可访问，并确保有备份文件可用。

5. 阶段分类

  1. 将计算机屏幕设置为可同时查看所拍摄的照片和记录表图 4A- C).
    注意：此步骤可在观察所采集样本的同时进行记录。本部分操作可在采集样本时完成，也可在之后进行。
  2. 确定样本中存在的细胞类型。根据步骤5.2.1-5.2.4中列出的四项标准进行选择，并记录结果。
    1. 无核角化上皮（AKE）/角化上皮细胞
      1. 寻找边缘呈锯齿状或棱角状的细胞，如 图2B 和 图5C尽管无细胞核，但仍可能在细胞内观察到浅色圆形区域（即细胞核残影），代表细胞核曾经存在的位置。使用20倍或更高倍数的放大倍率，以区分有核细胞与无核细胞。
      2. 如有需要，可使用更高倍镜观察以区分细胞的角化或表皮角质化部分——即一层无细胞核、充满角蛋白的薄层细胞。
        注意：除了锯齿状外观外，这些结构还可通过其折叠或解体方式加以区分，从而形成称为角蛋白杆的锯齿状细长结构。
    2. 大核上皮细胞（LNE细胞）
      1. 寻找这些通常呈圆形至多边形、由不规则、锯齿状或棱角状边界包绕的细胞。
      2. 观察其细胞核可能呈现多种形式，从完整到退变或固缩，后者与细胞死亡或退化过程中细胞核内染色质发生不可逆凝聚相关，如图所示。 图2B 和 图5D1,2注意观察这些细胞核在细胞内所占空间小于细胞质，核质比（N:C）低于小型上皮细胞。在高倍镜下可观察到细胞质中的颗粒。13.
    3. 白细胞（LEUs）/中性粒细胞/多形核细胞
      1. 寻找这些具有多叶核（因此称为多形核细胞）的致密球形细胞，随着细胞成熟，这些特征会消失图2B 和 图 5A）。可使用更高倍数（如40倍）观察多叶核。
        注意：收集和制备后，这些细胞可能会发生收缩、折叠或破裂。
    4. 小核上皮（SNE）细胞
      1. 注意观察这些比上述中性粒细胞更大的圆形至椭圆形细胞。
      2. 观察这些非角化上皮细胞的圆形细胞核（图2B），其体积大于细胞内的细胞质，导致与较大的上皮细胞相比，核质比（N:C）更高。
        注意：收集和制备后，这些细胞可能发生折叠或重叠，形成类似串状或杆状的结构，如图所示。 图5B1.
  3. 观察每个放大倍数下样本中细胞的排列方式。使用较低的放大倍数（如4x）来查看细胞整体排列的代表性视野。记录细胞是成团聚集（C）、均匀分散（ED）还是随机分散（RD）（参见 图4C），并注意每种细胞类型的特定排列方式（例如，有核的小上皮细胞成团聚集，而中性粒细胞则均匀分布）。
  4. 接下来，通过肉眼估测并记录总细胞数量（少量、中等量、大量）以及各类细胞的个体数量（每种细胞类型的百分比）。
    注意：少量指可用于确定样本分类的最少细胞数目，大量指存在数量极多的细胞，这些细胞几乎占据或完全占据整个载玻片视野，或相互重叠堆积，中等量细胞则指相对适中的细胞数目（示例见于 图 5A-D 和 图6A- D).
  5. 注意观察“异常”类别中是否存在任何偏离所列标准或该特定受试对象典型特征的情况，必要时咨询兽医。
  6. 利用以下分类组分和描述，确定样本所处的动情周期阶段。
    1. 死亡
      1. 观察LEUs是否为主要或唯一的细胞类型，早期DIE阶段呈簇状聚集，晚期阶段则更为分散。
        注意：在向DIE转变过程中，上皮细胞开始降解，细胞数量可能会减少，如图所示。 图6D1与此同时，LEU的数量开始增加，最初 tends to 呈簇状排列，随后随时间逐渐分散。
      2. 请注意，细胞总数可能相对较少，这种情况最常出现在DIE期的后期，即第二天或第三天。
      3. 观察此阶段可能存在的大量黏液，其表现为浓密的LEUs条索状物图5A1）。在LEU向PRO过渡的后期阶段，注意观察是否有小团块或细胞串状的SNE细胞伴随LEU出现。图5A1,2).
      4. 观察进入、完全进入以及退出排卵期过渡阶段（DIE）时阴道分泌物的黏稠且不透明的外观。
        注意：在4天周期中，此阶段的平均持续时间为48小时，在5天周期中可能为72小时。
    2. PRO
      1. 寻找以SNE细胞为主的细胞，并观察少量存在的LEU、LNE和/或AKE细胞。使用高倍镜观察SNE细胞的颗粒状外观，此阶段SNE细胞通常成簇、成片或呈条索状排列。图5B1,2).
      2. 观察阴道分泌物从动情间期（DIE）进入动情前期（PRO）时呈现的黏稠且不透明的外观，以及完全进入动情前期（PRO）阶段后（大鼠平均持续时间为14小时）变为非黏稠且透明的变化过程。
    3. 表达序列标签
      1. 观察 AKE 细胞的主导性，EST 持续过程中 SNE 细胞的减少，以及细胞数量和体积的增加11,13.
      2. 注意观察 AKE 细胞常呈簇状排列的显著特征，表现为角蛋白条带或含有鬼影核，在从 PRO 转变过程中，这些特征可能变得更加随机分散图6B）以及 MET（图6C).
      3. 观察典型的非黏稠且透明的阴道分泌物，这可在大鼠进入、完全进入以及退出动情期（EST）时预期出现。
        注意：EST 的发展过程包含大量多样化（图5C 和 图6B，C该阶段在4天周期中通常持续约24小时，或在5天周期中可能持续48小时。
    4. MET
      1. 在大鼠向 MET 转变过程中，观察到 SNE 和 LNE 细胞数量增加，其在管腔内的细胞比例占主导地位，或与 LEU 细胞比例接近相等11,13此外，由于上皮细胞在EST后发生退化并进入DIE阶段，MET阶段及各过渡时期的碎片量较其他阶段更多，需注意这一现象。
      2. 观察到细胞排列缺乏一致性，可见各种类型细胞且数量不一（图5D1-3）。然而，在早期阶段需注意那些靠近上皮细胞聚集或成团存在的LEUs，这些LEUs在转变为DIE时可能重新呈现成团排列。
      3. 观察此阶段阴道液的非黏稠且透明的外观，以及在进入排卵后早期（DIE）时转变为更黏稠且不透明的外观。
        注意：此阶段的平均持续时间为6-8小时。
  7. 在转换阶段对样本进行标记，标注受试者即将进入的阶段，并将转换阶段用括号标注，以记录样本采集时间。有关如何区分这4个阶段及其转换阶段的更多详细信息，可参见 代表性结果.
    注意：由于所采集的样本是静态的，而细胞周期是动态的，因此切片可能显示不同阶段之间的过渡形态（可见于 图 6A- D).
  8. 对每只动物重复此过程，直至监测阶段结束。
  9. 在第11天（45日龄）或第21天（55日龄），使用5%异氟烷和2%氧气对大鼠实施安乐死，随后进行断头术。具体时间点可根据研究性质进行调整。

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结果

当前数据反映了在雄性SD大鼠存在条件下，雌性青春期SD国际遗传标准化项目（IGS）大鼠的情况。这些动物分别位于佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校的实验室，作为合作研究的一部分。 图5 展示了4个周期阶段的多种变化形式。 图5A1 被鉴定为一个动情间期样本，其中存在多种细胞类型。此示例表明，当样本满足其他分类标准（例如LEUs占优势）时，即使上皮细胞数量较多，仍可归类为动情间期。该样本还展示了此阶段常见的由LEUs构成的黏液丝排列结构，其形态类似于发情前期（PRO期）中由SNE细胞组成的黏液丝。为了区分动情间期（DIE期）的黏液丝与发情前期（PRO期）由SNE细胞形成的黏液丝，关键在于识别LEUs是否占主导地位。 图 5A2,3 表现出一种常被观察到的细胞排列进程——在DIE阶段后期采集的样本中，LEU最初聚集，随后逐渐向随机分布（RD）甚至均匀分布（ED）转变。具体而言，

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讨论

关键步骤与重要注意事项
在所提供的实验方案中，某些关键步骤需要特别强调，尤其是在阴道细胞的采集过程中。进行阴道液体提取时，确保注射器插入的角度和深度恰当，是获得满意结果的关键，同时也可有效避免对动物造成刺激、损伤或宫颈刺激。宫颈刺激可能是诱导假孕的一个因素，其表现为连续12至14天的白细胞为主的阴道涂片。11在显微镜评估阶段，必须重点关注 显示所采集阴道细胞的视野平面。通过识别一至两个细胞并调整观察视野，直至获得清晰焦点来完成。

接下来，通过全面扫描显微镜载玻片来获取阴道细胞的代表性图像，以进行分期。这可确保所采集的图像能够准确反映动物阴道道内收集到的细胞成分。在进行分类之前，必须熟悉分类的判定依据，例如区分不同类型的细胞以及每种细胞类型可能呈现的各种形态变化。建议每位参与者均应接受适当培训，并通过预先准备好的练习载玻片进行分期识别的练习。

为了减少分类过程中涉及的偏倚和主观性，建议在分类阶段安排两名参与者，二者均对处理分组...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究是通过美国国立卫生研究院（NIH）资助的加州大学洛杉矶分校脑损伤研究中心（BIRC）合作开展的。

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材料

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