研究辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的模型的设计与开发

摘要

该协议的目标是开发一个模型系统，用于高氧对囊性纤维化气道微生物群落的影响。 人工痰培养基模拟痰液的组成，高氧培养条件模拟了辅助氧气对肺微生物群落的影响。

摘要

气道微生物群落被认为在囊性纤维化（CF）和其他慢性肺部疾病的进展中起重要作用。传统上，微生物是根据其使用或耐受氧气的能力进行分类的。辅助供氧是一种常见的药物治疗，用于囊性纤维化（pwCF）患者;然而，关于氧气和气道微生物组的现有研究集中在缺氧（低氧）而不是高氧（高氧）如何影响主要有氧和兼性厌氧肺微生物群落。为了解决这一关键的知识差距，该协议是使用模仿pwCF痰液组成的人造痰液培养基开发的。使用产生透明培养基的过滤器灭菌允许光学方法跟踪悬浮培养物中单细胞微生物的生长。为了创建高氧条件，该模型系统利用已建立的厌氧培养技术来研究高氧条件;不是除去氧气，而是通过每天用压缩氧气和空气的混合物喷射血清瓶将氧气添加到培养物中。来自50 pwCF的痰液每天进行72小时的喷射，以验证该模型维持差分氧条件的能力。对来自11 pwCF的培养和未培养的痰液样本进行霰弹枪宏基因组测序，以验证该培养基支持囊性纤维化痰中常见的共生和致病微生物生长的能力。从从pwCF获得的112株分离株中获得生长曲线，以验证这种人造痰培养基支持常见囊性纤维化病原体生长的能力。我们发现该模型可以在CF痰中培养各种病原体和共生菌，在正常氧条件下恢复与未培养痰高度相似的群落，并在不同的氧气条件下产生不同的培养表型。这种新方法可能会更好地理解在pwCF中使用氧气对气道微生物群落和常见呼吸道病原体引起的意外影响。

引言

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，其特征在于无法清除肺部的粘液，导致反复感染和进行性肺功能下降，通常导致需要肺移植或死亡。囊性纤维化（pwCF）患者的气道微生物组似乎跟踪疾病活动^1，与不良长期结局相关的微生物多样性减少^2，3。在pwCF的临床研究中，补充氧疗与更晚期的疾病^4，5相关，尽管传统上，氧疗的使用仅被视为疾病严重程度^的标志6 。最近一项针对呼吸衰竭患者的临床试验研究表明，较高的患者氧气水平与严重细菌感染的增加和更高的死亡率相矛盾^7，这表明补充氧气可能有助于疾病的发病机制。补充氧气对囊性纤维化肺微生物组以及相关的肺和气道微生物群落的影响尚未得到很好的研究。

由于后勤困难以及与未知医疗益处或伤害的干预措施相关的潜在伦理问题，机械研究通常无法直接对人类受试者进行。在这些情况下，将人类生物标本整合到模型系统中的转化方法可以提供重要的生物学见解。虽然使用或耐受氧气的能力传统上是微生物分类的重要组成部分，但对于向环境引入辅助氧气的治疗性如何扰乱气道微生物群落知之甚少。为了阐明辅助供氧对pwCF气道微生物组的未知影响，我们需要解决两个主要挑战;首先，创建一种培养基，在生理上接近CF痰的组成;其次，创建一个模型系统，允许在较长的时间内保持培养物中升高的氧浓度。

人工痰培养基（ASM）被广泛用于模拟肺痰体外^{8、9、10，}但对具体配方没有明确的共识。该协议描述了一种精心设计的人造痰液培养基配方和制备策略，以从生理上近似于来自pwCF的痰液。表1概述了基于已发表文献的所选配方值。基本化学成分和pH值与人类CF痰液研究确定的值相匹配11，12，13。使用蛋黄加入低浓度的生理营养素，其作为最终体积的0.25%加入^，以及维生素和微量金属混合物14，15。粘蛋白是痰¹⁶的关键成分，包括在1%w / v¹⁴。虽然过滤器杀菌更费力，但过滤器灭菌被选择在更传统的热灭菌实践之上，以减少由热引起的基本介质组分变性的潜在问题^10。过滤器灭菌的另一个好处是它产生透明的介质（由于盐和蛋白质的沉淀和凝固，热灭菌可以产生浑浊的介质），允许这种人造痰培养基用于根据浊度的增加来跟踪微生物生长。

该高氧培养模型系统基于厌氧培养技术，其中添加而不是去除氧气，从而为pwCF补充氧气的使用效果创建了模型。 图1 和相关氧气喷射方案概述了氧气喷射系统的组件，这些组件可以从一般实验室和医院供应商处以低成本获得。该系统能够将压缩氧气和空气混合到21%-100%氧气的固定浓度。氧气传感器的集成允许验证输出气体混合物的浓度，以及检查先前喷射的血清瓶的流出气体成分，以验证氧气条件是否保持在所需范围内。

该协议概述了创建人造痰液培养基的程序，氧气喷射系统的构建和使用，以及两者在差氧条件下用于培养CF痰液的应用。

方案

该研究获得了合作伙伴机构审查委员会的批准（协议编号2018P002934）。纳入标准包括为研究提供书面知情同意书的囊性纤维化成年患者。没有排除标准。根据方案指南，所有痰液样本都是在预定的门诊就诊期间从囊性纤维化患者那里收集的。

1. 人工痰培养基制备

注:此处列出的数量用于生产1 L最终人造痰液，并假设材料表中列出的特定试剂。必须针对其他体积或使用不同的试剂调整数量，以确保相同的最终产品。目标浓度见表1。

1. 人工痰液化学混合物
   注:ASCM占最终介质体积的25%。它具有货架稳定性，可以散装或提前制备。如果准备以后使用，请高压灭菌化学混合物并将其安全地储存在室温下。
   1. 混合组成化学原料溶液。
      1. 准备1M NaCl储备:每升无菌水加入58.44克NaCl。
      2. 准备1 M KCl储备:每升无菌水加入74.55克KCl。
      3. 准备1 M MgSO₄储备:每升无菌水加入246.47克MgSO_{4·7H 2}O，或每升无菌水120.37克无水MgSO4。
      4. 准备1M葡萄糖储备:每升无菌水加入180.16克葡萄糖。
   2. 高压灭菌器对化学储备溶液以及空的250 mL瓶进行灭菌。执行高压灭菌步骤至至少121°C和15 PSI的标准值30分钟。
   3. 将80.59毫升无菌水加入空的250毫升瓶中。
   4. 将152.30 mL的1 M NaCl原液加入混合物中。
   5. 将15.8 mL 1 M KCl原液加入混合物中。
   6. 向混合物中加入610μL1 M MgSO₄ 储备液。
   7. 向混合物中加入700μL1M葡萄糖储备。
2. 人造痰粘蛋白混合物
   注:ASMM占最终介质体积的50%。确保它与最终的培养基批次在同一天制备。
   1. 将 450 mL 无菌水加入空的 1 L 瓶中。
   2. 将50毫升10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入瓶中。
   3. 将一次性磁力搅拌棒添加到瓶子中。
   4. 高压灭菌含有PBS的瓶子和搅拌棒。
   5. 取出10克粘蛋白粉，并将其添加到PBS中。
   6. 用力摇晃瓶子进行初步混合。
   7. 将瓶子放在带有磁力搅拌器的热板上。将热量设置为中高，目标温度为50°C，搅拌速度为1100 rpm。逐渐提高速度，使棒材不会从磁铁上飞落。
      1. 加热并搅拌15分钟。
      2. 戴上耐热手套拿起瓶子。观察以检查粘蛋白粉末是否从溶液中沉淀出来。
      3. 如果粘蛋白粉未完全溶解，请将瓶子放回加热/搅拌器5分钟，直到完全溶解。
   8. 让粘蛋白混合物冷却至室温。
3. 人造痰生物混合物（ASBM）
   注:反舰弹道导弹为最终介质体积的25%。在与最终中等批次的同一天准备它，并且与其他混合物不同，不要将其组分暴露在任何热量下。
   1. 在4°C冰箱或冰上解冻100x维生素储备。
      注意:将维生素储备预先分成10毫升等分试样，以尽量减少冷冻/解冻循环的次数。
   2. 将124.24毫升无菌水加入空的高压灭菌的250毫升瓶中。
   3. 将 25.76 mL 50 倍必需氨基酸储备液加入混合物中。
   4. 将 80.14 mL 100 倍非必需氨基酸储备液加入混合物中。
   5. 将10毫升（解冻的）100倍维生素储备液加入混合物中。
   6. 将 1 mL 1000x 痕量金属原液加入混合物中。
   7. 将8.33毫升30%蛋黄乳液加入混合物中。
   8. 向混合物中加入400μL10g / L铁蛋白储备液。
   9. 通过手动摇匀将溶液混合均匀。
4. 人工痰培养基
   1. 将250毫升ASCM加入1升含有ASMM的瓶子中。
   2. 将250毫升ASBM加入培养基瓶中。
   3. 用碱性MOPS缓冲液（1 M）滴定培养基，在窄范围pH纸上达到6.3的pH值。在滴定之前，培养基混合物会太酸性。
   4. 将所得的人造痰液介质冷藏在4°C，直到准备好过滤。
   5. 要开始过滤过程，请将200 mL未经过滤的人造痰液转移到具有0.22μm孔径过滤器的真空过滤系统中。
   6. 将过滤系统连接到真空泵，打开真空泵，将其设置为70 mbar，然后将腔室放在轨道振荡器上，在4°C的冷室中以90 rpm的速度振荡。
      1. 在过滤可观量的培养基时，再加入 150 mL 培养基。完全过滤1L培养基需要1-2天。
      2. 用额外的腔室重复上述步骤，直到所有培养基都被过滤干净。
         注意:尽量不要通过相同的0.22μm过滤器过滤超过350 mL的培养基，因为粘蛋白会随着时间的推移堵塞过滤器。
   7. 将过滤后的人造痰液冷藏在4°C，直到准备使用。在准备后的一个月内使用ASM以获得最佳效果。

2. 氧气喷射

1. 喷射站设置
   注意:此协议只需完整完成一次，之后可以通过必要的简单维护来维护设置。有关氧气喷射系统的可视化示意图，请参见图1。
   1. 获取并正确固定压缩空气和氧气罐。
      注意:高压使储罐在处理不当时非常危险。确保储罐完全密封和固定，在储罐关闭时没有泄漏，并且所有处理人员都经过充分的使用培训。
   2. 用扳手将空气调节器连接到压缩空气罐。为了在调压阀上获得最佳流量读数，请将调压阀尽可能靠近直立位置。
   3. 将氧气调节器连接到压缩氧气罐，尽可能靠近直立位置。根据氧气罐的不同，可能需要反转方向以收紧。
   4. 将来自调压阀的管道连接到 Y 型连接器，以组合来自两个储罐的气流。
   5. 将 Y 型连接器的输出连接到中央 T 型接头阀。
   6. 将中央 T 型接头阀的一侧连接到气体压力表。
   7. 将气体压力表的另一侧连接到孔径为 0.22 μm 的 25 mm 无菌注射器过滤器。
   8. 将第二个直径为25 mm的注射器过滤器连接到注射器上，没有柱塞，可在喷射过程中用作气体释放。
   9. 将中央 T 型接头阀的最后一侧连接到氧气监测仪的第二个 T 型接头阀。
   10. 将直径为 25 mm 的注射器过滤器连接到第二个 T 型接头阀的一侧，以及用于连接 18 G 针头的管路。
   11. 将第二T型接头阀的最后一侧连接到氧气监测装置。
   12. 将切断管连接到氧气监测装置的另一侧，以便在监测期间用作气体释放。
       注意:在测试/使用氧气喷射系统时，请仔细注意T形结的位置，并确保其与通过系统的预期路径相匹配。如果不这样做，将导致系统内部的压力积聚，并导致组件失效并破裂 。
   13. 为了维护系统并使其以最佳性能工作，以下做法是有益的。
       1. 用大量特氟龙胶带加强连接，以大大改善其密封性，并减少组件脱离内部压力的机会。
       2. 将组合流量保持在10升/分钟以下，以减轻最大压力并防止故障。
       3. 如果怀疑泄漏，请使用洗涤剂溶液，例如市售液体泄漏探测器，以轻松识别其位置，因为它会在任何气体泄漏上方冒泡。使用聚四氟乙烯胶带（例如特氟龙）进行贴片泄漏。
       4. 每两周更换一次氧气喷射系统中直径为 25 mm 的注射器过滤器，但这会因使用频率而异。随着时间的推移，过滤器中夹住的颗粒会降低气体流速并导致压力积聚。
       5. 在进行测量之前，将氧气监测仪校准为21%氧气压缩空气。
       6. 系统使用完成后，关闭储罐并从调节器中排出多余的气体，直到流量完全停止。
2. 血清瓶培养痉挛
   1. 在 500 mL 高压灭菌血清瓶上贴上标签，并标明样品标识符、接种日期/时间和目标氧含量。
   2. 在生物罩中，将24毫升人造痰培养基加入每个正在设置的血清瓶中。
   3. 将1mL用18-G针头匀浆的患者痰液（必要时用无菌盐水稀释以获得每种培养条件的足够体积的样品）加入每个血清瓶中。
   4. 使用无菌镊子，将高压灭菌的橡胶塞放在每个血清瓶的顶部。
   5. 按下橡胶塞，注意不要用手触摸塞子的底部。
   6. 从抽油烟机上取下瓶子，应用并压接铝封条。从密封件上取下中心件。
   7. 用酒精擦拭布擦拭瓶子的顶部，然后通过本生燃烧器火焰。
   8. 将无菌的18-G针头贴在带有过滤器的无柱塞注射器上。首先将此气体释放物插入瓶中。
   9. 将无菌的18-G针头固定在系统的气体输出端，并将气体输出针插入瓶子中。
   10. 将 T 形结从储罐通过氧气监测仪。验证目标氧浓度是否流经系统。目标气体流量约为 5 L/min。
   11. 将 T 形结从储罐重新路由到气体输出端。气体开始流经血清瓶。
       注意:在氧气喷射期间，请密切注意压力表。如果压力意外增加，请立即关闭系统。
   12. 在血清瓶中运行氧气喷射1分钟。在5 L / min时，这允许10次空气交换，并确保内部气氛达到所需的分压。
   13. 取出气体释放18-G针。
   14. 让血清瓶中的压力建立到+1大气压（海平面为2个大气压），然后立即取出气体输出针。
       注意:保持压力有助于随着时间的推移保持高氧状态。
   15. 将血清瓶放入37°C培养箱振荡器中，转速为150 RPM。将样品孵育三个24小时间隔。在每个24小时的间隔内，取等分试样进行下游分析，重新分流样品并将其返回孵育，总孵育时间为72小时。
3. 流出量氧气测量
   1. 将氧气计校准为21%压缩空气，然后关闭储罐。
   2. 将血清瓶的摄入量通过氧气监测仪，并将无菌针头固定到底。
   3. 将针头穿过橡胶塞插入血清瓶中。
   4. 等待流出读数稳定下来。血清瓶流出的流速低，这意味着这可能需要长达2分钟的时间。报告与室内空气的峰值差异（从 21% 到最远的数字）。
   5. 如果执行多个读数，请在读数之间用压缩空气冲洗系统。

结果

这些方案应用于来自pwCF的50个痰液样本，这些样本在马萨诸塞州波士顿马萨诸塞州总医院的门诊囊性纤维化诊所进行常规护理。使用人造痰培养基在21%，50%和100%氧气条件下培养每位患者的痰液，在24小时，48小时和72小时的培养时间从每种培养物中取出0.5mL等分试样进行测试。当提取以跟踪视觉变化时，对培养物进行拍摄。此外，在培养前取每个原发痰样本的0.5mL等分试样。这导致每位患者有10个离散样本，最终N为500个样本。其中，来自11名患者的痰液（11名未培养的痰液，11名培养的痰液在孵育48小时时来自21%氧气）的痰液进行了核酸提取¹⁷次，使用商业DNA文库制备试剂盒生成测序文库，并在全基因组测序平台上进行宏基因组测序，靶向每个样品约5 Gb的序列，具有150个碱基对， 配对端读取。原始读数使用bioBakery工具^套件18进行处理，其中包括质量控制和去除人类"污染物"序列以及使用MetaPhlAn3分析器¹⁹进行分类学分析。在核酸提取时，将1000万个盐酸Imtechella细胞<...

讨论

在这项研究中，开发了一个 体外 模型来研究高氧对肺微生物群落的影响。该模型基于人工痰培养基和血清瓶的每日喷射，可维持升高的氧气浓度，并支持在pwCF痰液中鉴定出的微生物的生长。

这种方法有几个关键步骤。首先是选择使用过滤灭菌而不是人工痰媒的热灭菌。过滤器灭菌可防止粘蛋白和培养基中其他热敏组分变性，并产生可用于微生物生长光学测量的透明培养基。虽然过滤器灭菌在其他方案¹⁰中已经提出，但我们发现在过滤过程中增加轨道振荡对于防止过滤器堵塞至关重要，否则当过滤了最少量的制备介质时就会发生这种情况。虽然过滤后的人造痰培养基可能由于过滤器中的粘蛋白嵌塞而具有低于预期的最终粘蛋白浓度，但来自pwCF的痰液已被证明具有比没有囊性纤维化的人的痰液更低的粘蛋白浓度^21。该协议中使用的起始粘蛋白浓度为1%，高于使用过滤器灭菌的其他方法，其中一组使用起始粘蛋白浓度为0.5%10，而典型配方使用黏蛋白浓度范围为0.5%-2%（表1）。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BME 维生素 （100x） 溶液	MilliporeSigma	B6891	补充维生素的浓缩溶液。
封盖器， 30 mm	DWK Life Sciences	224307	用于将铝密封件连接到血清瓶的封盖器。
D-（+）-Glucose	MilliporeSigma	G7021	固体葡萄糖粉（右旋异构体）。
隔膜泵 ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	用于真空过滤的真空泵。
蛋黄乳液	HiMedia	FD045	30% 蛋黄在盐水中无菌乳液。
铁蛋白，从马脾	MilliporeSigma	F7879	铁蛋白（铁储存蛋白）溶液
FIREBOY plus 安全本生灯	Integra Biosciences	144000	本生灯，具有用户界面和安全功能。
Hydrion pH试纸（1.0–14.0）	Micro Essential Laboratory	94	pH 测试纸，范围为 1.0–14.0。
Hydrion pH 纸 （4.0–9.0）	Micro Essential Laboratory	55	pH 测试纸，范围为 4.0–9.0。
Hydrion pH 纸 （6.0–8.0）	Micro Essential Laboratory	345	pH 测试纸，范围为 6.0–8.0。
皮下注射针头-Pro EDGE 安全装置，18 G	Smiths Medical	401815	18 G 针头，带安全帽。
在线压力表	MilliporeSigma	20469	用于监测瓶子压力的气体压力表。
Innova 42 孵育摇床	Eppendorf	2231000756	组合培养箱/轨道摇床。
带连接针头的 Luer-Lok 注射器	Becton Dickinson	309580	组合 3 mL 注射器和 18 G 针头。
鲁尔阀分类	World Precision Instruments	14011	用于气体流量管的阀门。
LSE 轨道摇床	ThermoFisher Scientific	6780-NP	轨道摇床，用于在过滤过程中搅动培养基。
硫酸镁七水合	MilliporeSigma	M2773	固体泻盐（硫酸镁七水合物）。
带流量计的医用空气单级调节器	Western Enterprises	M1-346-15FM	空气流量调节器，带 15 L/min 仪表。
MEM 氨基酸 （50x） 溶液	MilliporeSigma	M5550	必需氨基酸的浓缩溶液。
MEM 非必需氨基酸 （100x） 溶液	MilliporeSigma	M7145	非必需氨基酸的浓缩溶液。
Millex-GP 过滤器，0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µM 聚醚砜膜无菌针头过滤器。
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q 无菌水过滤系统。
MiniOX 3000 氧气监测仪	MSA	814365	气体流量氧百分比监测仪。
MOPS 缓冲液 （1 M， pH 9.0）	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS 缓冲液，用于调节培养基的 pH 值。
来自猪胃的粘蛋白	MilliporeSigma	M2378	粘蛋白（糖化凝胶形成蛋白）粉末。
自然色聚丙烯倒钩接头套件	Harvard Apparatus	72-1413	用于气流管的连接器。
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1096	测序过程中用于鉴定的文库制备。
NovaSeq 6000 测序系统	Illumina	770-2016-025-N	鸟枪法测序平台，用于生成样本读数。
带流量计的氧气单级调节器	Western Enterprises	M1-540-15FM	氧气流量调节器，带 15 升/分钟流量计。
带 2 个标准连接器的氧气管	SunMed	2001-01	用于连接气体系统组件的管。
磷酸盐缓冲盐水，10x，pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	浓缩磷酸盐缓冲盐水溶液。
PC 420 加热板/搅拌器	Marshall Scientific	CO-PC420	组合加热板/搅拌器。
氯化钾	MilliporeSigma	P9541	固体氯化钾盐。
PTFE 一次性搅拌棒	ThermoFisher Scientific	14-513-95	一次性磁力搅拌棒。
PTFE 螺纹密封特氟龙胶带	VWR	470042-938	用于增强气体系统连接的特氟龙胶带。
Q-Gard 2 纯化柱	用于 Milli-Q 系统的 MilliporeSigma	QGARD00D2	纯化柱。
可重复使用的培养基储存瓶	ThermoFisher Scientific	06-423A	用于混合和储存培养基的瓶子。
橡胶塞，30 mm，灰色溴化丁基	DWK Life Sciences	224100-331	用于血清瓶的橡胶塞。
带模制刻度的血清瓶，500 mL	DWK Life Sciences	223952	用于密封培养的玻璃血清瓶。
小口径延长套件	Braun Medical	471960	带鲁尔锁连接器的管道延长管。
	MilliporeSodium Chloride	S3014	固体氯化钠盐。
加标对照 I（高微生物负荷）	ZymoBIOMICS	D6320	用于绝对微生物负荷计算的加标微生物（嗜盐 I. 和盐耐 A. 嗜
Stericup 快速释放无菌真空过滤系统	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm 真空过滤室。
Super Sani-Cloth 一次性杀菌湿巾	专业一次性用品国际	H04082	一次性杀菌湿巾，用于消毒。
痕量金属混合物，1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	生理痕量金属的浓缩溶液。
无衬里铝密封，30 毫米	DWK 生命科学	224187-01	铝密封卷曲在橡胶塞顶部。
USP 医用级气瓶		Airgas AI USP200	用于喷射系统输入的压缩空气罐。
USP 医用级氧气罐	Airgas	OX USP200	压缩氧气罐，用于喷射系统的输入。