设计与开发用于研究补充氧气对囊性纤维化气道微生物组影响的模型

摘要

本实验方案的目的是建立一个用于研究高氧对囊性纤维化气道微生物群落影响的模型系统。人工痰液培养基可模拟痰液的组成，而高氧培养条件则用于模拟补充氧气对肺部微生物群落的影响。

摘要

气道微生物群被认为在囊性纤维化（CF）及其他慢性肺部疾病的进展中发挥重要作用。传统上，微生物的分类依据是其利用或耐受氧气的能力。补充氧气是囊性纤维化患者（pwCF）常见的医疗干预手段；然而，目前关于氧气与气道微生物组的研究主要集中在缺氧（低氧）而非高氧（高氧）对以需氧菌和兼性厌氧菌为主的肺部微生物群落的影响。为弥补这一关键的知识空白，本实验方案采用一种人工痰液培养基，模拟来自囊性纤维化患者（pwCF）的痰液成分。通过滤膜除菌技术制备出透明培养基，使得光学方法可用于监测悬浮培养中单细胞微生物的生长情况。为建立高氧条件，该模型系统利用已建立的厌氧培养技术来研究高氧环境；与去除氧气相反，本方法通过每日向血清瓶中通入压缩氧气与空气的混合气体，向培养物中添加氧气。来自50名囊性纤维化患者（pwCF）的痰液样本接受了为期72小时的每日通气处理，以验证该模型维持不同氧浓度条件的能力。对来自11名囊性纤维化患者（pwCF）的培养与未培养痰液样本进行了宏基因组测序，以验证该培养基支持囊性纤维化痰液中常见共生菌和致病菌生长的能力。从112株从囊性纤维化患者（pwCF）分离的菌株中获得生长曲线，以验证该人工痰液培养基支持常见囊性纤维化病原体生长的能力。我们发现，该模型能够在囊性纤维化痰液中培养多种病原菌和共生菌，在常氧条件下恢复出与未培养痰液高度相似的微生物群落，并在不同氧浓度条件下产生不同的培养表型。这一新方法可能有助于更好地理解在囊性纤维化患者（pwCF）中使用氧气治疗对气道微生物群落及常见呼吸道病原体所产生的未预期影响。

引言

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，其特征是无法清除肺部的浓稠黏液，导致反复感染和肺功能进行性下降，常常需要进行肺移植或导致死亡。囊性纤维化患者（pwCF）的呼吸道微生物组似乎与疾病活动性相关¹，微生物多样性降低与不良的长期预后相关^2,3。在针对pwCF的临床研究中，补充氧疗与更严重的疾病进展相关^4,5，尽管传统上，氧疗的使用仅被视为疾病严重程度的一个标志⁶。最近一项针对呼吸衰竭患者的临床试验研究表明，患者较高的氧水平反而与严重细菌感染增加和死亡率升高相关⁷，提示补充氧气可能参与了疾病的发病机制。然而，补充氧气对囊性纤维化患者肺部微生物组以及相关肺和呼吸道微生物群的影响尚未得到充分研究。

由于干预措施可能存在未知的医学益处或风险，相关的后勤困难和潜在伦理问题使得机制研究通常无法直接在人体受试者上进行。在这些情况下，将人类生物样本整合到模型系统中的转化研究方法可提供重要的生物学见解。尽管利用或耐受氧气的能力传统上是微生物分类的重要组成部分，但关于向环境中治疗性引入额外氧气如何影响呼吸道微生物群落，目前所知....

方案

本研究获得了 Partners 机构审查委员会的批准（方案编号：2018P002934）。纳入标准包括提供书面知情同意书的成年囊性纤维化患者。无排除标准。根据方案指南，所有痰液样本均在囊性纤维化患者与其临床医生预约的门诊就诊期间采集。

1. 人工痰液培养基的制备

注意：此处列出的用量适用于制备 1 L 最终人工痰液培养基，并假设使用材料表中列出的特定试剂。若制备其他体积或使用不同试剂，必须相应调整用量，以确保获得相同的最终产物。目标浓度详见表 1。

1. 人工痰液化学混合物（ASCM）
   注意：ASCM 占最终培养基总体积的 25%。该成分性质稳定，可批量或预先配制。若需后续使用，应将化学混合物进行高压灭菌，并在室温下安全保存。
   1. 混合各化学储备溶液。
      1. 配制1 M NaCl储备液：每升无菌水中加入58.44 g NaCl。
      2. 配制1 M KCl储备液：每升无菌水中加入74.55 g KCl。
      3. 制备 1 M MgSO₄₄ 储备液：加入 246.47 g MgSO₄₄·7H₂每升无菌水中加入 120.37 克无水 MgSO₄。
      4. 配制1 M葡萄糖储....

结果

这些方案应用于来自波士顿马萨诸塞州总医院（Massachusetts General Hospital）囊性纤维化门诊接受常规治疗的囊性纤维化患者（pwCF）所咳出的50份痰样本。每位患者的痰样本均使用人工痰液培养基，在21%、50%和100%氧气条件下进行培养，并在培养24小时、48小时和72小时时分别取0.5 mL等分试样用于检测。在取样时对培养物进行拍照，以追踪其视觉变化。此外，在培养前还预先采集了每份原始痰样本0.5 mL。这使得每位患者共获得10个独立样本，最终样本总数为500个。其中，来自11位患者的痰样本（11份未培养痰样，以及11份在21%氧气条件下培养48小时的培养后痰样）进行了核酸提取¹⁷，使用商用DNA文库构建试剂盒生成测序文库，并在全基因组测序平台上进行宏基因组测序，目标为每样本约5 Gb序列数据，采用150 bp双端测序。原始测序读长使用bioBakery工具套件进行处理¹⁸，包括质量控制、去除人源“污染”序列，以及利用MetaPhlAn3分析器进行物种分类谱型分析¹⁹.......

讨论

在本研究中，一个 体外 该模型基于人工痰液培养基和每日对血清瓶进行通气处理，旨在研究高氧环境对肺部微生物群落的影响。该模型可维持较高的氧气浓度，并支持囊性纤维化患者痰液中鉴定出的微生物生长。

该方法包含若干关键步骤。首先是选择使用过滤除菌而非加热灭菌来处理人工痰液培养基。过滤除菌可防止黏蛋白及其他对热敏感的培养基成分发生变性，从而获得澄清的培养基，适用于微生物生长的光学测定。尽管其他方案中也曾提出采用过滤除菌¹⁰，但我们发现，在过滤过程中加入轨道振荡对于防止滤膜堵塞至关重要；若未采取此措施，即使仅过滤少量配制好的培养基也会导致滤膜堵塞。虽然由于黏蛋白在滤膜上的滞留，过滤后的人工痰液培养基中黏蛋白终浓度可能低于预期值，但已有研究表明，囊性纤维化患者（pwCF）的痰液中黏蛋白浓度低于非囊性纤维化人群²¹。本方案中采用的起始黏蛋白浓度为1%，高于其他使用过滤除菌方法的方案——例如有研究使用0.5%的起始浓度¹⁰，而常规配方中黏蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BME 维生素（100 倍浓缩液）溶液	MilliporeSigma	B6891	补充维生素的浓缩溶液。
压盖器，30 mm	DWK Life Sciences	224307	用于将铝盖密封至血清瓶的压盖工具。
D-(+)-葡萄糖	MilliporeSigma	G7021	固体葡萄糖粉末（右旋异构体）。
隔膜泵 ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	用于真空过滤的真空泵。
卵黄乳液	HiMedia	FD045	30% 卵黄在生理盐水中的无菌乳液。
阳离子化马脾铁蛋白	MilliporeSigma	F7879	铁蛋白（铁储存蛋白）溶液。
FIREBOY plus 安全本生灯	Integra Biosciences	144000	带用户界面和安全功能的本生灯。
Hydrion pH 试纸（1.0–14.0）	Micro Essential Laboratory	94	用于 1.0–14.0 范围的 pH 检测试纸。
Hydrion pH 试纸（4.0–9.0）	Micro Essential Laboratory	55	用于 4.0–9.0 范围的 pH 检测试纸。
Hydrion pH 试纸（6.0–8.0）	Micro Essential Laboratory	345	用于 6.0–8.0 范围的 pH 检测试纸。
带安全装置的皮下注射针头-Pro EDGE，18 G	Smiths Medical	401815	带安全帽的 18 G 针头。
在线压力表	MilliporeSigma	20469	用于监测瓶内气体压力的压力表。
Innova 42 恒温摇床	Eppendorf	2231000756	组合式恒温培养/轨道摇床。
带针头的鲁尔锁注射器	Becton Dickinson	309580	3 mL 注射器与 18 G 针头组合。
鲁尔阀套装	World Precision Instruments	14011	用于气体管路的阀门。
LSE 轨道摇床	ThermoFisher Scientific	6780-NP	过滤过程中用于振荡培养基的轨道摇床。
七水合硫酸镁	MilliporeSigma	M2773	固体泻盐（七水合硫酸镁）。
医用单级空气减压阀带流量计	Western Enterprises	M1-346-15FM	带 15 L/min 流量计的空气流速调节器。
MEM 氨基酸（50 倍浓缩液）溶液	MilliporeSigma	M5550	必需氨基酸的浓缩溶液。
MEM 非必需氨基酸（100 倍浓缩液）溶液	MilliporeSigma	M7145	非必需氨基酸的浓缩溶液。
Millex-GP 滤器，0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm 聚醚砜膜无菌注射式滤器。
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q 无菌水过滤系统。
MiniOX 3000 氧气监测仪	MSA	814365	气体流中氧气百分比监测仪。
MOPS 缓冲液（1 M，pH 9.0）	Boston BioProducts	BBM-90	用于调节培养基 pH 的 MOPS 缓冲液。
猪胃黏蛋白	MilliporeSigma	M2378	黏蛋白（糖基化凝胶形成蛋白）粉末。
天然聚丙烯带倒钩接头套件	Harvard Apparatus	72-1413	用于气体管路的连接器。
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1096	用于测序过程中样本鉴定的文库制备试剂盒。
NovaSeq 6000 测序系统	Illumina	770-2016-025-N	用于生成样本读长的鸟枪法测序平台。
单级氧气减压阀带流量计	Western Enterprises	M1-540-15FM	带 15 L/min 流量计的氧气流速调节器。
带两个标准接头的氧气管路	SunMed	2001-01	用于连接气体系统组件的管路。
磷酸盐缓冲液，10 倍浓缩液，pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	浓缩的磷酸盐缓冲盐水溶液。
PC 420 电热板/搅拌器	Marshall Scientific	CO-PC420	组合式电热板/搅拌器。
氯化钾	MilliporeSigma	P9541	固体氯化钾盐。
PTFE 一次性搅拌子	ThermoFisher Scientific	14-513-95	一次性磁力搅拌子。
PTFE 螺纹密封聚四氟乙烯胶带	VWR	470042-938	用于加强气体系统连接的聚四氟乙烯胶带。
Q-Gard 2 纯化滤芯	MilliporeSigma	QGARD00D2	Milli-Q 系统用纯化滤芯。
可重复使用培养基储存瓶	ThermoFisher Scientific	06-423A	用于配制和储存培养基的瓶子。
橡胶塞，30 mm，灰色溴丁基	DWK Life Sciences	224100-331	用于血清瓶的橡胶塞。
带模制刻度的血清瓶，500 mL	DWK Life Sciences	223952	用于密闭培养的玻璃血清瓶。
小口径延长管套装	Braun Medical	471960	带鲁尔锁接头的延长管。
氯化钠	MilliporeSigma	S3014	固体氯化钠盐。
内参对照 I（高微生物载量）	ZymoBIOMICS	D6320	用于绝对微生物载量计算的内参微生物（I. halotolerans 和 A. halotolerans）
Stericup 快速释放无菌真空过滤系统	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm 真空过滤腔室。
Super Sani-Cloth 杀菌型一次性擦拭巾	Professional Disposables International	H04082	用于灭菌的一次性杀菌擦拭巾。
微量元素混合液，1000 倍浓缩液	ThermoFisher Scientific	NC0112668	生理浓度微量元素的浓缩溶液。
无衬铝盖密封，30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	压接在橡胶塞顶部的铝盖密封件。
USP 医用级空气钢瓶	Airgas	AI USP200	用于鼓泡系统输入的压缩空气钢瓶。
USP 医用级氧气钢瓶	Airgas	OX USP200	用于鼓泡系统输入的压缩氧气钢瓶。