拟南芥种子表面灭菌的高通量、稳健性和高时间灵活性方法

Summary

提供用于 拟南芥（Arabidopsis） 种子表面灭菌的高通量方案，通过带有真空泵的简单抽吸装置优化液体处理步骤。数百个种子样品可以在一天内进行表面灭菌。

Abstract

拟南芥是迄今为止最广泛用于功能研究的植物模型物种。拟南芥种子的表面灭菌是实现这一目标所需的基本步骤。因此，建立高通量拟南芥种子表面灭菌方法以同时处理数十至数百个样品（例如，转基因品系，生态型或突变体）至关重要。本研究提出了一种基于用普通真空泵构成的自制抽吸装置有效消除管中液体的种子表面灭菌方法。通过大大减少劳动密集型的动手时间，这种方法可以在一天内处理数百个样品，而几乎不费吹灰之力。系列时间过程分析进一步表明，通过保持高发芽率，表面灭菌的时间范围高度灵活。该方法可以很容易地适应于其他种类小种子的表面灭菌，只需根据种子大小和消除液体所需的速度对抽吸装置进行简单的定制。

Introduction

拟南芥是一种二倍体植物，属于芸苔科。其相对较短的生命周期（在长日生长条件下每代两个月），植物体积小，并且每株植物产生数百个种子的自花授粉使其成为第一个基本植物模型物种^1，2。此外，其基因组被完全测序^3，广泛的反向遗传学工具（饱和的T-DNA、转座子和化学诱变的群体）都可用^4、5、6，并且有效的农杆菌介导的转化是建立起来的，以获得足够的转基因品系，用于进一步的下游工作7.因此，在过去的二十年中，使用拟南芥作为模型物种在分子水平上剖析植物生物学的各个方面方面取得了巨大进展，包括自然，遗传和表型变异^8，9。

为了在功能上表征拟南芥感兴趣的基因，种子表面灭菌以消除真菌和细菌污染物是许多需要轴线培养的下游方案的先决条件步骤。遗传转化对于过表达^10、敲低（RNA-I^11）

Protocol

1. 试剂和培养基制备

1. 制备70%乙醇溶液:将737毫升95%工业乙醇加入263毫升蒸馏水中。彻底混合。
   注意:在非无菌工作台上准备70%乙醇溶液。
   注意:乙醇高度易燃，会对眼睛造成严重刺激。远离火焰和热源。如果接触眼睛，请用大量清水冲洗。
2. 准备5%漂白剂溶液:将5毫升家用漂白剂（含有约3.5%次氯酸钠，NaClO）加入95毫升无菌蒸馏水中。加入几滴非离子洗涤剂（例如吐温20）并彻底混合。
   注意:在层流罩内准备5%漂白剂溶液。
   注意:次氯酸钠是漂白剂的活性成分，具有高度刺激性。它具有高度腐蚀性，可对胃肠道造成严重损害。如不慎接触，请立即用大量清水冲洗。如果摄入，请致电中毒控制中心或医生寻求治疗建议。
3. 准备半强度的村子和Skoog（1/2 MS）中等^26。
   1. 在800毫升蒸馏水中加入2.2克MS培养基粉末（包括维生素）和10克蔗糖。使用1 M KOH调节溶液的pH值，并使用蒸馏水将体积调高至1 L。将500毫升等分到1升瓶中，加入4克琼脂以制备固体培养基。高压灭菌解决方案。
   2. 高压灭菌后，在水浴中将培养基冷却至50-53°C，然后将其倒入层流罩下的培养皿中。为了制备选择性培养基，向培养基（50-53°C）中加入1000μL / L的50mg / mL卡那霉素储备溶液（将500mg硫酸卡那霉素一水合物混合在10mL蒸馏水中，过滤灭菌并储存在-20°C）。通过旋转混合均匀，....

Results

为了评估整个种子灭菌过程所需的时间，计算了当前方案中96个样品的液体处理时间差，并与传统移液方法进行了比较。结果表明，当前协议节省了时间，将液体处理时间缩短到传统协议的四分之一（表1）。该表进一步强调，与传统方法相比，当前方案中的液体去除时间节省了更多时间，总体减少了八倍。

种子灭菌时间范围的选择
较长的灭菌步骤可最大限度地降低污染率，但会对种子发芽产生负面影响。为了确定具有最高发芽率且无污染的种子灭菌的最佳时间范围，测试了每个灭菌步骤的不同持续时间，评估了种子发芽率和绿色子叶出苗率。从第2天到第4天和第7天进行的发芽分析表明，从10分钟到40分钟70%乙醇灭菌的时间范围内没有显着差异。然而，从用70%乙醇处理40分钟后，发芽率下降（图3）。相应地，绿色子叶出现率降低（图4）。由于较短的灭菌时间可以提高通量，但会增加污染率，因此评估了在两批48个样品中对96个不同种子样品进行灭菌所需的最短时.......

Discussion

种子灭菌是拟南芥功能研究的基本步骤。虽然它经常用于许多不同的目的，但对拟南芥高通量种子表面灭菌的研究有限。

到目前为止，吞吐量最高的方法之一是使用漂白剂与浓缩HCl混合产生的氯气。虽然这种方法需要有限的动手时间，但它使用的气体对人类有剧毒²⁷.此外，必须仔细控制要进行表面灭菌的种子数量和表面种子灭菌的持续时间。如果种子太多，氯气的剂量将不足以完全杀死种皮上存在的微生物，从而导致种子批次的广泛污染。另一方面，如果表面灭菌的持续时间太长，种子将被杀死。因此，尽管有一些优点，但熏蒸并不是拟南芥中种子表面灭菌的首选方法。

相比之下，有许多基于液体的拟南芥种子表面灭菌的方法有^28、29、30种。然而，这些方法的主要局限性是它们可以专门用于少量样品，并且它们没有针对通量进行优化。据我们所知，关于拟南芥种子高.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
水族箱阀	Amazon	B074CYC5SD	套件包括 2 个阀门和薄壁管。阀门可防止液体返回无菌尖端
拟南芥 Col-0 野生型种子	诺丁汉拟南芥库存中心	N1093	野生型种子（对卡那霉素敏感）
拟南芥转基因系 AdoIspS-79 种子	NA	NA	过表达来自在 Col-0 背景中转化的 Arundo donax 异戊二烯合酶基因的转基因系，对卡那霉素耐药（Li et al. （2017） Mol. Biol. Evol.， 34， 2583–2599）. 可应作者要求提供
离心机	Eppendorf	EP022628188	微量离心机，用于旋转种子
Murashige &包含维生素	Duchefa	M0222	植物无菌培养标准培养基
移液器控制器	品牌	26300	用于作血清移液器
聚乙烯管 1	Roth	9591.1	用于连接真空泵和倾析瓶的管（内径：7 mm;外径：9 mm）
聚乙烯管 2	Roth	9587.1	用于从倾析瓶连接到水族箱阀门的管子 （内径 5 mm;外径 7 mm）
带连接器的螺旋盖	Roth	PY86.1	2 路分液器螺旋盖 GL45 聚丙烯材质，用于醒
血清移液管	品牌	27823	刻度玻璃（可重复使用）血清移液管。可以使用一次性移液器代替
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II 珠磨仪通常用于组织匀浆。无需在试管中添加珠子，它就可以用作摇床。
工业乙醇	ITW 试剂 （Nova Chimica Srl）	212800	乙醇 96% v/v 部分变性 技术级
吐温 20	Merck Millipore	655205	非离子洗涤剂用作表面活性剂
通用管道连接器	Roth	Y523.1	可用于改进/简化管道连接
真空泵	Merck Millipore	WP6222050	用于制作抽吸装置