提供了一种对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子进行高通量表面灭菌的实验方案，通过使用真空泵构建的简易吸液装置优化了液体操作步骤。每天可对数百个种子样品完成表面灭菌处理。
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摘要
摘要
拟南芥是目前用于功能研究中最广泛使用的植物模式物种。对拟南芥种子进行表面灭菌是实现这一目标所必需的关键步骤。因此，建立高通量的拟南芥种子表面灭菌方法，以同时处理数十至数百个样品（例如转基因株系、生态型或突变体），显得尤为重要。本研究介绍了一种基于自制抽吸装置的种子表面灭菌方法，该装置由常见的真空泵构建而成，可高效去除试管中的液体。通过该方法，可显著减少费力的手动操作时间，轻松实现一天内处理数百个样品。连续的时间进程分析进一步表明，该方法在保持高萌发率的同时，具有高度灵活的表面灭菌时间范围。通过根据种子大小和所需液体去除速度对抽吸装置进行简单定制，该方法还可轻松适用于其他类型小种子的表面灭菌。
引言
拟南芥是一种二倍体植物，属于十字花科。其相对较短的生命周期（在长日照生长条件下每代约两个月）、植株体型小，以及通过自花授粉每株可产生数百粒种子的特性，使其成为首个基础性的植物模式物种。1,2此外，其基因组已完全测序。3，可获得大量反向遗传学工具（饱和T-DNA、转座子和化学诱变群体）4,5,6，且有效 农杆菌介导的转化已得到充分确立，可用于获得足够的转基因株系以进行后续下游工作7因此，在过去二十年中，利用拟南芥作为模式物种，在分子水平上解析植物生物学的各个方面取得了巨大进展，包括自然变异、遗传变异和表型变异。8,9.
为了在拟南芥中对目标基因进行功能表征，消除真菌和细菌污染的种子表面灭菌是许多需要无菌培养的后续实验方案的前提步骤。遗传转化以实现基因功能的过表达10、基因沉默（RNA干扰11）或基因敲除（基因组编辑12,13）、亚细胞定位14、启动子活性分析15,16、蛋白质-蛋白质17及蛋白质-DNA相互作用研究18等常见应用，均需进行种子表面灭菌。因此，尽管该步骤相对简单，种子表面灭菌在诸多基因功能分析中仍具有基础性作用。
目前，种子表面灭菌方法主要分为两大类，分别基于气相灭菌和液相灭菌19。尽管气相种子表面灭菌的通量中等至较高，但由于使用具有危害性的试剂氯气作为表面灭菌剂，限制了其广泛应用。相比之下，基于液相灭菌的方法依赖于较温和的化学试剂，如乙醇和次氯酸钠溶液进行表面灭菌，尽管其固有的通量低于氯气熏蒸，但应用更为广泛。通常，使用液体试剂的灭菌方法主要有两种。一种广泛应用的方法是采用不同浓度的乙醇和次氯酸钠溶液，在不同时间长度内进行清洗20,21。另一种方法则仅使用次氯酸钠溶液处理21,22。这两种方法主要用于小规模的种子表面灭菌。然而，在许多实验中，需要对来自一次转化的大量拟南芥转基因株系进行筛选15,23，或并行筛选来自多次转化的多个转基因株系24,25。据我们所知，目前尚未有基于液体试剂的高通量种子表面灭菌方法被报道，这虽然未被充分认识，却构成了功能基因组学研究中的一个重要瓶颈。因此，开发安全、可靠且高通量的种子表面灭菌方法，是实现同时对大量基因进行功能鉴定所必需且关键的一步。
为此，本研究提出了一种改进的拟南芥种子表面灭菌方法。该方法安全、低成本、高度稳健且通量高，可在一小时内完成从种子表面灭菌开始到在培养皿中播种结束的96个独立品系的操作。该方法依赖于广泛可得的基础实验仪器，如真空泵、玻璃器皿和塑料耗材。这种改进的方法为科学界提供了一种安全、简便且经济的途径，可高效地进行种子表面灭菌，其通量足以满足拟南芥及其他非模式植物物种现代功能基因组学研究的需求。
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方案
1. 试剂与培养基的配制
- 配制70%乙醇溶液：将737 mL的95%工业乙醇加入263 mL蒸馏水中，充分混匀。
注意：在非无菌操作台配制70%乙醇溶液。
警告：乙醇高度易燃，可对眼睛造成严重刺激。应远离火焰和热源。若接触眼睛，立即用大量清水冲洗。 - 配制5%次氯酸钠溶液：将5 mL家用漂白剂（含约3.5%次氯酸钠，NaClO）加入95 mL无菌蒸馏水中，加入几滴非离子型去污剂（例如Tween 20），充分混匀。
注意：在超净工作台内配制5%次氯酸钠溶液。
警告：次氯酸钠是漂白剂的活性成分，具有强烈刺激性，高度腐蚀性，可能对胃肠道造成严重损伤。若发生接触，立即用大量清水冲洗；若误食，请立即联系中毒控制中心或医生以获取治疗建议。 - 配制半强度Murashige和Skoog（½ MS）培养基26。
- 将2.2 g MS培养基粉末（含维生素）和10 g蔗糖加入800 mL蒸馏水中，用1 M KOH调节溶液pH值，并用蒸馏水定容至1 L。将500 mL溶液分装至1 L瓶中，加入4 g琼脂以制备固体培养基，随后进行高压灭菌。
- 高压灭菌后，将培养基在水浴中冷却至50–53 °C，在超净工作台中倒入培养皿。为制备选择性培养基，向培养基（50–53 °C）中加入1000 µL/L的50 mg/mL卡那霉素储备液（将500 mg硫酸卡那霉素一水合物溶于10 mL蒸馏水中，过滤除菌后于-20 °C保存）。轻轻旋转混匀后，按前述方法倒入培养皿中。
2. 吸液装置设置
注意：仪器设置详见图1。
- 将真空泵的进气口连接至一段合适尺寸的聚乙烯（PE）管的一端。将PE管的另一端连接至分液瓶双通盖的出口。用密封膜（材料表）紧密包裹管路连接处，确保连接处密封不漏气。
- 将另一段PE管连接至分液瓶螺口盖的进气口（即伸入瓶内的突出孔口）。将管子的另一端连接至一个水族阀的出口。如有必要，沿连接处用密封膜包裹，以防止漏气。
- 使用前，于超净工作台内将一个无菌的200 µL移液器吸头安装至水族过滤器的进气口。
图1：高通量去除灭菌液体用抽吸装置的示意图。 为清晰起见，各部件未按比例绘制。字母（A）表示真空泵，（B）表示收集液体（乙醇、次氯酸钠或无菌水）的储液瓶，（C）表示防止液体倒流的阀门，（D）表示无菌的200 µL吸头，（E）表示含有种子和灭菌液体的1.5 mL微量离心管。箭头指示气流方向。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 种子的高通量液体表面灭菌
注意：使用96个独立样本对野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh，生态型Col-0）种子进行表面灭菌的整体操作流程及最短所需时间详见图2。
- 使用永久性记号笔将两批共96个1.5 mL离心管分别标记为连续编号。
- 向96个无菌的1.5 mL离心管中每个管加入100–200粒拟南芥种子（种子量约为锥底末端以上1–2 mm）。
- 在超净工作台内，使用10 mL无菌刻度移液管向每管加入约1000 µL 70%乙醇（第一批次种子，共48管），并小心盖紧管盖。
注意：溶液的分配无需极其精确，只要加入体积远大于种子体积即可。也可在超净台外（非无菌条件）进行此步骤。 - 将离心管置于摇床中，以8.0 Hz的振荡频率振荡至少3分钟。
- 从摇床中取出适配器，并将其转移至台式微量离心机的转篮中。
- 使用台式离心机的瞬时离心功能（pulse function）快速离心，使离心力达到1880 × g（约15秒）。
注意：离心时间过长或离心力过高会对种子萌发产生不利影响。 - 将48个离心管从适配器转移至一个试管架中，并在超净工作台内打开所有管盖。操作时避免触碰管盖插入管体的部分以防污染。若管盖间距过小，可将管子分置于两个试管架中以便操作。
- 在超净工作台内，将一个无菌的200 µL黄色吸头安装至自制抽滤装置的鱼缸阀门入口，并开启泵。
- 将黄色吸头插入至种子液面稍上方，避免吸取液体时接触种子。也可迅速将吸头置于管底；若种子堵塞吸液，应更换新的黄色吸头。
- 在超净工作台内，使用10 mL无菌刻度移液管向每管加入约1000 µL 5%次氯酸钠溶液（漂白剂）。
- 拧紧所有管盖，并将所有离心管重新放回摇床适配器中。以8.0 Hz的振荡频率在摇床中振荡至少3分钟。
- 使用台式离心机的瞬时离心功能，快速离心至离心力达到1880 × g（约15秒）。
- 在超净工作台内，将一个新的无菌200 µL黄色吸头安装至连接真空泵的鱼缸阀门，并开启泵。
- 将黄色吸头插入至种子液面稍上方，避免吸取漂白液时接触种子。
- 在超净工作台内，使用10 mL无菌刻度移液管向每管加入约1000 µL无菌H2O。
注意：可将两批种子合并操作，以缩短操作时间。 - 在超净工作台内，将一个新的无菌200 µL黄色吸头安装至连接真空泵的鱼缸阀门，并开启泵。
- 将黄色吸头插入至种子液面稍上方，避免吸取H2O时接触种子。
- 在超净工作台内，使用10 mL无菌刻度移液管向每管加入约500 µL无菌H2O，并盖紧所有管盖。种子现已准备就绪，可进行播种。如需暂存，可在室温下放置数小时（最多），或在4 °C下过夜。
- 向用于收集废液的储液瓶中加入适量水并进行高压灭菌。随后，将废液倒入普通水槽中弃去。
注意：需对废液进行高压灭菌，以杀死储液瓶内所有种子。
图 2：对96个独立样品的拟南芥种子进行表面消毒的操作流程及最短所需时间概览。 在本实验中，96个独立样品被分为两个规模相等的批次进行处理。两个批次的操作流程完全相同，并行进行，但第二批次相较于第一批次延迟一个步骤执行。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 在½ MS平板上接种和观察拟南芥
- 使用1000 µL移液器，通过轻柔吹打将种子和300–400 µL无菌H2O转移至培养皿中。
- 在转移10个管后，向每个培养皿中倒入约1.5–2.0 mL已融化的不含抗生素的½ MS培养基。
注意：提前融化，并将½ MS融化培养基置于50–53 °C的恒温水浴中保温，以防止凝固。确保温度不超过58 °C，以免降低种子的发芽能力。 - 迅速轻轻旋转培养皿，使种子均匀分布。用胶带将培养皿对侧封好。
- 用塑料膜或铝箔包裹培养皿，然后置于4 °C冰箱中避光保存3天，以获得一致的萌发效果。
- 将培养皿转移至生长室中，在长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）、23 °C、光照强度为100–120 µmol·m-2·s-1、相对湿度60%的条件下培养。
- 两天后，根据胚根的出现情况对植株进行评分。观察胚根伸出及子叶转绿并完全展开（两片子叶完全打开）的情况，以评估种子萌发程度。
5. 统计分析
注意：此处采用 Tukey 成对检验进行统计分析。
- 将 P 值小于 0.01 视为具有统计学显著性。所有实验至少需进行五次生物学重复。
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结果
为了评估完成整个种子灭菌程序所需的时间，计算并比较了当前方案中处理96个样品的液体操作时间与传统移液方法的差异。结果表明，当前方案节省了时间，使液体操作时间减少至传统方案的四分之一（表1）。该表进一步指出，当前方案在液体去除步骤上比传统方法节省更多时间，总体时间减少达八倍。
种子灭菌时间范围的选择
较长的灭菌步骤可最大限度降低污染率，但可能对种子萌发产生不利影响。为了确定在无污染情况下萌发率最高的最佳种子灭菌时间范围，测试了不同灭菌时长，并评估了种子萌发率和绿色子叶出现率。第2天至第4天以及第7天进行的萌发分析表明，在70%乙醇灭菌时间为10分钟至40分钟范围内，萌发率无显著差异。然而，当70%乙醇处理时间超过40分钟时，萌发率开始下降（图3）。相应地，绿色子叶出现率也随之降低（图4）。由于较短的灭菌时间可提高处理通量，但会增加污染风险，因此评估了对两批各48个样本（共96个不同种子样本）...
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讨论
种子灭菌是拟南芥功能研究的基本步骤。尽管该操作常因多种不同目的而进行，但目前关于拟南芥高通量种子表面灭菌的研究仍十分有限。
迄今为止，通量最高的方法之一是通过将次氯酸钠溶液与浓盐酸混合产生氯气进行灭菌。尽管该方法所需人工操作时间较短，但所使用的氯气对人体具有高度毒性27。此外，需要灭菌的种子数量以及表面灭菌的持续时间必须严格控制。若种子数量过多，氯气剂量将不足以完全杀灭种子表面存在的微生物，从而导致种子批次广泛污染；反之，若表面灭菌时间过长，则会导致种子死亡。因此，尽管该方法具有一些优势，熏蒸法并非拟南芥种子表面灭菌的首选方法。
相比之下，目前已有一些基于液体的拟南芥种子表面灭菌方法可供使用28,29,30。然而，这些方法的主要局限在于仅适用于少量样本，且未针对高通量操作进行优化。据我们所知，唯...
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
本研究由特伦托自治省资助，用于支持 Mach 基金会生态基因组学团队的核心研究工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水族箱阀门 | Amazon | B074CYC5SD | 包含2个阀门和薄壁管的套装。该阀门可防止液体回流至无菌吸头 |
| 拟南芥Col-0野生型种子 | 诺丁汉拟南芥种质资源中心 | N1093 | 野生型种子（对卡那霉素敏感） |
| 转基因拟南芥AdoIspS-79品系种子 | NA | NA | 在Col-0背景下转化并过表达芦竹来源异戊二烯合成酶基因的转基因株系，具有卡那霉素抗性（Li等（2017）Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599）。可向作者申请获取 |
| 微量离心机 | Eppendorf | EP022628188 | 台式微量离心机，用于离心沉降种子 |
| 含维生素的MS培养基（Murashige & Skoog） | Duchefa | M0222 | 植物无菌培养的标准培养基 |
| 移液控制器 | Brand | 26300 | 用于操作血清移液管 |
| 聚乙烯管1 | Roth | 9591.1 | 用于连接真空泵与抽滤瓶的管道（内径：7 mm；外径：9 mm） |
| 聚乙烯管2 | Roth | 9587.1 | 用于连接抽滤瓶与水族箱阀门的管道（内径：5 mm；外径：7 mm） |
| 带接头的螺口盖 | Roth | PY86.1 | 聚丙烯材质GL45双通分配用螺口盖，适用于抽滤瓶 |
| 血清移液管 | Brand | 27823 | 带刻度的玻璃（可重复使用）血清移液管。也可使用一次性移液管替代 |
| 振荡器 et al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II珠磨式均质仪，通常用于组织匀浆。若不向管中添加研磨珠，则可用作振荡器 |
| 工业级乙醇 | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | 体积分数96%的部分变性工业级乙醇 |
| 吐温20（Tween 20） | Merck Millipore | 655205 | 作为表面活性剂的非离子型去污剂 |
| 通用管路连接头 | Roth | Y523.1 | 可用于改进或简化管路连接 |
| 真空泵 | Merck Millipore | WP6222050 | 用于构建抽吸装置 |
参考文献
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