量化多巴胺能神经元形态改变与变性水平 秀丽隐杆线虫

摘要

本文展示了如何使用七分评分系统，对 C. elegans 中多巴胺能神经元树突形态的变化进行一致性的量化。该系统适用于利用遗传、化学及基于年龄的神经退行性疾病模型，开展多巴胺能神经变性实验的分析。

摘要

多巴胺能神经元的丢失与帕金森病（PD）的病理过程相关，帕金森病是一种高度常见的神经退行性疾病，全球受影响人数超过1000万。由于目前对PD病因的许多细节仍不清楚，因此需要开展研究以探索遗传和环境因素在PD发生中的作用，从而发现预防、管理和治疗该病的方法。对多巴胺能神经元丢失的准确表征不仅可能与PD研究相关，也可能与其他日益常见的神经退行性疾病相关。

在线虫模型系统 Caenorhabditis elegans 中，已建立多种遗传性和化学性多巴胺能神经元变性的模型，其透明的身体和稳定的神经元结构便于对神经生物学过程进行直观观察。特别是，可通过携带由细胞特异性启动子（如仅在8个多巴胺能神经元中表达的多巴胺转运蛋白基因 dat-1）驱动的荧光报告基因品系，来观察雌雄同体 C. elegans 多巴胺能神经元的形态学变化。

利用该模型系统及相应技术，许多实验室已对多巴胺能神经元的变性进行了研究。然而，目前在数据分析方法上缺乏一致性，大量现有文献采用二元评分分析法，仅能反映变性是否发生，却无法全面捕捉神经元丢失的进展过程。本文介绍一种通用评分系统，用于评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）头部神经元树突的形态学变化及变性程度。该七分制评分系统可覆盖从健康神经元到树突完全缺失的整个形态学变化范围，并纳入对弯曲、分支、出芽样突起（blebs）和断裂等形态学细节的评估。借助此评分系统，研究人员能够量化与年龄相关的细微变化，以及由化学物质诱导的更显著的改变。最后，我们提供一套配有注释的练习图像，可用于培训、校准和评估初次使用该方法的研究人员的评分一致性。这将有助于提高实验室内部及不同实验室之间研究结果的一致性，增强研究的严谨性和可重复性。

引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种日益常见的神经退行性疾病，全球患者人数高达1000万¹。男性和老年人群患帕金森病的风险更高；该病的平均发病年龄为60岁，帕金森病在普通人群中的发病率为0.3%，而在80岁以上人群中发病率上升至3%^1,2。尽管帕金森病病理机制的细节尚未完全阐明，但这种进行性疾病涉及中脑黑质区域多巴胺能神经元的丧失。目前推测的神经元损伤机制包括线粒体功能障碍、氧化应激和炎症反应²。该病的病因和风险因素仍在研究中，已知涉及环境因素与遗传因素的共同作用¹。例如，研究发现长期接触农药与帕金森病之间存在正相关关系，同时某些基因易感性也与家族性帕金森病相关^1,3。

的 秀丽隐杆线虫 模式系统，最初部分为神经生物学研究而开发⁴，非常适合用于评估多巴胺能神经元的丢失 体内Nass 及其同事率先使用了 秀丽隐杆线虫 用于多巴胺能神经变性⁵，此后许多研究团队已采用该线虫作为帕金森病及多巴胺能功能障碍的成功模型^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. 秀丽隐杆线虫 是许多神经退行性疾病的良好模型，原因与它们在生物学其他领域广受欢迎作为模式生物的原因相似；其透明性使得 体内 细胞过程研究中，线虫的遗传操作相对快速简便，其世代周期约为三天，且易于培养维护²¹大多数帕金森病（PD）线虫模型可分为三类：基于年龄的模型、化学诱导模型和遗传模型。线虫群体的同步化能力使得研究人员能够利用基于年龄的神经退行性疾病模型来研究与衰老相关的神经退行性病变，例如帕金森病。²²已采用多种化学物质建立可诱导帕金森病样神经元缺陷的化学暴露模型，包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）、鱼藤酮和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）。²²线虫也被成功用作帕金森病的遗传学模型；特定神经基因敲除的品系可模拟多种神经退行性疾病^1,4遗传因素与环境因素的组合，或 "基因-环境相互作用，" 这可能在帕金森病（PD）中起主要作用^{2,17,23,24,25,26,27,28}，已由多个研究团队使用 秀丽隐杆线虫最后，与年龄相关的多巴胺能神经变性也已被观察到^29,30如果在荧光成像中使用合适的神经元转基因品系，这些帕金森病线虫模型中的任何一种均可用于研究多巴胺能神经元的变性。

量化神经元形态的变化是神经退行性研究中的关键环节。C. elegans 中已有多种荧光报告基因品系被用于观察神经元的形态变化及神经元丢失。适用于神经元成像的品系通常带有与细胞特异性启动子关联的荧光蛋白。在多巴胺能神经元退行性检测中，本实验室使用的是 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] 品系，该品系在 dat-1 基因中插入了绿色荧光蛋白（GFP）标签，并在多巴胺能神经元中表达。需注意，BY200 的滚动表型外显率极低，很少被观察到。其他常用于此类成像的品系包括 BY250 [dat-1p::GFP]、BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]]、BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]]，以及来自线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）或特定实验室索取的其他多个品系^1,21,22,29。这些品系通常可用于观察三类多巴胺能神经元：头感神经元（CEP）、前侧感神经元（ADE）和后侧感神经元（PDE）。C. elegans 本身不天然表达α-突触核蛋白，但 BY273 等品系已被改造为可表达该蛋白。然而需要指出的是，本文所介绍的评分系统是基于不表达α-突触核蛋白的 BY200 品系开发的，若用于该品系或其他新品系，需先进行验证。雄性个体中还存在额外的多巴胺能神经元，但由于雄性在 C. elegans 种群中通常占比不足<1%，因此很少被纳入考虑。本文聚焦于 C. elegans 头部区域的四个 CEP 多巴胺能神经元。这组神经元在荧光显微镜下易于定位，在雌雄同体和雄性线虫中均存在，通常不会与其他自体荧光区域重叠，且在线虫研究中常被报道。值得注意的是，尽管这些神经元无髓鞘包裹，但 CEP 背侧（CEPD）神经元直接暴露于假体腔体液中，而 CEP 腹侧神经元则不然。健康的 CEP 树突通常呈现为相对笔直、连续的线条。退化的树突可能出现多种不规则形态和损伤迹象，包括沿树突走向出现明显的泡状突起（称为“blebs”）以及树突线条的断裂。不同程度退化的 CEP 神经元示例见图1。

尽管越来越多的 C. elegans 实验室正在研究多巴胺能神经元的神经退行性变，但在量化多巴胺能神经元损伤的分析方法上仍存在较大差异^{29,31,32,33,34}。许多已发表的研究采用二元评分系统，仅报告CEP胞体是否存在，即退变型神经元与典型或野生型神经元的有无^31,32。这类评分方法可识别某些诱导神经退行性变的应激因素，但无法量化更细微神经损伤的进展过程，也难以轻易检测由不同化学物质或其他变量所诱导的神经退行性变之间的差异。此外，专注于细胞体的评分系统可能对较轻程度的损伤不敏感，或无法检测仅影响细胞部分结构（如树突）的神经损伤。由于树突在化学应激因素作用下表现出最广泛且可稳定检测的形态学变化，我们选择将其作为分析的基础。本文提出的评分系统是在本实验室先前使用的基于树突形态的多点量表基础上改进而来^29,33。该系统将原有的五点和六点量表扩展为七点量表，以纳入与年龄相关的形态学变化（例如老年成虫树突中预期出现更多的弯曲），并区分严重损伤与树突完全缺失的情况。引入此评分系统的目的是能够在所有程度的神经损伤水平上全面捕捉神经退行性变的图景，并提供一个通用系统，以支持 C. elegans 多巴胺能神经退行性变研究的一致性。由于评分本身具有主观性，因此至关重要的是最大限度地提高不同评分者之间的一致性，并通过手动或自动屏蔽程序对评分者设盲，使其无法知晓图像的身份信息³⁵。为了提高一致性，我们提供了一系列培训图像，并利用 JoVE 的视频功能详细演示本评分系统。我们建议采用一种既能实现自动设盲评分，又允许评分者通过重新评分部分图像来量化自身评分一致性的系统。当整合或比较多位科研人员的数据，或培训初次进行评分的科研人员时，这一点尤为重要。

方案

1. 准备用于成像的线虫

注意：参见相关的 JoVE 视频文章³¹： https://www.jove.com/v/835/ 

1. 对于每个实验组，用移液器或挑取20至30条线虫，转移至与成像显微镜兼容的成像平台。常用的平台包括载玻片上固定的2%琼脂糖凝胶垫（加盖盖玻片）³¹，以及含有体积等于或小于100 µL液体培养基的96孔板。
2. 通过向线虫中添加30–90 mM叠氮化钠（NaN₃）、2.5–8.5 mM盐酸左旋咪唑（levamisole HCl）或其他麻痹剂使其麻痹。若在液体中进行麻痹，所用麻痹剂浓度应高于在琼脂糖垫上进行时的浓度。轻轻敲击成像平台以混匀。
3. 让线虫完全麻痹。
   注意：此过程可能需要数分钟。

2. 成像多巴胺能神经元

1. 使用能够拍摄z轴层扫图像的显微镜，在单色GFP荧光下定位线虫的头部区域。
   1. 注意曝光和光圈设置；避免树突过度曝光，并在各次实验中保持设置一致。将树突调至清晰可视化所需的足够亮度；这通常会导致胞体过曝。
      注意：本方案中包含的图像均使用400倍放大倍数拍摄。
2. 调节焦距，找到树突清晰可见的最上层和最下层位置，并将这两个位置设定为z轴层扫图像采集的上下边界。
3. 单击以采集每条线虫的z轴层扫图像。
   ​注意：以下所有步骤可在任意时间进行。

3. 准备用于评分的多巴胺能神经元图像

1. 对于每个 z 轴层叠图像，使用显微镜软件或外部图像分析软件打开图像文件，将图像层叠加载至软件中，并将该层叠压缩为单个平面化图像。
2. 在不同处理组之间以及组内，通过手动或使用自动盲法软件对图像进行盲化处理。

4. 评分多巴胺能神经元树突

1. 一次处理一个神经元图像。从四个CEP树突中选择一个，评估其是否存在出芽、断裂以及弯曲、扭结和曲率等异常。建议在图像中鼻部位于上方时，从左至右进行评分，以确保评分的可重复性。
2. 根据以下指南，为树突分配一个评分值。参见 图1 代表性评分图像示例。
   0 - 无损伤， "完美" 神经元
   1- 不规则（扭结、弯曲等）
   2- <5个胞质突起
   3-5-10 出芽
   4- >10 个伪足和/或破裂细胞的去除 <总树突的25%
   5-断裂，去除25-75%的树突
   6- ​断裂， >75% 树突被移除
   1. 如果单个树突内满足多个标准（即同时存在成角和肿胀），则采用适用的最高分值。
   2. 不要对因图像采集问题、与其他树突重叠等原因导致无法清晰辨认的树突进行评分。若在放大观察投影的z轴层叠图像时，需注意放大的像素可能形似假性芽状突起。
3. 对每根树突重复上述步骤。对所有图像重复上述过程。
4. 记录所有评分。此时可解除盲法。

5. 准备并展示数据

1. 计算分配给每个神经变性评分的各处理组中的树突总数。计算每个处理组中完成评分的树突总数。
2. 将各处理组中神经变性评分的计数除以该处理组中完成评分的树突总数。以各处理组中处于每个神经变性评分的树突比例形式呈现数据。

6. 进行统计分析

1. 使用编程软件或手动方式，对所有需要比较的处理组之间进行卡方独立性检验。在适当情况下，根据所比较的实验组数量对 p 值进行邦弗罗尼校正，以校正多重比较问题。
   注意：该检验将确定两组之间的显著性差异，但差异类型的具体细节需通过肉眼观察进一步判断。
   1. 选择待比较的实验组。具体选择取决于实验设计。
      ​注意：在我们的实验中，通常将对照组与其相应的处理组进行比较，所有对照组之间相互比较，所有处理组之间也相互比较。

7. 使用多巴胺能神经元图像练习集进行评分练习

1. 请参见补充文件1，其中包含一组神经元图像，覆盖本评分系统的全部范围，并附有注释和评分关键说明。该练习图像集旨在培训初次使用本方法的研究人员，并确保评分者之间的可靠性。

8. 考虑替代方案选项

1. 无需采集z轴层扫图像，直接在显微镜下完成评分，不保存或叠加图像。
   注意：该方法降低了对技术设备的要求，但无法建立神经元图像存档以供后续复查，需手动设盲，且仅能在不同处理组之间设盲，不能在处理组内设盲。
2. 无需为每个层扫图像生成单个压缩图像，而是通过滚动浏览每个z轴层扫图像序列完成评分。
   注意：该方法对部分评分者可能更为简便，可降低因成像过程中线虫移动而产生假性出芽结构的误判风险，并允许对重叠的树突进行评分，但需手动设盲，且仅能在不同处理组之间设盲，不能在处理组内设盲。

结果

本文所述评分系统用于评估经鱼藤酮暴露后，L4幼虫期BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans中的神经退行性变。该实验结果见图2，展示了本评分系统检测和量化多巴胺能神经元损伤程度的能力。鱼藤酮是一种天然存在的电子传递链复合物I抑制剂，常用于某些杀虫剂、杀鱼剂和杀虫药中^36,37。请注意，操作鱼藤酮等有毒化学品具有固有危险性，所有实验室均应遵守所在机构规定的使用和处置规范。在本实验中，采用两种浓度（0.03 µM 和 0.5 µM）的液体鱼藤酮处理，并设置对照组，处理始于使用0.5 M氢氧化钠/1%次氯酸钠裂解以收集卵后立即开始³⁸。卵在含0.25%二甲基亚砜（DMSO）的完全K培养基^33,39中孵化，线虫在液体中培养约48小时，直至达到中期L4幼虫阶段，随后终止化学暴露，按上述方案步骤进行制备、成像，并以图1为参考进行评分。对于较高剂量（0.5 µM）鱼藤酮处理组，为补偿鱼藤酮引起的发育延迟并确保成像时所有线虫处于相同发育阶段，卵的收集提前24小时进行。

图2 进一步展示了本实验室如何可视化使用该评分系统收集的数据。在该图中，可以观察到剂量依赖性的神经变性反应，并且清晰地显示了评分分布的具体构成。这些特定结果展示了神经元损伤可能以不同方式呈现。例如，与对照组相比，0.03 µM 鱼藤酮暴露组中评分为0的健康神经元比例降低，但评分为5的神经元比例也有所下降。检测实验组之间评分分布的这一细节，凸显了我们所采用的七分制评分系统的敏感性。根据实验方案，采用卡方独立性检验并结合邦弗罗尼校正对该数据进行了统计学显著性分析。

图1．多巴胺能神经元形态改变与退化评分系统的代表性图像。本整合图表包含了各个评分等级的神经元示例，可用于评分时的参考。此处，每个标注的评分均对应于每条线虫中损伤最严重的树突，如各图中箭头所示。这些图像采用本文所述方案，利用BY200株系的C. elegans获取。有关带注释的评分图像集，可用于培训初次使用该评分方法的人员，请参见补充文件1。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2．BY200 L4 多巴胺神经元在鱼藤酮暴露后的形态学及变性评分。本图展示了使用本文所述评分方法分析的代表性结果。通过卡方独立性检验对不同鱼藤酮暴露浓度下受损多巴胺能神经元比例升高的现象进行了统计学分析。与对照组相比，两个鱼藤酮处理组均显示出具有统计学意义的 p 值。不同的字母表示存在统计学差异。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1. 请点击此处下载该文件。

补充文件 2。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案展示了如何使用我们实验室开发的七分制评分系统，对C. elegans中多巴胺能神经元的形态改变和退化程度进行定量分析。我们创建并共享该评分系统，旨在为线虫中多巴胺能神经退行性变研究的分析提供标准化工具。鉴于研究高发性神经退行性疾病相关通路的重要性，许多研究者利用C. elegans模型在神经生物学可视化方面的优势来开展神经退行性变研究^29,31,32,33。然而，目前尚无统一努力以减少在不同线虫神经退行性变研究中对神经损伤量化方式的巨大差异。因此，本文提出的评分系统旨在促进分析结果的一致性，并支持不同研究之间的比较。

我们的评分系统可用于分析来源于秀丽隐杆线虫（C. elegans）实验的数据，这些实验使用细胞特异性的荧光报告基因，以实现多巴胺能神经元——特别是CEP树突——的可视化观察。具体而言，针对多巴胺能神经元在dat-1基因位点标记GFP的品系适用于本评分方案，尽管目前还存在许多其他相关的帕金森病（PD）转基因模型。该评分系统也可能适用于这些模型，但在使用前应先进行验证。特别需要注意的是，据我们所知尚未经过测试，表达mCherry的品系可能不太适合本方案，因为mCherry的聚集可能难以与出芽样结构（blebs）区分，或可能导致细胞应激。本文并不对所有特定的PD及相关神经退行性疾病模型进行评述，而是聚焦于神经退行性变数据本身的评分方法。此外，本方案仅关注神经元形态学变化，不涉及胞体荧光强度的评估。神经退行性变检测可与神经退行性疾病相关的行为学检测联合进行，例如运动能力、寿命及健康寿命实验。利用该评分系统，还可进一步确认并详细描述已建立的化学诱导型、年龄依赖型及遗传型帕金森病模型中的退变程度。对与帕金森病及其他神经退行性疾病相关的模型、影响因素及通路进行量化分析，有助于增进对这些疾病机制的科学认知，并为应对日益增长的患者群体提供管理思路。在文献中获得可比的神经退行性变研究结果，是实现这一目标的关键。

为了阐释本评分系统所得结果，我们建议将每条树突的评分视为 n=1，因为同一条线虫内的不同神经元对处理的反应往往存在差异。这可能是由于只有 CEPD 神经元直接暴露于假体腔体液中所致。因此，可将实验组的评分分布表示为各组中总树突评分数量的比例。本方法用于本文展示的代表性结果，便于在不同处理组之间进行比较，能够反映同一条线虫内神经元反应的差异性，并可通过卡方检验结合多重比较的邦弗罗尼校正进行简便的统计分析。记录神经元评分并计算百分比的示例模板见补充文件 2。我们曾考虑过两种替代的数据分析方法，并发现每种方法均存在缺陷。第一种方法是将每条线虫的四个 CEP 神经元评分取平均值。这种方法对数据进行了参数化处理，但其假设评分增加与效应呈线性关系，且会丢失同一条线虫内对处理反应差异的信息。第二种方法是将每条线虫的四个 CEP 神经元评分相加，这也是一种参数化处理方式。虽然该方法仍假设评分之间存在线性关系，但通过扩大可能评分的参数范围，相较于平均评分更能反映每条线虫内的差异。然而，无论研究人员选择何种方式展示数据，结果均应结合菌株、线虫年龄等实验变量进行综合考量；例如，较老的线虫具有更高的基础退变水平预期值。

在解读这些神经变性评分结果时，研究人员还应注意该评分方法存在的一些注意事项和局限性。首先，为获得适合评分的图像，需要满足一定的技术要求。成像显微镜必须具备荧光通道，以及能够清晰显示 CEP 树突的放大倍数和曝光设置。如实验方案中所述，可通过调整方案来降低技术要求，例如直接在显微镜视野下对活体样本进行实时评分，而非先采集图像再进行存档和后续评分。其次，由于该数据属于非参数数据，可用于分析的统计方法较为有限。尽管评分量表被认为是渐进的，但由于评分选项是离散的，且评分之间的增量在生物学功能上不一定成比例，因此不能将其视为数值型数据。基于这些原因，卡方独立性检验（chi-squared test for independence）最适合此类数据，这意味着统计分析的结果依赖于观察者来判断统计显著性的具体方向。值得注意的是，卡方检验仅能分析评分分布的差异，无法提供特定评分类别之间存在差异的证据。最后，该评分系统所量化的形态学变化在功能上的意义仍有待研究。

该评分系统的开发所引发的未来研究方向包括确定其生物学基础以及与单个神经元评分的相关性。研究评分量表上各个分值的功能意义（例如神经元信号传导、线虫行为）将有助于更好地将实验结果转化为可用于理解神经退行性疾病的病因和后果，并推动预防和治疗策略发展的结论。未来关于线虫神经退行性的研究应致力于发现其与其他形态学特征（如线虫的形状和大小）之间的关联。此外，还可通过研究其他报告基因型的 C. elegans 品系，检测生物能量学、活性氧产生以及线粒体形态等终点指标，从而为神经退行性研究提供支持。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	VWR	29442-056	用于孔中成像
Blinder	Solibyte Solutions LLC		可在上传的图像文件集之间和内部进行盲法处理的免费软件
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]	Aschner 实验室		C. elegans 菌株，适用于多巴胺能神经元荧光成像。也可替换为其他由细胞特异性启动子驱动荧光报告基因的菌株 可向 Meyer 实验室申请获取
完全K培养基			51 mM 氯化钠，32 mM 氯化钾，3 mM 氯化钙，3 mM 硫酸镁，13 mM 胆固醇
盖玻片 22x22 mm，1号玻璃	VWR VistaVision	48366-067	用于载玻片上的成像
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	472301	鱼藤酮暴露实验中的溶剂
ImageJ	美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）	ImageJ 1.5e 或更新版本。Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016。	用于图像处理的软件
Keyence BZ-X 一体化荧光显微镜	Keyence		用于荧光多巴胺能神经元图像采集。可替换为其他适用于荧光高分辨率成像的显微镜
显微镜载玻片 3x1"	VWR VistaVision	16004-420	用于载玻片上的成像
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	电子传递链复合物I抑制剂
叠氮化钠（NaN_3）	Sigma-Aldrich	S2002	麻痹剂
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S2770	用于漂白裂解
次氯酸钠	VWR	RC7495.5-32	用于漂白裂解
盐酸四咪唑（左旋咪唑）（HCl）	Sigma-Aldrich	L9756	麻痹剂