方法文章

测量重组Perfringolysin O透化细胞中的线粒体底物通量

DOI：

10.3791/62902

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2021年8月13日

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1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在本研究中，我们描述了一种改进的实验方案，通过使用重组的perfringolysin O并结合基于微孔板的呼吸测定法来检测线粒体呼吸底物通量。利用该方案，我们展示了二甲双胍对两种不同肿瘤细胞系线粒体呼吸功能的影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体底物通量是每种细胞类型的显著特征，其组分（如转运蛋白、通道或酶）的变化参与了多种疾病的发病机制。线粒体底物通量可通过完整细胞、透化细胞或分离的线粒体进行研究。在完整细胞中进行研究时，由于不同底物的同时氧化，会遇到多种问题。此外，多种细胞类型含有不同的内源性底物储存，使结果解读变得复杂。线粒体分离或使用透化试剂等方法难以重复。从小样本中获取足量且膜结构完整的高纯度线粒体具有挑战性。使用非选择性透化剂会导致不同程度且不可避免的线粒体膜损伤。重组产气荚膜梭菌溶素O（rPFO）因其能够选择性地透化质膜而不影响线粒体完整性，被认为是一种更合适的透化剂。当与微孔板呼吸测定法结合使用时，可在单次实验中以最少的细胞数量完成多个重复，检测多种线粒体底物的通量。本研究中描述的实验方案可用于比较两种不同细胞表型或基因型的线粒体底物通量，并可根据需要定制以检测不同的线粒体底物或抑制剂。

引言

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基于微孔板的呼吸测定技术通过实现对少量样本的细胞呼吸研究，彻底改变了线粒体研究领域1。尽管线粒体的功能范围远不止能量生成，细胞呼吸通常仍被视为线粒体功能或“功能障碍”的指标2。在有氧条件下，线粒体通过分解不同底物并将其转化为可为三羧酸循环提供燃料的代谢中间产物，从而提取其中储存的能量3（图1）。底物的持续流动对于三羧酸循环的运行至关重要，可生成高能“电子供体”，这些电子供体将电子传递给电子传递链，进而在线粒体内膜上建立质子梯度，驱动ATP合酶将ADP磷酸化为ATP4。因此，测定线粒体呼吸的实验设计必须包括样本类型（完整细胞、通透化细胞或分离的线粒体）以及线粒体底物。

细胞储存有内源性底物5，而线粒体可同时氧化多种类型的底物6，这使得对完整细胞实验所获得结果的解释变得复杂。研究线粒体氧化特定底物能力的常用方法是分离线粒体或对所研究的细胞进行透化处理5。尽管分离的线粒体适用于定量研究，但分离过程费时费力，且面临诸多技术难题，例如需要较大的样本量、产物纯度以及技术的可重复性5。透化细胞可克服线粒体分离的诸多缺点；然而，常规的去垢剂类透化试剂缺乏特异性，可能损伤线粒体膜5。

重组产气荚膜溶素O（rPFO）被用作一种选择性细胞质膜通透化试剂7，并在多项研究中成功与细胞外通量分析仪联用7,8,9,10。我们改进了一种利用rPFO结合XFe96细胞外通量分析仪筛选线粒体底物通量的实验方案。该方案比较了两种细胞表型中四种不同的底物氧化途径，同时为每种待测物质设置了足够的重复次数和适当的对照。

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方案

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1. 检测前一天

  1. 试剂和底物的准备。
    1. 线粒体检测溶液（MAS）：按照表1所述方法配制所有试剂的储备液。将甘露醇和蔗糖的储备液加热至37 °C，使其完全溶解。混合各试剂以配制2倍浓度的MAS，然后将混合液加热至37 °C。用5 N KOH调节pH至7.4（约7 mL），再加水定容至1 L。过滤除菌 后分装，于-20 °C保存至检测当天。
    2. 牛血清白蛋白（5% BSA）：将5 g BSA加入90 mL预热的无菌水中，在磁力搅拌器上溶解，避免剧烈震荡。用5 N KOH调节pH至7.4，然后加水定容至100 mL。过滤除菌后分装，于-20 °C保存至检测当天。
    3. 线粒体底物：在无菌水中分别配制1 M的琥珀酸钠、丙酮酸钠和谷氨酸钠储备液。在无菌水中配制100 mM的苹果酸钠储备液，并使用预热的无菌水配制10 mM的棕榈酰肉碱储备液 。用5 N KOH将每种溶液的pH调节至7.4，并进行过滤除菌。将底物储存在2–8 °C。使用前将棕榈酰肉碱加热至37 °C，以溶解可能析出的沉淀。除丙酮酸外，其余底物的分装样品可在使用后于-20 °C长期保存。
    4. 线粒体抑制剂：使用二甲基亚砜（DMSO）配制以下储备液：25 mM 寡霉素、50 mM 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）、20 mM 鱼藤酮和20 mM 抗霉素A。分装后于-20 °C保存。
  2. 细胞接种与处理：如图2所示，在第2至第11列中接种细胞。第1列和第12列应保持空白，作为背景孔。本研究中使用了HepG2和A549细胞。 
    1. 以每孔20,000个细胞的密度接种细胞。接种时使用50–80 µL细胞培养基。
    2. 在空白孔中加入等体积的细胞培养基，将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育。让细胞贴壁3–4小时后，向所有孔中加入100 µL细胞培养基。
    3. 在最后一次添加培养基的同时，对第7至第11列进行处理。本研究中，实验组用1 mM盐酸二甲双胍处理16小时，对照组则加入等体积的无菌蒸馏水作为溶剂对照。
  3. 传感器水化：向校准板每孔加入200 µL无菌水，然后小心地将传感器探头放回，确保传感器浸入水中。将探头置于不含CO2的培养箱中，37 °C孵育至次日。
  4. 检测方案模板设置：开启分析仪（见材料表）和控制器单元。启动仪器控制与数据采集软件，并按照表2所述设计检测方案。在组别定义中，创建四种加样策略，其中A通道根据所注入的底物不同而有所区别（图3）。根据底物名称或其缩写命名这些策略。
  5. 将寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A分别分配至B、C和D通道 。创建八个组，并按图4所示命名。在板图中将各组分配至相应孔位，然后将该方案保存为可直接使用的模板。保持分析仪持续开机，以便温度整夜稳定。将分析仪放置在温度稳定的环境中，避免温度骤变。

2. 检测当天

  1. 用校准液替换水：弃去工具板中的水，每孔加入200 µL预热的校准液。将 cartridge 放回无 CO2 的培养箱中，直至进行实验。为避免校准液快速蒸发，需在培养箱内保持湿度来源，并将风扇速度关闭或调至最低。
  2. 配制工作液：首先将2倍浓缩的MAS、5% BSA和无菌水预热至37 °C。同时，使抑制剂储备液恢复至室温。按照 表3 所述，使用预热的2倍浓缩MAS和无菌去离子水配制5 mL底物和抑制剂的工作浓度溶液。
  3. 加载注射端口：如 图3 所示，将20 µL底物加入A端口。将琥珀酸/鱼藤酮混合液加入A、B行的A端口；将丙酮酸/苹果酸混合液加入C、D行的A端口；将谷氨酸/苹果酸混合液加入E、F行的A端口；将棕榈酰肉碱/苹果酸混合液加入G、H行的A端口。整块板中，B端口加入22 µL寡霉素工作液，C端口加入25 µL FCCP工作液，D端口加入27 µL鱼藤酮/抗霉素A混合液。
  4. 启动校准步骤：在 运行实验 选项卡下，点击 开始运行 以启动实验。插入已加载的传感器cartridge，开始校准步骤。等待校准完成后再进入下一步。
  5. 配制实验缓冲液（MAS-BSA-rPFO）：在50 mL离心管中混合10 mL 2倍浓缩MAS、9.2 mL无菌水和0.8 mL 5% BSA，配制成20 mL实验缓冲液。加入2 µL 10 µM rPFO，使终浓度为1 nM，并用移液器轻轻吹打混匀。避免剧烈震荡，不得使用涡旋振荡器混匀。将该溶液在37 °C孵育，直至使用前。
  6. 洗涤细胞：使用多通道移液器，用预热的无钙、无镁磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞及空白对照孔两次。禁止重复使用同一枪头来弃去培养基或添加PBS。此步骤应在超净台外进行，以防止气流导致细胞干燥。
  7. 在实验缓冲液中进行细胞透化：使用多通道移液器弃去PBS，每孔加入180 µL预热的实验缓冲液（MAS-BSA-rPFO）。
  8. 开始测量：细胞透化后立即用细胞板 替换已校准传感器cartridge上的工具板，并启动测量。

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结果

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首先将结果归一化至基础呼吸的第二次测量值，以显示为氧消耗率百分比（OCR%）。该检测的结果如图5、图6、图7、和 图8所示。为每组正确分配背景孔并使其他组的背景孔失活至关重要。图5显示，处理组的琥珀酸盐诱导呼吸速率更高。A549细胞对二甲双胍处理的响应（图5A）高于HepG2细胞（图5B）。背景对照孔仅包括与比较组相同行的孔，本例中为A1、B1、A12和B12孔。图6显示了丙酮酸/苹果酸诱导呼吸的变化。图7显示了谷氨酸/苹果酸诱导呼吸的变化...

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讨论

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本方案是对先前已发表研究7,8,9,10及产品使用指南的改进。与生产商提供的方案不同，本方案使用2× MAS替代3× MAS，因为2× MAS更易溶解，且在冷冻后不会形成沉淀。冷冻保存的2× MAS分装样品可稳定储存长达六个月，并能获得一致的实验结果。另一不同之处在于，将ADP加入2× MAS的组分中，同时从配方中省略BSA。含BSA的溶液更难注射，且更容易导致操作误差和异常值。然而，BSA的存在对于减少实现充分通透化所需的rPFO用量至关重要。因此，BSA仅被添加至细胞洗涤后的通透化步骤所用的检测培养基（MAS-BSA-rPFO）中。

为了从细胞培养基中清洗细胞，本方案使用PBS而非MAS。PBS为等渗溶液，不会引起细胞形态的改变；而MAS不含钠离子且富含钾离子，可能改变细胞形态。另一个主要区别在于本检测方案中保留了平衡步骤。...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢赫拉德茨-克拉洛韦医学院生理学系和第三医学院病理生理学系工作人员在化学品和样品制备方面提供的帮助。本研究得到了查理大学资助项目PROGRES Q40/02、捷克卫生部资助项目NU21-01-00259、捷克科学基金会资助项目18-10144以及由捷克共和国教育、青年和体育部和欧洲联盟资助的INOMED项目CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺苷5′′ 二磷酸一钾二水合物默克A5285-20℃保存 °C
抗霉素A默克A8674-20储存 °C
牛血清白蛋白默克A38032 - 8℃保存 °C
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙默克C2920-20℃保存 °C
二甲基亚砜默克D8418室温保存
D-甘露醇默克63559室温保存
杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190-144室温保存
乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸默克03777室温保存
HEPES默克H7523室温保存
L(-)苹果酸二钠盐默克M9138室温保存
L-谷氨酸钠盐水合物默克G5889室温保存
六水合氯化镁默克M2670室温保存
寡霉素默克O4876-20储存 °C
棕榈酰-DL-肉碱氯化物默克P4509-20 保存 °C
氢氧化钾默克484016室温保存
磷酸二氢钾默克P5655室温保存
鱼藤酮默克R8875-20 保存 °C
Seahorse Wave 桌面软件安捷伦科技从 www.agilent.com 下载
Seahorse XFe96 分析仪安捷伦科技
Seahorse XFe96 FluxPak安捷伦科技102416-100XFe96 传感器芯片和 XF96 细胞培养微孔板
丙酮酸钠默克P22562 - 8℃保存 °C
六水合琥珀酸钠二碱默克S2378室温保存
蔗糖默克S7903室温保存
水默克W3500室温保存
XF 校准剂安捷伦科技100840-000室温保存
XF细胞膜透化剂安捷伦科技102504-100重组产气荚膜溶素 O（rPFO）— 分装后于 -20 保存 °C

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

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Perfringolysin O Seahorse XF A549

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