测量重组Perfringolysin O透化细胞中的线粒体底物通量

摘要

在本研究中，我们描述了一种改进的实验方案，通过使用重组的perfringolysin O并结合基于微孔板的呼吸测定法来检测线粒体呼吸底物通量。利用该方案，我们展示了二甲双胍对两种不同肿瘤细胞系线粒体呼吸功能的影响。

摘要

线粒体底物通量是每种细胞类型的显著特征，其组分（如转运蛋白、通道或酶）的变化参与了多种疾病的发病机制。线粒体底物通量可通过完整细胞、透化细胞或分离的线粒体进行研究。在完整细胞中进行研究时，由于不同底物的同时氧化，会遇到多种问题。此外，多种细胞类型含有不同的内源性底物储存，使结果解读变得复杂。线粒体分离或使用透化试剂等方法难以重复。从小样本中获取足量且膜结构完整的高纯度线粒体具有挑战性。使用非选择性透化剂会导致不同程度且不可避免的线粒体膜损伤。重组产气荚膜梭菌溶素O（rPFO）因其能够选择性地透化质膜而不影响线粒体完整性，被认为是一种更合适的透化剂。当与微孔板呼吸测定法结合使用时，可在单次实验中以最少的细胞数量完成多个重复，检测多种线粒体底物的通量。本研究中描述的实验方案可用于比较两种不同细胞表型或基因型的线粒体底物通量，并可根据需要定制以检测不同的线粒体底物或抑制剂。

引言

基于微孔板的呼吸测定技术通过实现对少量样本的细胞呼吸研究，彻底改变了线粒体研究领域¹。尽管线粒体的功能范围远不止能量生成，细胞呼吸通常仍被视为线粒体功能或“功能障碍”的指标²。在有氧条件下，线粒体通过分解不同底物并将其转化为可为三羧酸循环提供燃料的代谢中间产物，从而提取其中储存的能量³（图1）。底物的持续流动对于三羧酸循环的运行至关重要，可生成高能“电子供体”，这些电子供体将电子传递给电子传递链，进而在线粒体内膜上建立质子梯度，驱动ATP合酶将ADP磷酸化为ATP⁴。因此，测定线粒体呼吸的实验设计必须包括样本类型（完整细胞、通透化细胞或分离的线粒体）以及线粒体底物。

细胞储存有内源性底物⁵，而线粒体可同时氧化多种类型的底物⁶，这使得对完整细胞实验所获得结果的解释变得复杂。研究线粒体氧化特定底物能力的常用方法是分离线粒体或对所研究的细胞进行透化处理⁵。尽管分离的线粒体适用于定量研究，但分离过程费时费力，且面临诸多技术难题，例如需要较大的样本量、产物纯度以及技术的可重复性

方案

1. 检测前一天

1. 试剂和底物的准备。
   1. 线粒体检测溶液（MAS）：按照表1所述方法配制所有试剂的储备液。将甘露醇和蔗糖的储备液加热至37 °C，使其完全溶解。混合各试剂以配制2倍浓度的MAS，然后将混合液加热至37 °C。用5 N KOH调节pH至7.4（约7 mL），再加水定容至1 L。过滤除菌 后分装，于-20 °C保存至检测当天。
   2. 牛血清白蛋白（5% BSA）：将5 g BSA加入90 mL预热的无菌水中，在磁力搅拌器上溶解，避免剧烈震荡。用5 N KOH调节pH至7.4，然后加水定容至100 mL。过滤除菌后分装，于-20 °C保存至检测当天。
   3. 线粒体底物：在无菌水中分别配制1 M的琥珀酸钠、丙酮酸钠和谷氨酸钠储备液。在无菌水中配制100 mM的苹果酸钠储备液，并使用预热的无菌水配制10 mM的棕榈酰肉碱储备液 。用5 N KOH将每种溶液的pH调节至7.4，并进行过滤除菌。将底物储存在2–8 °C。使用前将棕榈酰肉碱加热至37 °C，以溶解可能析出的沉淀。除丙酮酸外，其余底物的分装样品可在使用后于-20 °C长期保存。
   4. 线粒体抑制剂：使用二甲基亚砜（DMSO）配制以下储备液：25 mM 寡霉素、50 mM 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）、20 mM 鱼藤酮和20 mM 抗霉素A。分装后于-20 °C保存。
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结果

首先将结果归一化至基础呼吸的第二次测量值，以显示为氧消耗率百分比（OCR%）。该检测的结果如图5、图6、图7、和 图8所示。为每组正确分配背景孔并使其他组的背景孔失活至关重要。图5显示，处理组的琥珀酸盐诱导呼吸速率更高。A549细胞对二甲双胍处理的响应（图5A）高于HepG2细胞（图5B）。背景对照孔仅包括与比较组相同行的孔，本例中为A1、B1、A12和B12孔。图6显示了丙酮酸/苹果酸诱导呼吸的变化。图7显示了谷氨酸/苹果酸诱导呼吸的变化.......

讨论

本方案是对先前已发表研究^7,8,9,10及产品使用指南的改进。与生产商提供的方案不同，本方案使用2× MAS替代3× MAS，因为2× MAS更易溶解，且在冷冻后不会形成沉淀。冷冻保存的2× MAS分装样品可稳定储存长达六个月，并能获得一致的实验结果。另一不同之处在于，将ADP加入2× MAS的组分中，同时从配方中省略BSA。含BSA的溶液更难注射，且更容易导致操作误差和异常值。然而，BSA的存在对于减少实现充分通透化所需的rPFO用量至关重要。因此，BSA仅被添加至细胞洗涤后的通透化步骤所用的检测培养基（MAS-BSA-rPFO）中。

为了从细胞培养基中清洗细胞，本方案使用PBS而非MAS。PBS为等渗溶液，不会引起细胞形态的改变；而MAS不含钠离子且富含钾离子，可能改变细胞形态。另一个主要区别在于本检测方案中保留了平衡步骤。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷5′′ 二磷酸一钾二水合物	默克	A5285	-20℃保存 °C
抗霉素A	默克	A8674	-20储存 °C
牛血清白蛋白	默克	A3803	2 - 8℃保存 °C
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙	默克	C2920	-20℃保存 °C
二甲基亚砜	默克	D8418	室温保存
D-甘露醇	默克	63559	室温保存
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	室温保存
乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸	默克	03777	室温保存
HEPES	默克	H7523	室温保存
L(-)苹果酸二钠盐	默克	M9138	室温保存
L-谷氨酸钠盐水合物	默克	G5889	室温保存
六水合氯化镁	默克	M2670	室温保存
寡霉素	默克	O4876	-20储存 °C
棕榈酰-DL-肉碱氯化物	默克	P4509	-20 保存 °C
氢氧化钾	默克	484016	室温保存
磷酸二氢钾	默克	P5655	室温保存
鱼藤酮	默克	R8875	-20 保存 °C
Seahorse Wave 桌面软件	安捷伦科技		从 www.agilent.com 下载
Seahorse XFe96 分析仪	安捷伦科技
Seahorse XFe96 FluxPak	安捷伦科技	102416-100	XFe96 传感器芯片和 XF96 细胞培养微孔板
丙酮酸钠	默克	P2256	2 - 8℃保存 °C
六水合琥珀酸钠二碱	默克	S2378	室温保存
蔗糖	默克	S7903	室温保存
水	默克	W3500	室温保存
XF 校准剂	安捷伦科技	100840-000	室温保存
XF细胞膜透化剂	安捷伦科技	102504-100	重组产气荚膜溶素 O（rPFO）— 分装后于 -20 保存 °C