体外 基于微米级有机电荷调控场效应晶体管阵列的多参数细胞分析

摘要

在此，我们介绍一种基于有机电荷调制场效应晶体管（OCMFET）器件的制备方案 体外 细胞互接。该装置称为微型OCMFET阵列，是一种柔性、低成本且无需参比电极的设备，可用于监测电活性细胞培养物的电生理与代谢活动。

摘要

现代电生理学的发展一直得益于日益先进的工具和材料的同步进步。反过来，该领域的发现又推动了技术的持续进步，这种双向互动过程最终促成了过去50年中令人瞩目的成就。然而，目前最常用的细胞界面器件（即微电极阵列和基于晶体管的微电子器件）仍然存在若干局限性，例如成本高昂、材料刚性以及需要外置参比电极。为了部分克服这些问题，有机生物电子学这一新兴科学领域应运而生，并带来了成本更低、材料更易获取以及创新制造技术等优势。

在过去十年中，已提出多种有趣的新型有机器件，用于方便地与细胞培养物进行交互。 本文介绍了基于有机电荷调制场效应晶体管（OCMFET）的细胞接口器件的制备方案。这类器件被称为微OCMFET阵列（MOAs），结合了有机电子学的优势与OCMFET的独特特性，可制备出透明、柔韧且无需参比电极的工具，用于体外监测心肌细胞和神经元的电活动及代谢活动，从而实现对电活性细胞模型的多参数评估。

引言

体内监测电活性细胞（如神经元和心肌细胞）是人类大脑基础研究、功能连接研究、药理学和毒理学等基本研究应用中一种有效且强大的方法。此类研究通常使用的工具主要基于微电极阵列（MEAs）^1,2,3,4,5，以及日益高效和强大的场效应器件（FEDs）^{6,7,8,9,10,11,12}。这两类器件能够实时监测和刺激神经元与心肌细胞的电活动，通常具有坚固、易于使用和可靠的特点。这些特性使MEAs和FEDs成为电生理应用的金标准，目前已被广泛用于与标准细胞培养、器官型脑切片以及三维类器官的接口连接^13,14,15,16。尽管MEAs和FEDs应用广泛且性能优异，但仍存在一些局限性，例如成本高、材料刚性较强，以及需要一个通常体积较大的参比电极——该电极必须置于测量液体环境中，且对器件的正常运行至关重要。

为了探索细胞界面的替代方案，过去十年中，研究人员在基于有机材料和创新制造技术的电子器件研究方面投入了大量努力¹⁷。在已研究的多种用于克服上述局限性的有机器件中，一种称为OCMFET的特殊有机晶体管最近被提出，可作为微电极阵列（MEAs）和场效应器件（FEDs）的有效替代方案¹⁸。除了有机电子技术所具备的标准特性，如低成本材料与制造工艺、优异的机械和化学性能、光学透明性以及生物相容性之外，OCMFET还因其双栅结构而具备超高的电荷灵敏度，且无需外接参比电极。此外，该有机传感器具有显著的能力，可根据其传感区域的特定功能化方式检测不同的分析物或物理参数，而该传感区域与晶体管区域是分离的^19,20。这些特性可被有效利用，以实现对细胞培养环境中多种参数的同时采集。特别是，除了能够检测神经元或心肌细胞的电活动外，还可通过简单的物理功能化方式，利用OCMFET独特的双栅结构所提供的超高pH灵敏度，可靠地监测由细胞代谢活动引起的局部微小pH变化²¹。

在 体外 细胞生物传感中，监测细胞代谢活性是评估细胞培养状态的有力指标，可用于评价细胞对多种刺激（如药物施加和电刺激）的响应^22,23此外，在神经科学应用的特定情况下，同时监测电活动和代谢活动具有重要意义，尤其在药理学和毒理学领域。²⁴旨在便捷地满足现代 体外 电生理学研究，同时兼具光寻址电场效应晶体管（OCMFET）的全部优势，一种名为微光寻址电场效应晶体管阵列（Micro OCMFET Array, MOA）的装置 recently introduced。MOA 是一种基于 OCMFET 的阵列，具有专为特定传感需求设计的特化感应区域。 体外 细胞界面，实现对电活性细胞培养物的多参数分析。特别是，其中两个MOA通道具有更大的传感区域，以最大化其灵敏度，并可选择性地进行功能化修饰，用于监测特定参数（如培养基的pH变化）。结构中的其他OCMFET则作为细胞外电活动传感器。 图1 显示了16通道微电极阵列（MOA）的结构。该特性结合无需外置参考电极的优势，使微电极阵列成为一种极具吸引力的工具 体外 应用。本研究展示了用于多传感的MOA的逐步制备方案 体外 神经元和心肌细胞电活动与代谢活动的检测 图2 展示了主要的制备步骤、所用材料及器件结构。

方案

遵循所有适用的国际、国家和/或机构关于动物护理和使用的指南。已尽一切努力减少本项目所用动物的数量，并尽量减轻其痛苦。

1. 显影液、刻蚀液、有机半导体溶液和光刻掩模的制备

1. 通过将 NaOH 颗粒溶于去离子水中，配制浓度为 175 mM 的显影溶液。
   注意：该反应为放热反应。若使用塑料容器，需持续搅动容器，直至所有颗粒完全溶解。
2. 通过将氢氟酸（HF）与去离子水混合（1 份浓度为 48% 的浓 HF，49 份去离子水），配制钛刻蚀溶液。
   警告：氢氟酸可轻易穿透皮肤，对深层组织造成严重损伤。必须迅速中和 HF，以防止组织持续破坏，这种破坏可能持续数天，导致严重伤害甚至死亡。HF 的风险程度取决于其浓度以及与酸接触的时间。操作时必须在通风橱内进行，并佩戴面罩。强烈建议佩戴双层手套。
3. 通过将碘、碘化钾和去离子水混合（配制 250 g 溶液时，使用 200 mL 去离子水、20 g KI 和 5 g I₂），配制金刻蚀溶液。在室温下搅拌 1 小时，使用前静置过夜。
4. 将 6,13-双(三异丙基硅乙炔基)并五苯（TIPS Pentacene）溶于苯甲醚中（质量分数 1%），在 80 °C 的加热板上轻轻搅拌 2 小时，以配制半导体溶液。
   注意：持续搅动该溶液。使用棕色玻璃小瓶和/或在低光照条件下储存。
5. 使用矢量图形软件制备所需的光刻掩模组。整个工艺共需制备 5 套掩模：用于浮动栅极（FGs）图形化的掩模；用于电生理记录中通孔及传感区域开孔的掩模；用于自对准工艺的掩模；用于源极、漏极及控制栅顶接触图形化的掩模；以及用于 pH 通道等离子活化的掩模。
   ​注意：根据所需分辨率和特定的光刻装置，可使用不同类型的掩模。对于本方案中提出的器件（最大横向分辨率为 40 µm），已在本地复印店购买了简单的塑料柔性掩模。

2. 底物的选择与制备

1. 从干净的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）片材上裁剪一块 6 × 6 cm² 的正方形，厚度为 250 µm。
   注意：起始基底应略大于最终器件尺寸，以留出足够宽的边缘，便于使用标准实验室镊子操作而不损坏基底。
2. 使用光学显微镜检查基底，排除存在深沟槽或划痕的情况。仔细选择划痕较少的基底，因为较大的缺陷可能导致最终器件失效。
3. 依次用丙酮、异丙醇和去离子水冲洗 PET 基底，并用氮气流吹干。将基底存放于洁净的塑料培养皿/容器中。

3. FG：钛沉积

1. 使用等离子体氧气对基底进行预清洗（100 W 下处理 30 秒），然后将其放置在热蒸发仪真空腔内的基底支架上。
2. 将 60 mg 钛放入坩埚中，关闭快门，抽真空至蒸发室压力低于 10^-6 Torr。逐渐提高蒸发仪功率，直至坩埚发红，保持 30 秒。打开快门，继续增加功率至 60%（或直至坩埚发出明亮白光），保持 60 秒。随后关闭快门并降低功率。
3. 从蒸发仪中取出基底，依次用丙酮、异丙醇和去离子水清洗，并用氮气气流吹干。再进行第二次氧气等离子体处理（200 W 下处理 60 秒），以使钛表面轻微氧化。

4. FG 图案化

1. 将一个基底置于通风橱内的匀胶机上。使用一次性塑料移液管将4 mL光刻胶滴加到基底表面。采用以下匀胶参数获得厚度为2 µm的光刻胶层：旋转速度：3000 rpm；旋转时间：45 s；加速时间：0.5 s；减速时间：0.5 s。
2. 将基底置于加热板上进行前烘（70 °C，5 min）。将基底存放在铝箔包裹的培养皿或塑料容器内，以避免直接暴露于光照下。
   注意：避免使用建议的烘焙温度（100 °C，50 s），以防基底变形。然而，较低温度下延长烘烤时间可确保良好效果。
3. 将器件放入曝光仪中，并将带有目标场效应电极（FG）布局的塑料光刻掩模精确放置在基底上。从上方用紫外光（UV）照射1分钟，然后小心取下掩模，注意尽量减少掩模在基底表面的横向移动，以防刮伤基底。
4. 将基底浸入装有显影液的玻璃容器中（步骤1.1），持续5秒。迅速用去离子水冲洗，并用氮气吹干。使用光学显微镜检查基底上是否存在显影不足或过度显影的区域。若出现显影不足，需重复将基底浸入显影液中。
5. 将暴露的钛层浸入钛刻蚀液（步骤1.2）中刻蚀15秒，随后用去离子水冲洗，并用氮气吹干。对基底进行光学检查，使用丙酮去除光刻胶。再用异丙醇和去离子水冲洗基底，并用氮气吹干。

5. 栅极介电层沉积

1. 使用实验室擦拭纸将2 mL的粘附促进剂（硅烷 - 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯）均匀涂布于Parylene涂覆仪的沉积室壁上，以准备沉积室。将300 mg的Parylene C二聚体（对应最终厚度为150 nm）放入Parylene涂覆仪中。将低压力值设定为7 mbar，高压力值设定为10 mbar。沉积完成后，依次用丙酮、异丙醇和去离子水清洗基底，并用氮气吹干。

6. 打开OCMFET的传感区域以记录电活动，并形成通孔以接触浮栅的背面

1. 使用与步骤 4.1 和 4.2 相同的参数将光刻胶涂覆在基底上。
2. 将器件置于曝光机中，在体视显微镜下将塑料光刻掩模精确对准基底上的通孔位置（在传感区域上方为直径 50 µm 的圆形开口，在远离传感区域的浮栅（FG）上方为 100 × 100 µm² 的开口，如图 1和图 2中所示的 FG 背面接触点），以提高对准精度。从上方用紫外光照射 1 分钟，然后小心移除掩模，注意尽量减少掩模在基底表面的横向移动，以避免划伤基底。
   注意：位于浮栅（FG）远离传感区域一侧的通孔（如图 1和图 2中所示的 FG 背面接触点）在晶体管表征过程中是必要的接触点。此外，能够实现对 FG 的电学接触可能在多种功能化方法（例如电沉积）中非常有用。
3. 按照步骤 4.4 中所述方法显影光刻胶。将带有图案化光刻胶（在此处作为掩模）的基底置于氧气等离子体中（200 W 下处理 180 秒），以去除传感区域上的聚对二甲苯 C（Parylene C）。
   注意：在 200 W 功率下，各向同性等离子清洗机中聚对二甲苯 C 的刻蚀速率约为 90 nm/min。为彻底清洁传感区域，需进行轻微过刻蚀。在此过程中光刻胶也会被刻蚀，但其厚度（2 µm）远大于聚对二甲苯 C 的厚度。
4. 将基底放入超声波清洗仪中装有丙酮的玻璃容器内，超声处理 10 秒，以完全去除光刻胶。随后用丙酮、异丙醇和水冲洗基底，并用氮气吹干。
   ​注意：使用超声处理而非仅用丙酮冲洗基底，对于防止聚对二甲苯 C 碎片在传感区域表面发生不期望的折叠和再沉积至关重要。

7. 源极和漏极与浮栅的自对准

1. 使用与步骤 4.1 和 4.2 相同的参数将光刻胶涂覆在基底上。将器件放入曝光机中，并在基底上放置一个带有简单黑色矩形的塑料光刻掩模，完全覆盖晶体管区域。从上下两面同时进行紫外光曝光 1 分钟，然后小心取下掩模，注意尽量减少掩模在基底表面的横向移动，以避免划伤基底。
   ​注意：通过双面曝光，浮栅（FGs）在底面曝光时起到光刻掩模的作用，而顶部掩模的存在则确保只有晶体管沟道区域上的光刻胶保持未曝光状态。
2. 按照步骤 4.4 中所述方法进行光刻胶显影。

8. 源极、漏极和控制栅的金沉积、沟道形成及图形化

1. 使用温和的等离子体处理（30 W，30 s）清洁基底，以促进金属在派瑞林C（Parylene C）上的附着，并将基底放置于热蒸发镀膜仪真空腔内的样品托上。
2. 将30 mg金放入坩埚中，关闭快门，抽真空至蒸发腔达到10^-5 Torr。逐渐增加蒸发源功率，直至坩埚呈现暗红色，保持30 s。打开快门，继续增加功率至40%（或直至坩埚呈现亮白色），保持60 s，随后关闭快门并降低功率。
3. 将基底放入超声波清洗仪中的丙酮容器内，超声10 s，以剥离光刻胶，从而去除晶体管沟道区域的金层。依次用丙酮、异丙醇和水冲洗基底，并用氮气吹干。采用与步骤4.1和4.2相同的参数，在基底上重新旋涂光刻胶。
4. 将器件置于曝光仪中，并在基底上放置带有预定源极、漏极和控制栅极图形的塑料光刻掩模。从上方进行1分钟紫外光曝光，随后小心取下掩模，注意尽量减少掩模在基底表面的横向移动，以防划伤样品。
5. 按照步骤4.4所述方法显影光刻胶。将暴露的金层浸入金刻蚀液（步骤1.3）中刻蚀10 s，用去离子水冲洗，并用氮气吹干。通过光学显微镜检查基底，使用丙酮去除剩余光刻胶，再依次用异丙醇和去离子水冲洗，并用氮气吹干。

9. 用于pH传感的聚对二甲苯C的沉积与活化

1. 使用与步骤 4.1 和 4.2 相同的参数，在基底上涂覆光刻胶。
2. 将器件放入曝光机中，并在基底上放置一个带有开口的塑料光刻掩模，开口位置对应于 OCMFET 的 pH 传感区域。从上方用紫外光照射 1 分钟，然后小心取下掩模，注意尽量减少掩模在基底上的横向移动，以避免划伤表面。
3. 按照步骤 4.4 所述方法显影光刻胶。使用聚酰亚胺绝缘胶带（见材料表）将整个器件除 pH 传感区域外的部分保护起来。采用与步骤 5.1 相同的参数，在基底上沉积一层 500 nm 厚的聚对二甲苯 C（对应 1 g 聚对二甲苯 C 二聚体）。
   注意：pH 传感区域上的聚对二甲苯 C 总厚度为 650 nm。此沉积过程无需使用硅烷化处理。
4. 小心移除聚酰亚胺绝缘胶带。将基底置于氧气等离子体中（200 W 下处理 5 分钟 30 秒），以活化 OCMFET pH 传感区域上的聚对二甲苯 C。
   注意：此处使用聚酰亚胺绝缘胶带是为了限制聚对二甲苯 C 的沉积范围。事实上，由于聚对二甲苯 C 形成的共形涂层几乎无针孔，仅依靠光刻胶进行简单的剥离工艺无法取得良好效果。
5. 将基底放入超声波清洗仪中的丙酮容器内处理 10 秒，以彻底去除光刻胶。用丙酮和异丙醇（不得使用水）冲洗基底，并用氮气吹干。

10. 半导体沉积、培养室放置以及从PET上最终切割出器件

1. 将基底置于50 °C的加热板上。取1 µL半导体溶液（步骤1.4）滴加至每个通道区域，用盖子覆盖整个基底，并在通风橱中干燥30分钟。
2. 使用3D打印机打印一个内径为15 mm、厚度为1 mm、高度为7 mm的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯环，以制备培养腔。使用聚二甲基硅氧烷（固化剂比例：15%重量比）将培养腔粘附至基底中央区域。通过手动或激光切割方式从PET基材上裁下器件。

11. 晶体管的电学表征

1. 使用源表仪对每个晶体管进行表征^18,19,20,21（参见材料表）。
   注意：应测量晶体管的输出特性和输入特性，以推导其参数（主要包括载流子迁移率、阈值电压、I_ON/I_OFF 比值和亚阈值斜率）。

结果

此处验证了MOA在电活动记录和代谢活性监测两方面的潜力。对设备检测细胞外动作电位能力的精确评估，基于大鼠心肌细胞培养物的全面表征（特别是对培养8天的大鼠原代心肌细胞进行的测量） 体外 [DIV]¹⁸. 图3A 显示一个包含16个OCMFET的完整MOA。上方插图展示了一个大鼠心肌细胞在MOA表面形成融合单层培养的示例。为突出细胞的健康状态，在记录结束后对细胞进行了免疫染色，以标记肌节蛋白原肌球蛋白。下方插图显示了使用OCMFET测量的单个心肌细胞信号。

有趣的是，该设备能够检测到自发的电活动以及施加不同化学物质后诱导产生的电活动，如图3B所示。这一验证对于证明该方法用于电活性细胞接口的可行性至关重要。由于阵列结构的设计，MOA还能够重建心脏电信号的传播速度，从而表明该系统适用于细胞网络的研究（图3C）。为进一步验证以确定设备的实际检测限，研究人员还使用纹状体神经元（21 DIV）对MOA进行了测试¹⁸，在信号幅度和记录可靠性方面获得了令人关注的结果。如图3D所示，OCMFET能够以显著的稳定性放大神经元场电位，信噪比（SNR）最高可达3.2（与标准MEA获得的信噪比范围相当²⁵）。记录系统由定制的多通道电子设备组成，用于晶体管偏置以及信号读取与调理。每个电记录通道的第一级包含一个I/V转换器，其反馈电阻为1 MΩ，并配备150 Hz–1.3 kHz的带通滤波器，电压增益为110。在所有展示的测量中，晶体管的偏置条件为V_DS = V_GS = -1 V。模数转换以及数据的可视化和存储通过数据采集板完成（见材料表）。所有测量均在法拉第笼内进行，以最大限度地减少系统所受的电学和环境噪声干扰。

如前所述，通过利用本方案中介绍的简单物理功能化方法，可制备出具有超能斯特响应的高灵敏度pH传感器。由于采用了上述制造方法，这些pH传感装置可集成到微电极阵列（MOA）中，用于监测原代海马体大鼠神经元代谢活动所引起的微小pH变化²⁶。具体而言，如图4所示，两个专用于低频传感的OCMFET中仅有一个被选择性地进行了功能化，以验证该方法的可行性。这种选择性功能化使得能够评估两个OCMFET对化学诱导的代谢变化的响应：特别是，可通过使用荷包牡丹碱（bicuculline, BIC）——一种GABA A受体抑制剂²⁷——来诱导高代谢状态；而通过添加河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）则可诱导低代谢状态，后者最终会导致细胞死亡²⁸。记录系统采用的是与电生理活动测量相同的定制多通道电子设备。

与之前的情况不同，本实验使用了两个专用通道来记录由细胞代谢活动引起的缓慢变化。每个通道均由一个简单电路组成，该电路包含两个主要部分：一个带有1 MΩ反馈电阻的I/V转换器，以及一个截止频率为10 Hz的低通滤波器。晶体管的偏置条件为V_DS = V_GS = -1 V，所有测量均在法拉第笼内进行，以尽量减少外部噪声对记录信号的影响（考虑到细胞代谢活动引起的电流波动非常微弱，这一点尤为重要）。实验过程中，细胞培养物维持在低缓冲能力的培养基中，整个系统置于受控环境中（37 °C，并持续通入CO₂/空气混合气体）。正如预期，只有对pH敏感的OCMFET电流能够被25 µM BIC的加入所调节。这一点进一步通过细胞代谢活动变化所引发的电流响应得到了验证。

在加入10 µM TTX后重复了相同的实验，结果导致细胞代谢逐渐减慢。加入TTX后，无论是对pH敏感的OCMFET还是对pH不敏感的OCMFET均未显示出任何响应，从而证明了该方法的有效性。这些结果表明所提出的功能化方法具有有效性，并且其相对稳定性可维持长达2周。从所提出的实验（包括电生理活性和代谢活性实验）中可以得出一个重要结论：通过在同一培养区域内选择性地功能化不同的OCMFET，可以制备出多种类型的传感器。这一特点在用于细胞应用的生物传感领域中是一项非同寻常的成就，因为在同一细胞培养体系中能够监测多种参数，对于更全面地表征这些生物系统的复杂性至关重要。

图1：用于电活性细胞代谢和电学监测的16通道MOA顶视图。 比例尺 = 1 cm。缩写：OCMFETs = 有机电荷调制场效应晶体管；FG = 浮栅；S/D = 源极/漏极；MOA = 微型OCMFET阵列。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：用于电活性细胞代谢与电学监测的 MOA 主要制备步骤。（A 和 B）采用标准光刻工艺对蒸镀的钛（Ti）薄膜进行图形化，以制备 OCMFET 的浮栅。（C）沉积 15 nm 厚的聚对二甲苯 C（Parylene C）。该层与天然形成的 Ti 氧化物共同作为晶体管的栅介质。（D 和 E）利用氧气等离子体处理对聚对二甲苯 C 层进行图形化。通过图形化的光刻胶层选择性暴露用于电学记录的传感区域以及浮栅背接触区域。（F）对金（Au）顶层电极进行图形化，包括源极、漏极、控制栅极和浮栅背接触。采用自对准技术以提升器件的电学性能。（G-I）在 OCMFET 的传感区域沉积第二层聚对二甲苯 C，用于代谢活性监测。经氧气等离子体处理后，该层将作为 pH 敏感膜（J）。（K）完成有机半导体（TIPS 并五苯）沉积及培养室定位后，完整 MOA 的横截面结构（含材料）。缩写：OCMFETs = 有机电荷调制场效应晶体管；FG = 浮栅；S/D = 源极/漏极；MOA = 微型 OCMFET 阵列；CG = 控制栅极；PET = 聚对苯二甲酸乙二醇酯；Par C = 聚对二甲苯 C；TIPS = 6,13-双(三异丙基硅乙炔基)并五苯；ABS = 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物。请点击此处查看该图的放大版本。

图3使用微电极阵列记录细胞电活动。 (A) 大鼠心肌细胞（8 DIV）在微电极阵列（MOA）表面形成融合培养，记录结束后经固定并针对肌节蛋白原肌球蛋白进行免疫染色（上插图）。下插图：使用OCMFET测量的单个心肌细胞信号示例。比例尺 = 150 µm。B) 心肌细胞培养物电活动的化学调控。加入100 mM去甲肾上腺素导致电活动加速，而加入100 mM维拉帕米则导致电活动抑制。左图：搏动频率的调节；右图：5个OCMFET器件的统计结果——平均值与标准差：4分钟内的尖峰计数，基础状态为（129 ± 4.6），去甲肾上腺素介导状态为（280 ± 28.6），维拉帕米介导状态为（15 ± 1.9）。C) 心电信号传播过程的重建。右侧：培养物的自发活动光栅图，显示信号从位点14传播到位点41（右侧）。D大鼠胚胎纹状体细胞的动作电位（21 DIV）。该图已根据原图修改 ¹⁸缩写：OCMFET = 有机电荷调制场效应晶体管；MOA = 微型OCMFET阵列；NE = 去甲肾上腺素；VER = 维拉帕米；DIV = 培养天数 体外. 请点击此处以查看该图的放大版本。

图4使用MOA进行代谢活性记录 (的响应ApH敏感和（B) 在加入 10 µM TTX 前后，对 MOA 的 pH 不敏感通道施加 25 µM BIC 的反应。加入 TTX 后，pH 敏感通道的行为变得与 pH 不敏感通道相似。特别是由于 TTX 诱导的细胞死亡，在加入 BIC 后无法观察到电流变化。C用于代谢活性记录的MOA示意图。pH敏感型和pH非敏感型OCMFET分别以绿色和红色标出。插图：培养15天后（15 DIV）生长在器件上的健康海马神经元。比例尺＝50 µm。该图已修改自 ²⁶缩写：OCMFET = 有机电荷调制场效应晶体管；MOA = 微型OCMFET阵列；BIC = 荷包牡丹碱；TTX = 河豚毒素；DIV = 培养天数 体外. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

与以往用于细胞应用的OCMFET制备方法^18,29不同，本研究所提出的方法专门设计用于制备可同时检测细胞电活动和代谢活动的MOA。此外，该实现pH敏感性的方法具有与标准制备工艺兼容的优势，且无需对传感区域进行任何化学修饰（这一特点确保了整个器件的生物相容性）。pH敏感性通过使用与栅极介电层相同的材料（即生物相容性材料聚对二甲苯C）来实现，从而使该方法快速且可重复。

该方法的最终成果是一种柔性、透明、低成本且具备多重传感功能的有机工具 体外 细胞应用。利用单个晶体管结构并通过简单物理修饰传感区域即可实现这一目标，这进一步凸显了使用有机电子材料和方法的优势。 此外，由于OCMFET的换能原理并不严格依赖于特定的半导体或浮栅材料，因此整个过程可根据具体应用需求进行修改和放大。

该技术方案的一个关键方面与等离子体活化技术的可重复性相关。为了获得一致的结果，必须同时控制聚对二甲苯C（Parylene C）的厚度及其刻蚀速率。必须定期校准聚对二甲苯C的沉积过程以及等离子清洗仪。其他影响工艺可重复性的关键因素还包括对器件的小心操作以及有机半导体的沉积。本文中采用了一种简单的滴涂法，该方法本身存在可重复性方面的局限性。为尽量减少这些问题，如实验方案第10.1步所述，每次应使用相同量的半导体溶液，并尽可能标准化溶剂的蒸发过程。使用加热板保持恒定温度，并在每次滴加溶液后覆盖基底，有助于减缓溶剂蒸发速度。为进一步降低此问题的影响，可更换沉积技术（例如采用喷墨打印方法）³⁰。

该方案的一个局限性源于用于pH传感的OCMFET功能化特性。pH传感器的稳定性仅能维持数周时间²⁶。然而，本方法的稳定时间窗口已足够覆盖神经元培养生长所需的标准孵育时间（2–3周）。对于更长时间的实验，应考虑采用其他类型传感区域的功能化方法。器件制备工艺中采用了专用的背接触结构，可实现对浮栅（FGs）的电学访问。该接触点在器件正常工作时处于悬空状态，但在需要时可用于器件的电学表征，以及利用不同技术（例如电沉积）对传感区域进行功能化处理。

该方法为制备用于细胞研究的多传感装置提供了一种便捷途径，无需使用昂贵材料或洁净室设施。尽管由于采用有机半导体以及传感区域的物理（而非化学）功能化，其性能与稳定性存在一定局限，但类似策略仍可用于制备低成本（甚至一次性）、机械柔性且光学透明的传感器与生物传感器，为细胞生物学、组织工程学和神经科学领域的研究人员提供研究细胞系统的新颖专用工具 体外.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯	Sigma Aldrich	440159
3D 打印机 Makerbot Replicator 2x	Makerbot		https://www.makerbot.gr/. 估计价格：2,000–3,000 欧元。
ABS 线材
苯甲醚	Sigma Aldrich	296295
Bromograph 型号 Hellas	Bungard		https://www.bungard.de/. 估计价格：1,000–2,000 欧元。
金	本地供应商
氢氟酸	Sigma Aldrich	695068
碘	Sigma Aldrich	207772
聚酰亚胺胶带			聚酰亚胺绝缘胶带
激光切割机 VLS2.30	Universal Laser Systems		https://www.ulsinc.com/it. 估计价格：20,000 欧元。
多通道系统数据采集板			www.multichannelsystems.com
氢氧化钠颗粒	Sigma Aldrich	567530
聚对二甲苯 C 二聚体	SCS special coating systems coating
PDMS Silgard 184	Sigma Aldrich	761036
PDS 2010 LABCOATER 2 聚对二甲苯沉积系统	SCS special coating systems		https://scscoatings.com/. 估计价格：50,000 欧元
双向拉伸 PET 薄膜（厚度 0.25 mm）	Goodfellow	ES301450
培养皿
等离子清洗机 Gambetti "Tucano"	Gambetti		https://www.gambetti.it/. 估计价格：20,000 欧元。
正性光刻胶 AZ1518	MicroChemicals
碘化钾 KI	Sigma Aldrich	221945
源表 2636	Keithley		https://it.farnell.com/. 估计价格：18,000 欧元
旋涂仪	Ossila		https://www.ossila.com/. 估计价格：2,500 欧元。
体视显微镜 SMZ745T	Nikon		https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. 估计价格：2,000–3,000 欧元。
热蒸发仪
TIPS 并五苯（6,13-双(三异丙基硅乙炔基)-并五苯）	Sigma Aldrich	716006
钛丝	Goodfellow	TI005129
超声波清洗机	Falc Instruments		https://www.falcinstruments.it/. 估计价格：1,000 欧元。