非热红外光治疗缺血/再灌注损伤及后续巨噬细胞分化分析

摘要

我们描述了在通过止血带建立的小鼠缺血再灌注模型中，670 nm 照射可减轻再灌注损伤。该 670 nm 照射可降低炎症反应，减少促炎型巨噬细胞数量，并增加保护性巨噬细胞数量。

摘要

由炎性过程引起的组织损伤和坏死是缺血再灌注损伤（IRI）的后果。在骨骼肌中，缺血会降低肌细胞的有氧能量产能能力，导致不利的生化改变和炎症反应。本研究的目的是证明在缺血期间暴露于近红外光（NIR）可通过减少坏死和炎症，同时减少促炎性M1型巨噬细胞并增加保护性M2型巨噬细胞，从而减轻IRI。C57/Bl6小鼠接受单侧止血带诱导的后肢缺血3小时，随后再灌注15分钟或30分钟。小鼠被随机分为3组。第1组经历IRI并进行30分钟再灌注。第2组经历IRI并进行15分钟再灌注。每组中50%为未接受NIR处理的小鼠，50%为接受NIR处理的小鼠，在止血带结扎后每小时接受5分钟、50 mW/cm²的照射。第3组为假手术动物，麻醉3小时但不实施IRI。

对所有小鼠进行激光多普勒血流成像以确认缺血与再灌注情况。血流数据表示为缺血肢体与对侧对照肢体的比值。再灌注后处死小鼠，取股四头肌和腓肠肌组织。对巨噬细胞标志物CD68（M1型）和CD206（M2型）进行免疫共沉淀和蛋白质印迹分析，并以CD14表达水平进行标准化。在缺血-再灌注损伤（IRI）组中，近红外光（NIR）显著降低了炎症标志物CXCL1和CXCL5的表达。在接受缺血-再灌注（IR）和近红外光（NIR）处理的动物中，观察到CD68表达显著减少，而CD206表达显著增加。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色可见，在IRI组中，近红外光（NIR）减少了组织坏死。研究结果表明，近红外光（NIR）暴露可减轻缺血-再灌注损伤（IRI），并改善组织存活。近红外光（NIR）减轻了炎症反应，减少了促炎性M1型巨噬细胞，并增加了保护性M2型巨噬细胞。近红外光（NIR）暴露减轻炎症并促进再生，从而在缺血后实现组织保护。

引言

缺血再灌注损伤（IRI）是血管损伤及外科止血带长时间使用后常见的临床难题。既往研究表明，60-90 分钟是热缺血时间的上限，超过此时限可能导致不可逆的组织损伤。在所有单一影响因素中，热缺血时间的限制是影响无血供肢体再植成功与挽救效果的最主要因素^1,2。

在骨骼肌中，缺血会降低细胞的有氧能力，导致急性炎症和不良的生化改变。再灌注会加剧这些效应，促进中性粒细胞的募集并产生活性氧自由基，进一步损伤骨骼肌。这种情况可能由血管阻塞引起，无论是因创伤所致，还是因有意使用止血带以防止出血所致。在此过程中的一些关键介质包括髓过氧化物酶（MPO），这是一种由中性粒细胞表达的酶，对呼吸爆发功能和自由基的产生至关重要³；以及趋化因子如CXCL1和CXCL5，它们可将中性粒细胞募集至急性炎症部位⁴。

为模拟紧急情况下使用开放式止血带，未对股动脉进行解剖分离。该方法还基于可重复地建立缺血与再灌注，以及稳定无血视野的需求。先前研究表明，在数天内对小鼠缺血后肢暴露于波长为670 nm的非热性近红外（NIR）光，可促进血管侧支形成，减轻缺血-再灌注损伤（IRI）的影响⁵。此外，已有研究证实，近红外光可诱导巨噬细胞极化为促炎性（M1）或促修复性（M2）表型⁶。

任何能够在缺氧和再灌注后减轻组织损伤和细胞死亡的治疗方法，都将有助于提高血管损伤后肢体保全的成功率。因此，本研究的总体目标是通过引入670 nm光治疗作为其他治疗方式的一种可行选择，以改善缺血-再灌注损伤（IRI）。本论文基于以下假设：在缺血期间暴露于近红外光（NIR）可诱导巨噬细胞向M2表型转化，从而减少趋化蛋白的分泌和炎性细胞的浸润，进而降低炎症反应和组织坏死。

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获得机构动物护理与使用委员会的批准（方案编号：AUA#1517）。所有涉及小鼠的研究均符合美国公共卫生署（PHS）政策的要求。 

1. 止血带的放置

注意：已放置止血带以诱导缺血并获得无血手术视野。

1. 将 C57/Bl6 小鼠置于异氟烷诱导室中，以 3-5% 的浓度进行麻醉。
2. 当小鼠对脚趾夹捏无反应时，将其从诱导室中取出。将小鼠置于鼻罩中，持续以 1.5-2% 的异氟烷维持麻醉，并将其放置于加热垫上，加热垫下方铺设非反光垫，正对激光多普勒成像仪（LDI）下方。
3. 在左后肢放置止血带（图1）。
   ​注意：此时不要闭合止血带。首先测量血流（见第2节）。

2. 通过激光多普勒成像（LDI）测量血流

注意：如先前所述⁷，通过测量血流以确认是否正确实现阻塞及再灌注。

1. 将麻醉后的小鼠俯卧于加热垫上，四肢伸展，足掌朝上，置于LDI下方26 cm处，加热垫表面应为非反射性材质。
2. 将小鼠置于激光扫描区域（16.1 cm × 16.1 cm）内进行图像采集。
   1. 调节激光扫描速度为4 ms/像素，通过点击record按钮，使用专用软件进行图像采集。分别在阻塞前、阻塞期间及再灌注期间点击record按钮获取图像。
      注意：所获图像为血流相关图谱，红色表示血流良好，蓝色表示无血流。需在图像中确认被阻塞的后肢呈蓝色；同样，在再灌注时应确认先前阻塞的后肢恢复为红色。LDI检测必须使用非反射性垫材，否则反射光会影响图像质量。
3. 使用配套软件定义感兴趣区域，并分析图像，计算缺血侧后肢与对照侧后肢的血流比值。

3. 缺血与再灌注方案

1. 将止血带结扎于麻醉小鼠的后肢，持续 3 小时。
   注意：收紧止血带可造成缺血，阻断血流。
2. 结扎 3 小时后松开止血带；再灌注并灌流后肢 15 或 30 分钟。

4. 组织采集

1. 将麻醉剂浓度提高至5%异氟烷，使小鼠深度麻醉。使用锋利的剪刀切开胸腔，造成气胸以确保动物死亡。取材腓肠肌和股四头肌^8,9,10。
2. 将收集的组织在液氮中速冻，并于-80 °C保存，以备后续分析。

5. 近红外光应用

注意：近红外光（NIR）用于降低炎症并减少再灌注损伤。

1. 在缺血期间，每小时使用一次670 nm近红外光（NIR），强度为100 mW，持续照射5分钟。
2. 将光纤光源对准后肢，光源与后肢之间的距离保持在2.5 cm。不要将对侧腿暴露于近红外光下（实验装置见图1）。
3. 在整个缺血期间，每小时照射近红外光5分钟。
4. 假手术组采用相同操作处理，但不收紧止血带，也不对后肢施加近红外光照射。
   ​注意：近红外光源配有散热装置，在5分钟光照时间内温度不会升高¹¹。

6. TTC 染色法检测坏死

注意：通过评估组织坏死情况，以观察肌肉组织中坏死程度的减轻。

1. 将新鲜的股四头肌置于37 °C条件下，在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中用1% TTC染色20–30分钟。
2. 根据甲臜沉淀物的存在情况观察染成红色的活体组织。
   注意：红色染色是由于健康组织中的脱氢酶酶将TTC还原所致。坏死组织不被染色¹⁰。
3. 拍摄TTC染色切片的图像用于分析，并通过定义感兴趣区域来测量坏死区域。

7. 氯酪氨酸的 Western 分析

1. 对小鼠实施缺血/再灌注实验方案（第3节）。
2. 采集组织（第4节），并按照先前描述的方法分离蛋白质¹²。采用Bradford法测定蛋白质浓度¹³。
3. 使用总蛋白裂解液进行电泳，并按照先前所述方法对3-氯酪氨酸进行印迹检测¹²。
4. 对腓肠肌裂解液进行Western blot分析。
   1. 向样品中加入含5%巯基乙醇的Laemmli上样缓冲液，使总蛋白浓度达到40 µL中含有25 µg。
   2. 在4–15% Tris-甘氨酸扩展胶（见材料表）上以50 mV电压电泳5分钟，随后将电压升至100 mV持续1小时，直至染料前沿跑出凝胶。
5. 将凝胶置于1×转移缓冲液（25 mM Tris，190 mM 甘氨酸，20% 甲醇；必要时调节pH至8.3）中孵育10分钟。
6. 组装转移三明治结构（海绵、滤纸、凝胶、纤维素膜、滤纸、海绵），在转移装置中放置可重复使用的冰袋。在4°C条件下以100 mA电流转移30分钟。
   ​注意：确保转移三明治结构中无气泡残留，印迹膜朝向阴极，凝胶朝向阳极。
7. 用含0.05% Tween的封闭缓冲液（见材料表）在室温下封闭印迹膜30分钟。加入一抗前，用含5% Tween的Tris缓冲盐水（TBS）洗涤印迹膜三次，每次5分钟。
8. 使用针对3-氯酪氨酸的多克隆一抗在4°C孵育过夜。将一抗用含0.05% Tween的封闭缓冲液按1:1,000比例稀释。
9. 以辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗小鼠IgG和HRP标记的抗山羊IgG（1:10,000稀释）作为二抗。
10. 使用增强型化学发光（ECL）试剂和成像系统检测印迹膜上的目标条带。
    1. 根据生产商说明书混合试剂组分，与印迹膜孵育3分钟，使ECL试剂与目标条带结合。
    2. 使用成像系统（见材料表）对印迹膜进行成像。使用ImageJ等图像分析软件测量条带密度，并将目标条带的密度值相对于对照条带进行归一化处理。

8. CXCL1 和 CXCL5 的 ELISA

1. 按照先前所述方法¹²从腓肠肌中分离总蛋白。
2. 采用ELISA方法检测CXCL1和CXCL5，评估炎症程度，操作步骤依据先前描述¹⁴并遵循试剂盒制造商的说明。

9. 免疫沉淀结合蛋白质印迹分析

1. 对小鼠实施缺血/再灌注实验方案（第3节）。
2. 采集组织（第4节），并按照先前所述方法分离蛋白¹²。采用Bradford法测定蛋白浓度¹³。
3. 为富集总蛋白裂解液中的巨噬细胞组分，参照先前方法进行CD14免疫沉淀¹⁵。
4. 利用CD14免疫沉淀产物进行电泳，并按照先前所述方法对CD206和CD68进行印迹检测¹²。
5. 按照第7节所述方法，对腓肠肌裂解液进行Western blot分析。
6. 将免疫沉淀物与CD206或CD68的多克隆一抗在4℃孵育过夜。用TBS将抗体稀释至1:200。
7. 以HRP标记的驴抗小鼠IgG和HRP标记的驴抗山羊IgG（1:10,000稀释）作为二抗。
8. 根据制造商说明书混合ECL试剂后将其加入印迹膜，孵育3分钟以显影目标条带。使用成像系统采集印迹图像。

10. 统计分析

1. 采用重复测量方差分析（ANOVA）对组内和组间数据进行统计学分析，随后进行Student t检验的Bonferroni校正，p ≤ 0.05。
2. 数据以均值 ± 均值标准误（SEM）或均值 ± 标准差（SD）表示。

结果

血流测量证实了缺血与再灌注
近红外光的放置位置及实验方案见图1。本研究建立并采用小鼠后肢缺血模型，以评估近红外光照射对骨骼肌缺血-再灌注损伤（IRI）的影响。正如预期，激光多普勒血流成像（图2A）证实，止血带可有效诱导缺血，并在近红外光处理组（n = 6）和未接受光照处理组（n = 6）的后肢中均观察到血流恢复至接近基线水平。热成像（图2A）还表明，LED阵列未引起肢体升温，提示所观察到的效应归因于近红外光本身，而非热效应。

近红外光治疗减少股四头肌梗死
通过 TTC 染色对骨骼肌组织进行大体组织学区分（图 3A）显示，与未接受近红外光照射的股四头肌（n = 3，图 3B）相比，接受近红外光治疗的股四头肌...

讨论

本文描述了最早专注于通过近红外光治疗改变后肢炎症反应以减轻再灌注损伤的研究之一。缺血-再灌注损伤和近红外光治疗并非完全新颖的概念。已有其他研究关注近红外光对缺血-再灌注损伤的作用。近红外光治疗已成功用于减少心肌梗死面积以及减轻缺血-再灌注损伤后的肾损伤。Quirk 等人报道了应用近红外光后心肌梗死面积减小，并减轻了缺血-再灌注损伤^16,17,18。

止血带的放置对于在损伤后止血，或在手术及紧急情况下（包括战场环境）建立无血区域具有重要意义¹⁹。长时间缺血后继而再灌注，会引发对再灌注损伤的担忧。

这些数据表明，以670 nm LED光照射形式进行的光疗可通过降低炎症反应，在止血带放置后使巨噬细胞从促炎表型转变为抗炎表型，从而减轻再灌注损伤。缺血再灌注后，炎症标志物氯酪氨酸的表达升高，提示组织损伤（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基四氮唑	Sigma Aldrich	17779-10X10ML-F	1% 溶液
4–15% Criterio TGX 无染蛋白凝胶	BioRad	#5678084	Tris-甘氨酸扩展凝胶
4x Laemmli 样品缓冲液 - 1610747	BioRad	16110747
670 nm 光源	NIR Technologies		定制
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher	23227
BioRad ChemiDoc	Bio-Rad		成像系统
Bio-Rad
β-巯基乙醇	BioRad	1610710
CXCL1 ELISA	R&D Systems	DY453-05
CXCL5 ELISA	R&D Systems	DX000
Forane	Baxter	1001936040	异氟烷吸入剂
山羊抗兔 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2004	1:10,000 稀释
Ice Accu 冰袋
激光多普勒成像仪	Moor	MOORLDI2-HIR
单克隆 CD14 抗体	Santa Cruz Biotechnologies	sc-515785	1:200 稀释
单克隆 CD206 抗体	Santa Cruz Biotechnologies	sc-58986	1:200 稀释
单克隆 CD68 抗体	Santa Cruz Biotechnologies	sc-20060	1:200 稀释
Pierce 蛋白酶免（TBS）封闭缓冲液			封闭缓冲液
多克隆氯化酪氨酸抗体	Hycult	HP5002	1:1,000 稀释
Protein A/G PLUS-琼脂糖	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2003
Super Signal West Femto	ThermoFisher	34095	增强型化学发光试剂