我们描述了在通过止血带建立的小鼠缺血再灌注模型中，670 nm 照射可减轻再灌注损伤。该 670 nm 照射可降低炎症反应，减少促炎型巨噬细胞数量，并增加保护性巨噬细胞数量。
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我们描述了在通过止血带建立的小鼠缺血再灌注模型中，670 nm 照射可减轻再灌注损伤。该 670 nm 照射可降低炎症反应，减少促炎型巨噬细胞数量，并增加保护性巨噬细胞数量。
由炎性过程引起的组织损伤和坏死是缺血再灌注损伤（IRI）的后果。在骨骼肌中，缺血会降低肌细胞的有氧能量产能能力，导致不利的生化改变和炎症反应。本研究的目的是证明在缺血期间暴露于近红外光（NIR）可通过减少坏死和炎症，同时减少促炎性M1型巨噬细胞并增加保护性M2型巨噬细胞，从而减轻IRI。C57/Bl6小鼠接受单侧止血带诱导的后肢缺血3小时，随后再灌注15分钟或30分钟。小鼠被随机分为3组。第1组经历IRI并进行30分钟再灌注。第2组经历IRI并进行15分钟再灌注。每组中50%为未接受NIR处理的小鼠，50%为接受NIR处理的小鼠，在止血带结扎后每小时接受5分钟、50 mW/cm2的照射。第3组为假手术动物，麻醉3小时但不实施IRI。
对所有小鼠进行激光多普勒血流成像以确认缺血与再灌注情况。血流数据表示为缺血肢体与对侧对照肢体的比值。再灌注后处死小鼠，取股四头肌和腓肠肌组织。对巨噬细胞标志物CD68（M1型）和CD206（M2型）进行免疫共沉淀和蛋白质印迹分析，并以CD14表达水平进行标准化。在缺血-再灌注损伤（IRI）组中，近红外光（NIR）显著降低了炎症标志物CXCL1和CXCL5的表达。在接受缺血-再灌注（IR）和近红外光（NIR）处理的动物中，观察到CD68表达显著减少，而CD206表达显著增加。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色可见，在IRI组中，近红外光（NIR）减少了组织坏死。研究结果表明，近红外光（NIR）暴露可减轻缺血-再灌注损伤（IRI），并改善组织存活。近红外光（NIR）减轻了炎症反应，减少了促炎性M1型巨噬细胞，并增加了保护性M2型巨噬细胞。近红外光（NIR）暴露减轻炎症并促进再生，从而在缺血后实现组织保护。
缺血再灌注损伤（IRI）是血管损伤及外科止血带长时间使用后常见的临床难题。既往研究表明，60-90 分钟是热缺血时间的上限，超过此时限可能导致不可逆的组织损伤。在所有单一影响因素中，热缺血时间的限制是影响无血供肢体再植成功与挽救效果的最主要因素1,2。
在骨骼肌中，缺血会降低细胞的有氧能力，导致急性炎症和不良的生化改变。再灌注会加剧这些效应，促进中性粒细胞的募集并产生活性氧自由基，进一步损伤骨骼肌。这种情况可能由血管阻塞引起，无论是因创伤所致，还是因有意使用止血带以防止出血所致。在此过程中的一些关键介质包括髓过氧化物酶（MPO），这是一种由中性粒细胞表达的酶，对呼吸爆发功能和自由基的产生至关重要3；以及趋化因子如CXCL1和CXCL5，它们可将中性粒细胞募集至急性炎症部位4。
为模拟紧急情况下使用开放式止血带，未对股动脉进行解剖分离。该方法还基于可重复地建立缺血与再灌注，以及稳定无血视野的需求。先前研究表明，在数天内对小鼠缺血后肢暴露于波长为670 nm的非热性近红外（NIR）光，可促进血管侧支形成，减轻缺血-再灌注损伤（IRI）的影响5。此外，已有研究证实，近红....
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本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获得机构动物护理与使用委员会的批准（方案编号：AUA#1517）。所有涉及小鼠的研究均符合美国公共卫生署（PHS）政策的要求。
1. 止血带的放置
注意：已放置止血带以诱导缺血并获得无血手术视野。
2. 通过激光多普勒成像（LDI）测量血流
注意：如先前所述7，通过测量血流以确认是否正确实现阻塞及再灌注。
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血流测量证实了缺血与再灌注
近红外光的放置位置及实验方案见图1。本研究建立并采用小鼠后肢缺血模型，以评估近红外光照射对骨骼肌缺血-再灌注损伤（IRI）的影响。正如预期，激光多普勒血流成像（图2A）证实，止血带可有效诱导缺血，并在近红外光处理组（n = 6）和未接受光照处理组（n = 6）的后肢中均观察到血流恢复至接近基线水平。热成像（图2A）还表明，LED阵列未引起肢体升温，提示所观察到的效应归因于近红外光本身，而非热效应。
近红外光治疗减少股四头肌梗死
通过 TTC 染色对骨骼肌组织进行大体组织学区分（图 3A）显示，与未接受近红外光照射的股四头肌（n = 3，图 3B）相比，接受近红外光治疗的股四头肌.......
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本文描述了最早专注于通过近红外光治疗改变后肢炎症反应以减轻再灌注损伤的研究之一。缺血-再灌注损伤和近红外光治疗并非完全新颖的概念。已有其他研究关注近红外光对缺血-再灌注损伤的作用。近红外光治疗已成功用于减少心肌梗死面积以及减轻缺血-再灌注损伤后的肾损伤。Quirk 等人报道了应用近红外光后心肌梗死面积减小，并减轻了缺血-再灌注损伤16,17,18。
止血带的放置对于在损伤后止血，或在手术及紧急情况下（包括战场环境）建立无血区域具有重要意义19。长时间缺血后继而再灌注，会引发对再灌注损伤的担忧。
这些数据表明，以670 nm LED光照射形式进行的光疗可通过降低炎症反应，在止血带放置后使巨噬细胞从促炎表型转变为抗炎表型，从而减轻再灌注损伤。缺血再灌注后，炎症标志物氯酪氨酸的表达升高，提示组织损伤（.......
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作者声明无任何利益冲突。
感谢骨科手术系为本研究提供的经费支持。同时感谢 Brian Lindemer 和 Grant Broeckel 提供的技术支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-三苯基四氮唑 | Sigma Aldrich | 17779-10X10ML-F | 1% 溶液 |
| 4–15% Criterio TGX 无染蛋白凝胶 | BioRad | #5678084 | Tris-甘氨酸扩展凝胶 |
| 4x Laemmli 样品缓冲液 - 1610747 | BioRad | 16110747 | |
| 670 nm 光源 | NIR Technologies | 定制 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| BioRad ChemiDoc | Bio-Rad | 成像系统 | |
| Bio-Rad | |||
| β-巯基乙醇 | BioRad | 1610710 | |
| CXCL1 ELISA | R&D Systems | DY453-05 | |
| CXCL5 ELISA | R&D Systems | DX000 | |
| Forane | Baxter | 1001936040 | 异氟烷吸入剂 |
| 山羊抗兔 IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2004 | 1:10,000 稀释 |
| Ice Accu 冰袋 | |||
| 激光多普勒成像仪 | Moor | MOORLDI2-HIR | |
| 单克隆 CD14 抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-515785 | 1:200 稀释 |
| 单克隆 CD206 抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-58986 | 1:200 稀释 |
| 单克隆 CD68 抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-20060 | 1:200 稀释 |
| Pierce 蛋白酶免（TBS）封闭缓冲液 | 封闭缓冲液 | ||
| 多克隆氯化酪氨酸抗体 | Hycult | HP5002 | 1:1,000 稀释 |
| Protein A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2003 | |
| Super Signal West Femto | ThermoFisher | 34095 | 增强型化学发光试剂 |
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