Ex Vivo 视网膜组织样本中线粒体呼吸和糖酵解的测定

摘要

本文介绍了一种详细的实验方案，用于开展线粒体应激检测和糖酵解速率检测 离体 使用商用生物分析仪检测视网膜组织样本。

摘要

线粒体呼吸是所有细胞中关键的能量生成途径，尤其是具有高度活跃代谢的视网膜感光细胞。此外，感光细胞还表现出类似癌细胞的高有氧糖酵解活性。精确测量这些代谢活动可为生理条件及疾病状态下细胞稳态提供有价值的见解。目前已开发出基于微孔板的高通量检测方法，用于测量活细胞中的线粒体呼吸及其他多种代谢活动。然而，这些方法绝大多数是针对培养细胞设计的，尚未针对完整组织样本及离体（ex vivo）应用进行优化。本文详细描述了一种基于微孔板荧光技术的分步操作方案，用于直接测量完整离体（ex vivo）视网膜组织中的氧消耗率（OCR），以评估线粒体呼吸活性，以及细胞外酸化率（ECAR），以反映糖酵解水平。该方法已成功应用于成年小鼠视网膜的代谢活性评估，并展示了其在研究衰老和疾病相关细胞机制中的应用价值。

引言

线粒体是一种关键细胞器，通过协调多种重要的生理过程来调控细胞代谢、信号传导、稳态和细胞凋亡¹。线粒体作为细胞的“能量工厂”，通过氧化磷酸化（OXPHOS）生成三磷酸腺苷（ATP），为几乎所有细胞活动提供能量。细胞中大部分氧气在线粒体中被代谢，在有氧呼吸过程中作为电子传递链（ETC）的最终电子受体。少量ATP也可通过细胞质中的糖酵解产生，其中葡萄糖被转化为丙酮酸，丙酮酸可进一步转化为乳酸，或被转运至线粒体内氧化为乙酰辅酶A，后者是三羧酸循环（TCA循环）的底物。

视网膜是哺乳动物中代谢最活跃的组织之一²，表现出高水平的线粒体呼吸作用和极高的耗氧量³。视杆细胞和视锥细胞含有高密度的线粒体⁴，而氧化磷酸化（OXPHOS）是视网膜中产生大部分ATP的途径⁵。此外，视网膜还高度依赖有氧糖酵解^6,7，将葡萄糖转化为乳酸⁵。线粒体缺陷与多种神经退行性疾病相关^8,9；由于视网膜....

方案

所有小鼠实验方案均获得国家眼科研究所动物护理与使用委员会（NEI ASP# 650）的批准。小鼠饲养于12小时光照-12小时黑暗循环环境中，并依据《实验动物护理与使用指南》、实验动物资源研究所以及公共卫生服务政策中关于实验动物人道护理与使用的相关规定进行管理和护理。

1. 水合传感器盒及测定培养基的制备

1. 实验前一天，在校准板的每个孔中加入 1 mL 校准液。将 Hydro-Booster 盖置于其上，并从盖上的开口处插入传感器盒。检查以确保传感器完全浸没在校准液中。将传感器盒在 37 ˚C、无 CO₂ 的培养箱中孵育过夜，以激活荧光探针。
   注意：为防止蒸发，可在培养箱内放置盛水托盘以保持湿度，同时用透明塑料膜包裹传感器盒卡匣。
2. 通过向 Seahorse DMEM 培养基中添加葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺至所需浓度，配制检测用培养基。本文所报道的实验中，检测培养基中各底物的终浓度分别为：6 mM 葡萄糖、0.12 mM 丙酮酸钠和 0.5 mM 谷氨酰胺。每块检测板所需的 40 mL 检测培养基均于实验当天新鲜配制。
3. 按照仪器制造商的说明，在分析仪中设置检测程序²⁶。本实验所展示的检测程序设置如下：先进行 5 个循环以测定基础值，然后注入 A 孔试剂，接着进行 4 个循环测量，随后注入 B 孔试剂，再进行 4 个循环测量。每个循环包括混合....

结果

本文报告的数据代表了使用4月龄转基因Nrl-L-EGFP小鼠（C57B/L6背景）³⁶新鲜分离的1 mm视网膜打孔组织进行的线粒体应激实验（显示OCR轨迹，图1）和糖酵解速率实验（显示OCR和ECAR轨迹，图2）。这些小鼠在视杆光感受器中特异性表达GFP，但不影响正常的视网膜发育、组织学结构和生理功能，已被广泛用作视网膜研究中的野生型对照。本实验中使用了两只Nrl-L-GFP同窝小鼠。在本实验方案中，Nrl-L-GFP小鼠表达的GFP不会干扰OCR和ECAR的检测结果。每只视网膜取5个打孔组织，共使用10个打孔组织进行线粒体应激实验，另10个用于糖酵解速率实验。实验中使用Seahorse XF DMEM培养基（pH 7.4，含6 mM葡萄糖、0.12 mM丙酮酸钠和0.5 mM谷氨酰胺）以及Seahorse XFe24胰岛捕获板。此处展示的代表性数据使用相同直径（1 mm）的打孔器获得，但未根据DNA/蛋白质含量进行归.......

讨论

本文提供了使用微孔板法检测线粒体呼吸和糖酵解活性的详细操作步骤 离体，新鲜解剖的视网膜打孔组织。该方案已优化以：1）确保使用合适的检测培养基 离体 视网膜组织；2）采用适当尺寸的视网膜打孔圆片，以获得处于仪器最佳检测范围内的OCR和ECAR读数；3）对网状插入物进行包被，以增强视网膜打孔组织的黏附性，确保测量周期中的稳定读数；4）使用每种注射药物化合物的最佳浓度；以及5）调整循环周期长度，以确保在每一步骤中线粒体状态达到平台期。所用试剂和实验方案已对先前发表的版本进行了修改²³ 以适应新一代 Seahorse XFe24 仪器，取代先前方案中使用的 Ames 缓冲液²³此处使用基础 Seahorse DMEM 培养基，通过分别添加葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸，可自定义燃料来源的组成。这也有助于开展多种实验，可在培养基中单独提供或去除特定的燃料底物。在本实验所展示的检测中，培养基中葡萄糖（6 mM）、谷氨酰胺（0.5 mM）和丙酮酸（0.12 mM）的浓度均与 Ames 缓冲液一致，该浓度已被证实适用于视网膜组织.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-脱氧葡萄糖（2-DG），500 mM 储存液	Sigma	D6134	溶于 Seahorse XF DMEM 培养基中，需提前配制
30 号针头	BD Precision Glide	305106
抗霉素 A（Antimycin A），10 mM 储存液	Sigma	A8674	溶于 DMSO，需提前配制
Bam15，10 mM 储存液	TimTec	ST056388	溶于 DMSO，需提前配制
活检打孔器，1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO₂ 窒息室
解剖镊 - Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	直头
解剖镊 - Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	弯头
解剖显微镜
DMSO	Sigma	D2438
Graefe 镊	Fine Science Tools	11051-10	弯头，带齿
显微剪刀	Fine Science Tools	15004-08	弯头
NaOH 溶液，1 M	Sigma-Aldrich	S8263	水溶液，需提前配制
鱼藤酮（Rotenone），10 mM 储存液	Sigma	R8875	溶于 DMSO，需提前配制
Seahorse 校准液	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM 丙酮酸	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM 培养基	Agilent	103575-100	pH 7.4，含 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 胰岛捕获通量试剂盒	Agilent	103518-100	包含传感器微板和胰岛捕获微孔板
Seahorse XFe24 细胞外通量分析仪	Agilent
碳酸氢钠溶液，0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	水溶液，需提前配制
超细睫毛刷	Ted Pella	113