成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

摘要

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的成像

摘要

线粒体 Ca²⁺ 在调控胞质 Ca 中起关键作用²⁺ 缓冲、能量代谢和细胞信号转导。线粒体钙超载²⁺ 有助于多种病理状况，包括神经系统疾病中的神经退行性变和凋亡性细胞死亡。本文介绍一种细胞类型特异且靶向线粒体的分子方法，用于线粒体Ca²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像 体外 和 体内我们构建了编码靶向线粒体的基因编码钙指示剂的DNA质粒²⁺ 指示剂（GECIs）GCaMP5G 或 GCaMP6s（GCaMP5G/6s），分别与星形胶质细胞特异性启动子 gfaABC1D、神经元特异性启动子 CaMKII 以及线粒体靶向序列（mito-）组合使用。对于 体外 线粒体 Ca²⁺ 成像前，将质粒转染至培养的星形胶质细胞和神经元中以表达 GCaMP5G/6s。对于 体内 线粒体 Ca²⁺ 成像，制备腺相关病毒载体（AAVs）并注射至小鼠脑内，以在星形胶质细胞和神经元的线粒体中表达GCaMP5G/6s。本方法为线粒体Ca²⁺成像提供了一种有效的手段²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的动力学研究细胞质与线粒体钙之间的关系²⁺ 信号传导以及星形胶质细胞-神经元相互作用。

引言

线粒体是动态的亚细胞器，被认为是细胞能量生成的“动力工厂”。另一方面，线粒体可在局部或胞质Ca²⁺浓度升高时将Ca²⁺摄取至基质中。线粒体Ca²⁺摄取影响线粒体功能，包括三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化等代谢过程，并在生理条件下调节Ca²⁺敏感蛋白^1,2,3,4。线粒体Ca²⁺超载也是多种脑部疾病中细胞死亡（包括坏死和凋亡）的决定因素^5,6,7。它可导致线粒体通透性转换孔（mPTP）开放以及半胱天冬酶（caspase）辅因子的释放，从而启动凋亡性细胞死亡。因此，研究活细胞中线粒体Ca²⁺的动态变化及其调控机制，对于深入理解细胞生理与病理过程具有重要意义。

线粒体维持基质 Ca²⁺ 通过Ca的平衡维持稳态²⁺ 摄取与外排。线粒体 Ca²⁺ 摄取主要由线粒体 Ca²⁺ uniporters（MCUs），而线粒体Ca²⁺ 外排由 Na 介导⁺-钙²⁺-李⁺ 交换体（NCLXs）和 H⁺/Ca²⁺ 交换体（mHCXs）⁸. 可通过激活G蛋白偶联受体（GPCRs）来扰乱该平衡⁹. 线粒体 Ca²⁺ 稳态也受到线粒体缓冲的影响，通过形成不溶性xCa实现²⁺-xPO₄x-xOH 复合物⁸.

细胞内及线粒体中的钙变化²⁺ 浓度（[Ca²⁺]) 可通过荧光或生物发光 Ca²⁺ 指示剂。Ca²⁺ 与指示剂结合会引起光谱变化，从而能够记录游离细胞内[Ca²⁺]在活细胞中的实时变化。目前有两种类型的探针可用于监测Ca²⁺ 细胞变化：有机化学指示剂与基因编码的钙指示剂²⁺ 指示剂（GECIs）。通常，具有不同钙²⁺ 亲和力（基于 K）_d）、光谱特性（激发和发射波长）、动态范围和灵敏度，以满足不同生物学问题的研究需求。尽管已有多种合成有机钙²⁺ 细胞质Ca²⁺检测已使用过多种指示剂²⁺ 成像，只有少数探针可被选择性地导入线粒体基质以实现线粒体Ca²⁺ 成像，其中Rhod-2应用最为广泛（综述见^10,11）。然而，Rhod-2 在长时间实验过程中存在明显的泄漏问题；此外，它会在线粒体、其他细胞器及细胞质之间分布，导致难以对不同亚细胞区室进行绝对定量测量。相比之下，通过使用细胞类型特异性启动子和亚细胞区室靶向序列，GECIs 可在不同细胞类型和亚细胞区室中表达，从而实现细胞特异性和区室特异性的 Ca²⁺ 成像 体外 或 体内基于单波长荧光强度的 GCaMP Ca²⁺ 指示剂最近已成为主要的GECIs^{12,13,14,15,16}本文提供了一种在星形胶质细胞和神经元中实现线粒体靶向及细胞类型特异性表达GCaMP5G和GCaMP6s（GCaMP5G/6s）并进行线粒体钙成像的实验方案²⁺ 这些细胞类型的摄取。通过本方案，可揭示GCaMP6G/6s在单个线粒体中的表达，以及Ca²⁺ 在单个线粒体分辨率下，可实现星形胶质细胞和神经元中的摄取检测 体外 和 体内.

方案

涉及动物的实验程序已获得密苏里大学哥伦比亚分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. DNA 质粒的构建

注意：对于 体外 和 体内 成像，构建了编码GCaMP5G/6s的DNA质粒，该质粒含有星形胶质细胞和神经元特异性启动子以及线粒体靶向序列。

1. 插入线粒体基质（MM）靶向序列（mito-）ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ 到腺相关病毒（AAV）质粒 pZac2.1 骨架中的克隆位点 EcoRI 和 BamHI，以获得包含星形胶质细胞 gfaABC 的质粒₁D启动子或神经元CaMKII启动子^18,19,20.
2. 将 GCaMP5G/6s 亚克隆至上述质粒的 BamH I 和 Not I 克隆位点，获得新的质粒 pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s 和 pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s，用于在星形胶质细胞和神经元的线粒体中靶向表达转基因^20,21 (图1A).
3. 制备用于转染的 pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G 和 pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA 质粒 体外 研究（第2节）。为星形胶质细胞产生血清型5的AAV载体，为神经元产生血清型9的AAV载体 体内 研究¹⁸ （第3节）

2. 体外 线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像

1. 从出生后第1天（P1）新生小鼠的皮层制备原代星形胶质细胞，从胚胎期15-16天（E15-16）小鼠胚胎的皮层制备原代神经元^18,22,23,24，分别使用含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）和含2% B27的神经元基础培养基（NBM），在24孔板中直径为12 mm的玻璃盖玻片上进行培养。
2. 使用脂质体转染试剂将 pZac-gfaABC1D-GCaMP6s 和 pZac-CaMKII-GCaMP5G 质粒转染至成熟星形胶质细胞和神经元中，以在星形胶质细胞的线粒体中表达 GCaMP6s，在神经元的线粒体中表达 GCaMP5G^18,20,21每孔细胞转染0.5 µg DNA，6小时后更换培养基。
   注意：转染后1-2天，星形胶质细胞和神经元即可用于成像。
3. 执行 体外 线粒体 Ca²⁺ 转染后1-2天进行成像。
   1. 将培养有星形胶质细胞或神经元的玻璃盖玻片转移至落射荧光显微镜或双光子显微镜下的PH-1灌流腔中。
   2. 刺激星形胶质细胞线粒体 Ca²⁺ 在ACSF中加入100 μM ATP进行摄取，或用100 μM谷氨酸/10 μM甘氨酸刺激神经元线粒体^20,25 (图2 和 图3).
      注意：溶液由ACSF更换为含ATP及谷氨酸/甘氨酸的ACSF，由ALA-VM8灌注系统控制²¹通过调节阀门将溶液更换速度控制在1-2 mL/min。

3. 体内 线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像

1. AAV 制备物
   1. 使用第1部分制备的DNA质粒，制备以下重组腺相关病毒（rAAV）载体：rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G 和 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 载体。
      注意：本实验中，使用5型重组腺相关病毒（rAAV）载体在星形胶质细胞的线粒体中表达GCaMP5G，使用9型重组腺相关病毒（rAAV）载体在神经元的线粒体中表达GCaMP6s。
2. 立体定位 AAV 注射。
   1. 用3%异氟烷麻醉小鼠。
      注意：手术后期，异氟烷浓度将降低至2%。
   2. 当小鼠通过尾部和脚趾夹捏测试确认达到手术麻醉水平后，使用毛发修剪器剃除手术区域（运动皮层或体感皮层）上方的毛发。
   3. 将小鼠置于立体定位仪上，并用耳杆固定头部。在小鼠眼睛上涂抹眼膏以保护其在手术期间免受损伤。使用加热垫维持小鼠体温在 37 °C。
      注意：手术操作需采用无菌技术。所有手术器械必须通过高压灭菌或干热灭菌珠灭菌器进行灭菌。
   4. 将小鼠固定于立体定位仪后，使用碘伏溶液与70%乙醇交替对头皮进行三次消毒。沿头皮正中线做切口，暴露注射部位。
   5. 沿颅骨的前囟-人字缝轴切开皮肤，使用高速钻头在目标注射位点（运动皮层或体感皮层）处钻出一个直径约1 mm的钻孔。
   6. 使用装有腺相关病毒（rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G 载体 [1 x 10¹¹ GC] 或 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 载体 [1 x 10¹¹ GC]) 在目标区域注射最多1 µL病毒。
      注意：例如，进行皮层病毒递送时，需在多个步骤中于两个深度注射病毒溶液。首先，将针头插入至硬脑膜下1 mm深度 静置5分钟，使大脑恢复。然后将针头上移至约700 µm深度，使用由微注射泵控制器调控的汉密尔顿注射器，以10 nL/s的注射速度注入500 nL病毒溶液。注射完成后，静置5分钟，使病毒扩散至脑组织。随后将针头上移至第二个注射位点，深度为300 µm，再次注入500 nL病毒溶液。静置10分钟，使病毒充分扩散至脑组织。
   7. 使用组织粘合剂闭合头皮和皮肤。将小鼠置于加热垫上恢复。待小鼠恢复后，送回动物房。
3. 颅窗安装与 体内 线粒体钙的双光子（2-P）成像²⁺ 信号。
   注意：在向运动皮层或体感皮层注射 AAV 后 3 周进行颅窗植入手术^26,27,28,29注射卡洛芬（10 mg/kg） 皮下注射以在手术前缓解潜在疼痛。颅窗手术步骤与AAV注射手术步骤相同，均在无菌条件下进行。
   1. 用3%异氟烷麻醉小鼠。
      注意：此为初始剂量，后续手术时应降至2%。成像过程中，采用腹腔注射（IP）给药，剂量为130 mg/kg体重的氯胺酮与10 mg/kg体重的赛拉嗪，溶于ACSF中用于麻醉。
   2. 将小鼠置于立体定位仪上，用耳杆固定头部。在眼睛上涂抹眼用软膏。使用加热垫在整个手术过程中维持小鼠体温在37 °C。
      注意：所有手术器械均需灭菌。
   3. 在头皮中线处做一个5-8 mm长的切口，用剪刀剪除一块皮瓣。
   4. 暴露颅骨后，在病毒注射区域（即运动皮层或体感皮层）使用高速钻进行直径为2.0-3.0 mm的颅骨开孔， 图1B首先制作四个小孔，然后沿连接这些孔的圆形轨迹进行钻孔。接着用锋利的剪刀抬起并移除骨片。暴露的硬脑膜可选择去除或保持完整，以便植入颅窗。
   5. 将直径为3-5 mm、带有透明硅胶的玻璃盖玻片置于颅骨开窗处，用牙签轻轻将颅窗压至脑表面，随后用少量硅胶粘合剂密封边缘。
      注：也可使用1.2%低熔点琼脂糖凝胶替代硅胶圆盘，置于盖玻片与脑组织之间。
   6. 最后，用牙科水泥密封盖玻片边缘。涂抹水泥时应略微延伸至颅窗边缘，以确保牢固粘合。使用牙科水泥将定制的金属头板固定在颅骨上。
      注意：金属板用于在成像过程中将小鼠头部固定在双光子显微镜的载物台上（图1C).
   7. 在成像过程中，向颅窗盖玻片上添加0.5 mL ACSF溶液，用于浸水成像。
   8. 进行延时拍摄 在体 通过颅窗使用910 nm波长对星形胶质细胞中的mito-GCaMP5G和神经元中的mito-GCaMP6s进行双光子成像（图1C)^18,20,27.
      注意：成像过程中，小鼠置于加热垫上以维持生理温度。成像结束后立即处死小鼠。
   9. 标记星形胶质细胞 体内 必要时使用磺酰罗丹明101（SR101）以确定共定位。
      1. 在步骤3.3.4结束时，将100 µL浓度为100 µM的SR101溶液施加于皮层表面，在ACSF中孵育1–5分钟。
      2. 用ACSF冲洗表面以去除未结合的SR101。使用双光子成像，可在45–60分钟后观察到星形胶质细胞中mito-GCaMP5G与SR101的共标记图4A).

结果

本研究的目的是提供一种用于成像线粒体 Ca²⁺ 使用GECI在星形胶质细胞和神经元中检测信号 体外 和 体内. 两种结果 体外 和 体内 线粒体 Ca²⁺ 成像结果在此展示。

体外培养的星形胶质细胞和神经元中的线粒体 Ca²⁺ 信号转导
通过灌流系统施加 ATP 可诱导星形胶质细胞中的线粒体 Ca²⁺ 摄取，而施加谷氨酸和甘氨酸可诱导神经元中的线粒体 Ca²⁺ 摄取。图 2 和 图 3 分别显示 GCaMP6s 在培养的星形胶质细胞中表达，GCaMP5G 在神经元中表达。星形胶质细胞中的线粒体 Ca²⁺ ...

讨论

本文提供了一种用于成像线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的信号。我们采用线粒体靶向和细胞类型特异性策略来表达GECI GCaMP5G/6s。为将GCaMP5G/6s靶向至线粒体，我们在质粒中引入了线粒体靶向序列。为在星形胶质细胞和神经元中表达GCaMP5G/6s 体内，我们在质粒中插入了星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D和神经元特异性启动子CaMKII。通过SR101对星形胶质细胞进行标记以及使用NeuN对神经元进行免疫染色，可验证GCaMP5G/6s在星形胶质细胞和神经元中的细胞类型特异性表达。根据我们的数据，这些策略为线粒体Ca²⁺²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像 体内.

GECI表达的一个潜在问题是可能引起Ca²⁺缓冲效应，因为其可通过结合Ca²⁺降低游离Ca²⁺浓度。另一个需要注意的问题是病毒注射量。若注射过量病毒，可能无法识别出单个表达GECI的细胞。这些问题可通过降低AAV滴度来有效缓解。光漂白也可能是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工泪液软膏	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% 白凡士林
氰基丙烯酸酯胶水	World Precision Instruments		3M Vetbond 粘合剂
解剖体视显微镜	Nikon	SMZ 2B	用于手术
精细尖杜蒙特镊子	Fine Science Tools	11255-20	用于去除硬脑膜
玻璃盖玻片，厚度 0.13–0.17 mm	Fisher Scientific	12-542A	用于颅窗覆盖
高速微型钻机	Fine Science Tools	18000-17	配备骨抛光钻头
注射器	Hamilton	2.5 ml	用于病毒注射
氯胺酮	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg 体重
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9793	减少运动伪影
金属框架	定制	见图1	用于将脑组织固定于显微镜载物台
微量注射泵控制器	World Precision Instruments	UMP3	注射速度控制器
小鼠立体定位仪	Stoelting	51725	用于固定小鼠
灌流室	Warner Instruments	64-0284
灌流系统	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
自调节加热垫	Fine Science Tools	21061	防止小鼠体温过低
磺酰罗丹明101	Invitrogen	S-359	标记星形胶质细胞的红色荧光染料
手术剪，12 cm	Fine Science Tools	14002-12	用于解剖
环钻	Fine Science Tools	18004-23	用于清除组织材料
赛拉嗪	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg 体重