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左旋多巴诱导的运动障碍的啮齿动物模型是确定治疗干预措施的宝贵工具，以减轻发展或减轻由于反复施用左旋多巴而出现的表现.该协议演示了如何在帕金森病的单侧6-OHDA病变大鼠模型中诱导和分析运动障碍样运动。
左旋多巴诱导的运动障碍 （LID） 是指帕金森病患者长期服用左旋多巴引起的运动并发症 （PD）.在临床上观察到的最常见的模式是峰值剂量运动障碍，包括舞蹈样、肌张力障碍和弹道运动的临床表现。PD的6-羟基多巴胺（6-OHDA）大鼠模型模仿了LIDS的几个特征。重复左旋多巴给药后， 6-OHDA 病变的大鼠表现出运动障碍样运动 （例如， 异常不自主运动， AIMs）.该协议展示了如何在黑质纹状体途径中具有90%-95%多巴胺能消耗的6-OHDA病变大鼠中诱导和分析AIM。重复给药（3周）左旋多巴（5毫克/千克，与12.5毫克/千克苄丝肼联合）可诱导AIM的发展。时程分析显示 30-90 分钟时 AIM 显着增加（峰值剂量运动障碍）。LID的啮齿动物模型是确定有效抗运动障碍干预措施的重要临床前工具。
多巴胺前体L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）是帕金森病（PD）运动症状最有效的治疗方法1。左旋多巴治疗可能会改善与帕金森病相关的运动症状，但随着时间的推移会失去效果.运动波动，如"磨损波动"或"剂量结束恶化"在临床上表现为单次 l-DOPA 剂量的作用持续时间缩短2.在其他情况下，临床表现包括缓慢扭转运动和异常姿势（肌张力障碍）3 ，并在多巴胺水平低时发生（非经期肌张力障碍）4。另一方面， 左旋多巴诱导的运动障碍 （LID） 当血浆和大脑中的多巴胺水平高时出现5.
LID 会产生使人衰弱的副作用，包括舞蹈样、肌张力障碍和弹道6 运动等运动并发症。一旦建立， LID 发生在每次 l-DOPA 给药后.40%-50%接受左旋多巴治疗的PD患者发生运动并发症5年，发病率随年增加7。虽然PD患者LIDs发展的病理生理机制尚未完全阐明，但多巴胺能去神经支配的程度，脉动性L-DOPA给药，纹状体蛋白和基因的下游变化以及非多巴胺递质系统的异常是导致这些不良副作用发展的因素6，8，9，10。
神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）是研究啮齿动物PD的良好表征工具11，12，13，14。由于6-OHDA不穿过血脑屏障，因此必须直接注射到黑质纹状体通路中。6-OHDA诱导的多巴胺能耗竭是浓度和位点依赖性的15。在内侧前脑束（MFB）单侧施用6-OHDA可在啮齿动物中产生严重的（>90%）黑质纹状体损伤16，17，18，19。长期给予左旋多巴对严重的单侧 6-OHDA 病变啮齿动物会导致出现运动障碍样运动，称为异常不自主运动 （AIM）.啮齿动物的运动障碍样运动具有与PD患者LID相关的相似分子，功能和药理学机制5。因此，6-OHDA病变的大鼠20和小鼠21是研究LID的有价值的临床前模型。当用治疗剂量的左旋多巴（5-20mg / kg）长期治疗（7-21天）时，单侧6-OHDA病变的大鼠和小鼠显示出影响前肢，躯干和对侧病变的口面部肌肉的AIM的逐渐发展17，18，19，20，22，23，24.这些运动在类似于 PD 患者中左旋多巴诱导的峰值剂量运动障碍的时间过程呈现25，其特征是运动过度和肌张力障碍5.AIM通常根据其严重程度（例如，当存在特定AIM时）和振幅（例如，以每个运动的振幅为特征）进行评分5，23，25。
6-OHDA病变的LID啮齿动物模型呈现面部有效性（即，该模型具有几个看起来像人类状况的特征）5，11，26，27，28。啮齿动物AIM与PD患者发生的情况类似，被视为运动过度（前肢和口舌）和肌张力障碍（轴向）运动29，并类似于峰值剂量运动障碍。在分子和功能水平上，啮齿动物模型与PD患者5具有许多病理特征，例如FosB / ΔFosB19，26，30，31，32，33和血清素转运蛋白（SERT）的上调34，35.关于预测有效性，降低PD患者LID的药物（例如，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂金刚烷胺）在啮齿动物模型中具有抗运动失调功效22，36，37，38，39。
啮齿动物 AIM 评定量表基于四种 AIM 亚型创建，包括影响头部、颈部和躯干的 AIM（轴向 AIM）、多动性前肢运动（肢体 AIM）和运动障碍样口语运动（口语 AIM）。尽管对侧旋转（机车AIMs）也存在于单侧病变的啮齿动物20，22，23，25，40中，但它尚未被评分为运动障碍样运动，因为它可能不代表LIDs的特定测量22，37，41。
在这里，我们将描述如何在PD的严重（>90%）单侧6-OHDA病变大鼠模型中诱导和分析运动障碍样运动（轴向，肢体和口舌AIM）。我们根据以前的文献和实验室专业知识组织了我们的方案。
所有实验均按照里贝朗·普雷图哲学、科学和文学学院伦理委员会（CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5）进行。
1. 6-OHDA病变
2. 左旋多巴慢性治疗
3. 目标记录和评分
| 亚 |
| 轴向:头部、颈部和躯干扭转 |
| 肢体:远端和近端前肢的不自主运动 |
| 口语:口面部肌肉的不自主运动 |
| 严厉 |
| 0:缺席 |
| 1:偶尔（有中断，在不到一半的观察时间内出现） |
| 2:频繁（有中断，但超过一半的观察时间存在） |
| 3:连续但被外部感官刺激打断 |
| 4:连续且不受外界感官刺激干扰 |
| 波幅 |
| 轴的 |
| 1:头部和颈部扭转约30°角 |
| 2:头部和颈部扭转约30°<角度≤60° |
| 3:头部、颈部和上躯干扭转约60°<角度≤90° |
| 4:头部、颈部和躯干>90°角扭转，常导致大鼠失去平衡 |
| 肢体 |
| 1:远端前肢的小不自主运动 |
| 2:低振幅运动导致前肢远端和近端易位 |
| 3:整个肢体的不自主运动，包括肩部肌肉 |
| 4:强力的肢体和肩部运动，通常类似于弹道 |
| 奥罗语 |
| 1:口面部肌肉的小不自主运动 |
| 2:高振幅的口面部运动伴舌头突出 |
表1:AIMS的定义和评级标准。
图 1:显示每个 AIM 亚型的照片序列。 （A 到 A'"）轴向 AIM 显示不同角度的肌张力障碍样运动（A:30° 角，A':30° <角≤ 60°，A":60° <角≤ 90°，A'":> 90° 角）。（B 至 B"）肢体AIM（黑色箭头）显示远端（B和B'）和整个前肢（包括肩膀，B"）的不自主运动。（C）高振幅的舌头AIM（红色箭头）伴舌头突出。 请点击此处查看此图的大图。
4. 数据分析
尽管与在人类和非人灵长类动物中观察到的AIMs模式相比，在大鼠中观察到的AIMs模式更简单且有限，但该模型再现了由慢性左旋多巴给药引起的运动过度和肌张力障碍样运动。在这里，我们展示了从一组（n = 10）单侧6-OHDA病变大鼠收集的数据，这些大鼠长期用左旋多巴（5mg / kg组合12.5mg / kg苄丝肼）长期治疗3周（周一至周五）。请注意，图 2、图 3 和图 4 中显示的数据来自同一只动物。
图 2 显示了在 3 周的慢性左旋多巴给药中应用于轴向、肢体和口舌 AIM 评分的时间过程分析.在此分析中，特定观察期的每个 AIM 评分亚型报告为严重程度和振幅评分的乘法。这种类型的分析可以方便地探索干扰AIMs时间分布的药物的作用.请注意，左旋多巴诱导的峰值剂量运动障碍发生在30-90分钟之间，注射后120分钟后逐渐减少（图2）。
图 2:时程分析显示 6-OHDA 病变大鼠在 3 周的慢性 L-DOPA 给药（5 mg/kg 组合 12.5 mg/kg 苄丝肼）中 轴向、肢体和口舌 AIM。 （A） 轴向、（B） 肢体和 （C） 口舌 AIM 在 3 周的慢性左旋多巴给药中在周三、周四和周五进行评分。每个AIM亚型报告为六个观察期中每个观察期的严重程度乘以幅度的乘法。每个AIM亚型都可以单独分析或总结，如（D）所示。请注意， 目标的峰值严重程度将在慢性左旋多巴给药的第一周逐渐增加.数据表示为平均± SEM （n = 10）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3 显示了图 2 中描述的所有六个观察期的 AIM 分数总和（数据集采用颜色编码以便于比较）。该分析表明每只动物在慢性左旋多巴给药 3 周内每个评分日（周三、周四和周五）的最高分.这种类型的分析有利于探索具有潜在抗运动障碍特征的化合物的作用， 特别是因为 AIMs 评分在慢性 L-DOPA 给药的第 2 周和第 3 周是稳定的.此外，每周AIMs评分（图4）可以从周三，周四和周五归因于6-OHDA病变大鼠的评分总和中产生。
图 3:在慢性 L-DOPA 给药 3 周（5 mg/kg 结合 12.5 mg/kg 苄丝肼）对 6-OHDA 病变大鼠的个体评分日中轴向、肢体和口舌 AIM 的总和。在此图中，对六个观察期中每个观察期的AIMs分数求和（详见图2图例）。对单个数据集进行颜色编码，以与图2中显示的数据进行比较。该分析表明每只动物在慢性左旋多巴给药 3 周后每个评分日（周三 - W、周四 - T 和周五 - F）的最高分.（A）轴向，（B）肢体和（C）口舌AIM。（D） 轴向、肢体和口舌目标的总和。单向重复测量方差分析和Holm-Sidak事后测试显示，AIMs在长期给予左旋多巴时逐渐增加。请注意，AIMs 评分在慢性左旋多巴给药的第 2 周和第 3 周保持稳定（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 与第 1 周的星期三 （W） 相比）。 数据表示为平均± SEM （n = 10）。请点击此处查看此图的大图。
图 4:整个慢性 L-DOPA 给药（5 mg/kg 组合与 12.5 mg/kg 苄丝肼组合）至 6-OHDA 病变大鼠的每周轴向、肢体和口舌 AIM 的总和。 在此图中，每周（周三、周四和周五 - 见 图 3）的 AIM 得分相加。该分析表明每只动物在慢性左旋多巴给药的每一周的最高分.（A）轴向，（B）肢体和（C）口舌AIM。（D） 轴向、肢体和口舌目标的总和。单因素重复测量方差分析和Holm-Sidak事后测试显示，AIMs在长期给予左旋多巴时增加（*p < 0.05与第1周相比）。数据表示为平均± SEM （n = 10）。 请点击此处查看此图的大图。
作者没有利益冲突。
左旋多巴诱导的运动障碍的啮齿动物模型是确定治疗干预措施的宝贵工具，以减轻发展或减轻由于反复施用左旋多巴而出现的表现.该协议演示了如何在帕金森病的单侧6-OHDA病变大鼠模型中诱导和分析运动障碍样运动。
这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，赠款2017/00003-0）的支持。我们感谢高等教育人员改进协调会（CAPES）。我们感谢Anthony R. West博士，Heinz Steiner博士和Kuei Y. Tseng博士的支持和指导。
| 6-羟基多巴胺氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich， USA | H6507 | 产生儿茶酚胺能末端变性的神经毒素 |
| 盐酸苄氮肼 | Sigma | B7283 | 外周多巴脱羧酶抑制剂 |
| 相机子弹红外涡轮高清 （HD-TVI） 2.8mm B | 海康威视 | DS-2CE16C0T-IRP | 用于记录所有行为的相机 |
| 丙咪嗪hidrochloride | Alfa Aesar | J63723 | 去甲肾上腺素转运蛋白抑制剂 （NET） 用于保护去甲肾上腺素能神经元免受 6-OHDA |
| 氯胺酮盐 | 酸盐Ceva Animal Health | 用于手术干预的麻醉 | |
| L-3,4-二羟基苯丙氨酸 （L-DOPA） 甲酯（盐酸盐） | 开曼化学公司 | 16149 | 多巴胺前体 |
| 镜子 | 用于观察动物在实验过程中各个方向的行为 | ||
| 针头 0.30 x 13 毫米 | 用于注射药物 | 的PrecisionGlide | 针 |
| 头 氯化钠 （NaCl） | Samtec | 盐 | |
| 注射器 1 ml 无菌 | BD Plastipak | 注射器 用于注射药物 | |
| 的注射器 透明圆筒 | 用于记录实验期间动物的行为 | ||
| 盐酸甲苯噻嗪 | Ceva Animal Health | 用于手术干预的镇静剂、镇痛剂和肌肉松弛剂 |
