评估帕金森病单侧6-OHDA损毁大鼠模型中L-DOPA诱导的运动障碍

摘要

L-多巴诱导的运动障碍啮齿类动物模型是识别治疗干预措施以减轻或缓解因反复给予L-多巴而引发的运动障碍发生与表现的宝贵工具。本方案展示了如何在单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病大鼠模型中诱导并分析类似运动障碍的动作。

摘要

左旋多巴诱导的运动障碍（LIDs）是指帕金森病（PD）患者长期使用左旋多巴治疗后出现的运动并发症。临床上最常见的类型是峰剂量运动障碍，其临床表现为舞蹈样动作、肌张力障碍和投掷样运动。6-羟基多巴胺（6-OHDA）大鼠帕金森病模型可模拟LIDs的多种特征。在反复给予左旋多巴后，6-OHDA损毁的大鼠会出现类似运动障碍的动作（例如异常不自主运动，AIMs）。本方案展示了如何在黑质纹状体通路多巴胺能神经元损耗达90%-95%的6-OHDA损毁大鼠中诱导并分析AIMs。通过重复给药（持续3周）左旋多巴（5 mg/kg，联合12.5 mg/kg的苄丝肼），可成功诱导AIMs的产生。时间进程分析显示，AIMs在给药后30-90分钟显著增加（峰剂量运动障碍）。LIDs的啮齿类动物模型是识别有效抗运动障碍干预措施的重要临床前工具。

引言

多巴胺前体L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）是治疗帕金森病（PD）运动症状最有效的疗法¹。L-DOPA治疗可改善与PD相关的运动症状，但其疗效会随着时间推移而下降。诸如"疗效减退波动"或"剂末恶化"等运动波动在临床上表现为单次L-DOPA剂量作用持续时间缩短²。在其他情况下，临床表现包括缓慢的扭动运动和异常姿势（肌张力障碍）³，且常在多巴胺水平较低时出现（关期肌张力障碍）⁴。另一方面，当血浆和脑内多巴胺水平较高时，则会出现L-DOPA诱导的异动症（LIDs）⁵。

左旋多巴诱导的运动障碍（LIDs）会产生严重的副作用，包括舞蹈样、肌张力障碍和投掷样⁶等运动并发症。一旦出现，每次使用左旋多巴（L-DOPA）后均会诱发LIDs。在接受左旋多巴治疗5年的帕金森病（PD）患者中，有40%–50%会出现运动并发症，且其发生率随治疗时间延长而上升⁷。尽管帕金森病患者发生LIDs的病理生理机制尚未完全阐明，但多巴胺能神经支配丧失的程度、左旋多巴的脉冲式给药、纹状体蛋白和基因的下游改变，以及非多巴胺神经递质系统的异常，均是导....

方案

所有实验均遵循里贝朗普雷图哲学、科学与文学系伦理委员会（CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5）的规定进行。

1. 6-羟基多巴胺损毁

1. 使用6周龄、实验开始时体重为200–250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。将动物饲养在标准实验室条件下（每笼2–3只，12:12小时明暗循环，光照开启时间为06:00，温度控制在22–24 °C），提供食物和水 随意摄取.
   注意：有关如何制备重度6-OHDA损毁大鼠的完整描述见其他文献⁴².
2. 在开始任何实验操作之前，应适当使动物适应环境。
3. 手术前30分钟，腹腔注射去甲肾上腺素转运体抑制剂丙米嗪（20 mg/kg，溶于0.9%生理盐水中）。
   注意：丙米嗪的给药将增强6-羟基多巴胺对多巴胺能神经元的选择性。
4. 腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（70/10 mg/kg）。
5. 确保动物因对脚趾夹捏无反应而处于深度麻醉状态，并将其俯卧位固定于立体定位仪中，置于加热垫上方。
6. 去除头部毛发，并使用碘伏和酒精交替消毒....

结果

尽管在大鼠中观察到的异常不自主运动（AIMs）模式相较于人类和非人灵长类动物更为简单且有限，但该模型能够重现由长期左旋多巴（L-DOPA）给药所诱导的运动过多和类肌张力障碍样运动。本文展示了来自一组（n = 10）单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁大鼠的数据，这些大鼠在3周内（周一至周五）长期接受L-DOPA（5 mg/kg，联合12.5 mg/kg苄丝肼）治疗。请注意，本文所展示的数据来自 图2, 图3，以及 图4 来自同一批动物。

图2展示了在连续3周左旋多巴（L-DOPA）慢性给药期间，对轴性、肢体性和口面性异常不自主运动（AIMs）评分的时间过程分析。在此分析中，每个特定观察时段的AIM评分亚型均以严重程度评分与幅度评分的乘积表示。此类分析有助于探讨干预AIMs时间特征的药物效应。需要注意的是，左旋多.......

讨论

本方案展示了如何在通过内侧前脑束（MFB）单侧微量注射6-OHDA诱导的帕金森病（PD）大鼠模型中诱导并分析异常不自主运动（AIMs）。连续每日给予低剂量左旋多巴（L-DOPA，5 mg/kg，联合12.5 mg/kg的苄丝肼）治疗3周后，AIMs逐渐形成。时间进程分析显示AIMs显著增加，且在给予L-DOPA后30至90分钟之间出现峰值剂量的运动障碍。AIMs表现为影响躯干、肢体和口面部肌肉的重复性且无目的的运动。本方案及所展示的数据与既往文献结果一致^{22,23,49,50,51}。

轴向、肢体和口面运动障碍（AIMs）评分量表非常敏感，因为它评估了啮齿类动物出现类似运动障碍样动作的时间长短（即严重程度），并指示这些动作的幅度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-羟基多巴胺氢溴化物	Sigma-Aldrich, USA	H6507	可导致儿茶酚胺能神经末梢退变的神经毒素
苯丝肼盐酸盐	Sigma	B7283	外周多巴脱羧酶抑制剂
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B	HIKVISION	DS-2CE16C0T-IRP	用于记录所有行为的摄像机
丙咪嗪盐酸盐	Alfa Aesar	J63723	去甲肾上腺素转运体抑制剂（NET），用于保护去甲肾上腺素能神经元免受6-OHDA损伤
氯胺酮盐酸盐	Ceva Animal Health		用于手术干预的麻醉剂
L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）甲酯（盐酸盐）	Cayman Chemical Company	16149	多巴胺前体
镜子			用于在实验过程中从各个方向观察动物行为
0.30 x 13 mm 针头	PrecisionGlide		用于注射药物的针头
氯化钠（NaCl）	Samtec		食盐
1 ml 无菌注射器	BD Plastipak		用于注射药物的注射器
透明圆筒			用于在实验期间记录动物行为
赛拉嗪盐酸盐	Ceva Animal Health		用于手术干预的镇静剂、镇痛剂和肌肉松弛剂