用于制备高度保存的人类脱细胞皮肤基质的脱细胞化，用于再生医学

摘要

脱细胞的人体皮肤适合组织再生。脱细胞化的一个主要问题是天然结构的保留，以及结构蛋白、糖胺聚糖 （GAG） 和生长因子的适当含量。所提出的方法可以快速有效地脱细胞，产生具有保存完好的天然特征的脱细胞皮肤。

摘要

细胞外基质 （ECM） 由于其含有多种生物活性分子，提供生物物理和生化刺激，以支持周围细胞的自我更新、增殖、生存和分化。由于这些特性，ECM 最近被认为是创建生物支架以促进组织再生的有前途的候选者。新兴研究表明，脱细胞的人体组织在其结构和生化特征上可能类似于天然 ECM，保留了三维 （3D） 结构和基本生物分子的内容。因此，脱细胞的 ECM 可用于促进许多器官的组织重塑、修复和功能重建。选择合适的脱细胞程序对于获得保留细胞理想微环境特征的脱细胞组织至关重要。

此处描述的方案提供了脱细胞方法的详细分步描述，以获得可重复且有效的无细胞生物 ECM。使用十二烷基硫酸钠 （SDS）、Triton X-100 和抗生素的组合按比例缩小和脱细胞来自接受整形手术的患者的皮肤碎片。为了促进溶液在样品中的规律和均匀运输，它们被封闭在包埋盒中，以确保免受机械损伤。脱细胞程序后，皮肤片段的雪白颜色表明脱细胞完全成功。此外，脱细胞样品显示出完整且保存完好的结构。结果表明，所提出的脱细胞方法是有效、快速、可重复的，并保护样品免受结构损坏。

引言

ECM 充当细胞的支架，通过由不同组件维护的复杂结构为细胞提供支持，它是负责心脏机械特性和心脏组织功能的主要因素之一 ^1,2。越来越多的证据表明，ECM 在组织重塑中起着积极作用，这使得 ECM 是被动成分的传统假设过时了 3,4,5,6。ECM 的作用是为驻留细胞提供生物物理和生化线索。众所周知，这些信号可以影响许多基本的细胞行为，影响它们的收缩功能、增殖、迁移和分化电位 ^7,8,9。因此，ECM 越来越多地用于组织工程和再生医学，作为治疗支持工具 9,10,11,12,13。

ECM 由多种蛋白质组成，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、蛋白多糖和层粘连蛋白，以及 ECM 结合的生长因子，它们都参与细胞募集、迁移和分化等再生机制，以及细胞对齐和增殖¹⁴。组织的机械特性与器官的生理病理学也有很大关系。事实上，机械性能的变化通常与几种疾病的发生和演变有关。原因在于，当 ECM 被修饰时，来自环境的信号会诱导基因和蛋白质表达的变化，从而导致功能障碍^15,16。

器官修复的再生疗法目前专注于复制天然组织的复杂微环境，以治愈身体衰竭的器官。尽管许多组织工程方法发展迅速，但人工程序仍然无法准确复制组织的整体和复杂性。到目前为止，合成材料已被广泛使用，因为它们可以适当调整以模拟细胞微环境的机械和生化特性。然而，它们也有局限性，例如无法模拟天然组织内的众多相互作用、生产它们的技术成本以及它们不如天然组织天然和生物相容性的事实 17,18,19。此外，它们的组成，主要是在蛋白质和可溶性因子方面，与天然的有很大不同，天然的极难复制²⁰。

缩小有需要的患者与器官移植之间差距的再生医学前沿方法是产生由脱细胞细胞外基质 （d-ECM） 制成的支架，并用适当的细胞类型重新填充它们以再生受损器官。脱细胞是 ECM 从其天然细胞和遗传物质中分离出来以产生天然和仿生支架的过程，一旦植入患者体内，就能够避免免疫反应和排斥反应 21,22,23。这样获得的 ECM 可以重新填充以产生功能性组织。开发 d-ECM 时的主要问题是方法。对于任何脱细胞技术，主要目标仍然是保持天然 ECM 成分、刚度和 3D 结构，所有策略都有优点和缺点。因为从组织中消除细胞内容物和 DNA 需要使用化学或物理试剂，或两者结合，所以每个脱细胞过程都会在不同程度上导致 ECM 的破坏。因此，尽量减少对 ECM 24,25,26 的损坏至关重要。

利用天然 ECM 作为体外重建天然 ECM 的平台是非常可取的。为此，已将几种脱细胞方案应用于广泛的组织 27,28,29,30。事实上，自脱细胞研究和 ECM 开发的早期阶段以来，来自动物和人类的动脉、主动脉瓣和周围神经等多种组织已经脱细胞，一些 d-ECM 仍可在市场上买到并用于组织替代或伤口愈合 31,32,33.最近，由于其成分和机械特性，人类皮肤也成为生产用于心脏修复的脱细胞支架的合适候选者——能够增强心脏祖细胞 （CPC） 的再生潜力并适应心脏收缩力³⁴。本文描述了一种简单快速的方案，用于从成人皮肤生产脱细胞支架，从而允许开发具有保存良好结构的 d-ECM。

方案

根据赫尔辛基宣言的原则和遵守大学医院“Federico II”指南收集人体组织的标本。参与本研究的所有患者都提供了书面同意书。

1. 溶液的制备

1. 制备 1200 mL 的 1% 脱细胞溶液
   1. 通过在量筒中测量 588 mL 双蒸水并将其转移到 1 L 烧杯中，制备 600 mL 2% Triton X-100 溶液。使用血清移液管，向烧杯中加入 12 mL Triton X-100 和搅拌棒。将烧杯放在磁力搅拌器上，混合溶液，直到 Triton X-100 完全溶解。
   2. 停止激动。使用搅拌棒回收器取出搅拌棒。在室温下储存。
   3. 通过在量筒中测量 550 mL 双蒸水并将其转移到 1 L 烧杯中，制备 600 mL 2% SDS 溶液。
   4. 在塑料称重船中称取 12 g SDS 粉末，并在步骤 1.1.3 中将其转移到装有双蒸水的烧杯中。
      注意：步骤 1.1.4 必须在化学罩下进行，并且用户应佩戴个人防护设备。
   5. 加入搅拌棒，将烧杯放在磁力搅拌器上，混合溶液直至 SDS 完全溶解。
   6. 停止搅拌过程。使用搅拌棒回收器取出搅拌棒。
   7. 将溶液转移至量筒中，加入双蒸水，将体积调节至 600 mL。
   8. 将步骤 1.1.1 中制备的 2% Triton X-100 溶液倒入 2 L 圆筒中。
   9. 将步骤 1.1.3-1.1.7 中制备的 2% SDS 溶液倒入同一个 2 L 圆筒中，以获得 1200 mL 的总体积。
   10. 用封口膜覆盖，倒置轻轻混匀，得到均匀的溶液。
   11. 使用漏斗将混合溶液转移到 2 L 瓶中，以避免形成泡沫。将溶液储存在 +4 °C。
2. 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的制备
   1. 通过将 0.1 g 磷酸二氢钾、0.1 g 氯化钾、4.0 g 氯化钠和 0.575 g 磷酸氢二钠溶解在无菌双蒸水中，制备 500 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。检查 pH 值 （7.4）。
   2. 在 +4 °C 下储存直至使用。
3. 抗生素溶液的制备
   1. 在塑料称重舟中称取 625 μg 两性霉素 B。
   2. 将 8 mL 青霉素和链霉素 （pen/strep） 混合物移液到 15 mL 试管中。
   3. 将称量的两性霉素 B 加入笔/链球菌混合物中，并通过添加青霉素和链霉素 （pen/strep） 混合物将体积调节至 10 mL。盖上试管，剧烈摇晃以溶解两性霉素 B。

2. 第 1 天 - 开始脱细胞程序。

1. 将 400 mL 脱细胞溶液倒入 500 mL 烧杯中。
2. 加入 2.0 mL 抗生素溶液。

3. 皮肤样品的制备

1. 在塑料托盘中清洗接受腹部成形术的患者腹部的人体皮肤样本，方法是将其用 0.9% NaCl 等渗生理溶液捆扎并倒置，以去除多余的血液和其他生物液体。
2. 使用细镊子去除毛发，使用大手术剪刀去除脂肪。
3. 将皮肤样本放在解剖板上，用手术刀解剖，以解剖板上的刻度为参考，以获得 3 cm x 2.5 cm 的碎片（长度乘以宽度），避免疤痕和组织脏污或烧伤区域。
4. 将每个片段放入包埋盒中，关闭它，并确保所有盒都被适当锁定，以避免在脱细胞过程中样品泄漏。
5. 将最多四个装有样品的包埋盒放入装有脱细胞溶液的烧杯中。添加搅拌棒。用铝箔覆盖，在顶部写下所有信息以识别样品和程序的开始时间。
6. 将烧杯放在磁力搅拌器上，以 150 rpm 的转速开始搅拌。停止激动。取下覆盖烧杯的铝箔，用长镊子取出包埋盒。
   注：停止搅拌后，检查溶液的澄清度。根据由于细胞碎片释放而导致的混浊程度修改搅拌的持续时间（少于或大于 8 小时）。
7. 将每个研磨盒放入 100 mm 培养皿中。通过在夜间重复步骤 3.5-3.6 来更换脱细胞溶液。

4. 第 2 天 - 检查皮肤样本的状态。

1. 停止搅拌过程。取下覆盖烧杯的铝箔，用长镊子取出包埋盒。
2. 将每个盒放入 100 mm 培养皿中并打开。检查样品的颜色。
   注意：样品的颜色可能会从原生米色变为雪白色。
3. 去除残留的毛发，从真皮上分离表皮。通过重复步骤 3.5-3.6 替换脱细胞溶液。
4. 8 小时后停止搅拌。重复步骤 4.1-4.2，直到样品呈雪白色。停止脱细胞程序。
   注意：如果需要，可以延长暴露于洗涤剂作用的时间。
5. 在 500 mL 圆筒中测量 400 mL 的 1x PBS，将其倒入 500 mL 烧杯中，并加入 2 mL 笔链球菌/两性霉素 B 混合物。添加搅拌棒。
6. 在每个烧杯中放置最多四个装有样品的盒，其中包含 1x PBS/抗生素溶液。用铝箔盖住，并按照步骤 3.5 将所有信息写在顶部。
7. 将烧杯放在磁力搅拌器上，并在室温下以 150 rpm 的转速开始搅拌过夜。

5. 第 3 天 - 样品的最终洗涤

1. 停止激动。用 400 mL 双蒸水替换 1x PBS 溶液。添加搅拌棒。用铝箔覆盖，并按照步骤 3.5 将所有信息写在上面。
2. 将烧杯放在磁力搅拌器上，以 150 rpm 的转速开始搅拌 30 分钟。
3. 停止搅拌过程。取下覆盖烧杯的铝箔，用长镊子取出包埋盒。
4. 将每个含有脱细胞皮肤样品的包埋盒放入 100 mm 培养皿中。打开包埋盒，将皮肤样本轻拍在实验室湿巾上轻轻擦干。
5. 将每个脱细胞的皮肤样品放入先前标有样品相关信息的称重船中。用铝箔盖住船，并在顶部写下所有信息以识别样品。储存在 - 80 °C。

结果

该方案的目的是从生物组织中获得皮肤 d-ECM 样品，保持组织良好的 3D 结构和保存完好的生物分子内容（图 1）。该方法主要基于在含有两种去污剂 Triton X-100 和 SDS 组合的溶液中不断搅拌样品，从而保留天然组织的典型生物学和结构特征，并缩短脱细胞过程中的暴露时间。收到样品后，清洗样品并准备用于手术，获得 3 cm x 2.5 cm 的干净皮肤碎片，不含头发或脂肪组织（图 2 和图 3）。使用包埋盒可以最大限度地减少组织破坏（图 3），从而使样品具有更完整的结构。肉眼观察后，脱细胞的皮肤没有显示出明显的机械或化学损伤迹象。表皮在脱细胞过程中脱落（图 4A、B），样品的颜色从整个天然组织的典型米...

讨论

尽管与以前发布的实验步骤相比，上述实验步骤已经过优化和改进，但它提出了一些需要注意和精确的关键步骤。在制备脱细胞溶液时必须避免形成泡沫，以防止洗涤剂稀释错误。这可以通过轻轻倒入溶液并使它们沿着圆柱体的内侧流动来解决。此外，在手动去除样品中的脂肪组织时必须小心，因为使用去污剂（如 Triton X-100 和 SDS）进行脱细胞并不能去除脂肪，脂质残留可能会对方法的有效性产生负面影响。另一个关键步骤是从样品中去除表皮。在脱细胞过程中，表皮逐渐从皮肤表面分离。在此阶段，只有在完全清除后才用镊子将其剥离，从而避免撕裂或切碎并导致碎屑滞留在样品中。

该方案的重点是通过两种主要策略减少脱细胞对样品的影响：通过结合使用两种去污剂来缩短暴露时间 28,35,36 以及通过将样品封闭在包埋盒中来保护样品免受机械损伤

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl 等渗生理溶液	Sigma-Aldrich	S8776	0.9% 水溶液
1 L 烧杯	VWR	511-0318	使用前清洁和高压灭菌
10 mL 血清移液	Falcon	357551	无菌，  聚苯乙烯
100 mm 板	Falcon	351029	处理的无菌细胞培养皿
15 mL 无菌管	Falcon	352097	离心机无菌管，聚丙烯
1 L 量筒	VWR	612-1524	使用前清洁和高压灭菌
2 L 瓶	VWR	215-1596	使用前清洁和高压灭菌
25 mL 血清移液	Falcon	357525	无菌，  聚苯乙烯
2 L 量筒	VWR	612-3072	清洁和使用前高压灭菌
500 mL 烧杯	VWR	511-0317	使用前清洁和高压灭菌
两性霉素 B	Sigma-Aldrich	Y0000005	粉末
解剖板	VWR	100498-398	由高密度聚乙烯制成。
解剖手术刀	VWR	233-5526	无菌和一次性
包埋盒	Diapath	070191	外部尺寸：40x26x7 毫米（宽 x 深 x 高）
细镊子	VWR	232-1317	使用前清洁和高压灭菌
漏斗	VWR	221-1861	使用前清洁和高压灭菌
六角形称重船 尺寸 M	Sigma-Aldrich	Z708585	六角形，聚苯乙烯，51 mm 底部内径，64 mm 顶部内径
六角形称重船 尺寸 S	Sigma-Aldrich	Z708577	六角形，聚苯乙烯，底部内径 25 mm，顶部内径 38 mm
大型手术剪刀	VWR	233-1211	使用前清洁和高压灭菌
长镊子	VWR	232-0096	使用前清洁和高压灭菌
青霉素和链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	稳定，含 10.000 单位青霉素和 10 毫克链霉素/mL，0.1 &μ;m 已过滤。储存在 -20°C。解决方案 应分装到更小的工作体积中，以避免重复冻融循环溶液。
移液枪	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
塑料托盘	VWR	BELAH162620000	防腐蚀聚丙烯塑料托盘
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333	粉末
磷酸钾 二氢磷酸钾	Sigma-Aldrich	P5665	粉末
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	粉末
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	62862	粉末
磷酸氢钠	Sigma-Aldrich	94046	粉末
铲	VWR	RSGA038.210	使用前清洁和高压灭菌
勺	VWR	231-1314	使用前清洁和高压灭菌
棒	VWR	442-0362	清洁和使用前高压灭菌
器 搅拌棒回收器	VWR	89026-262	采用经 FDA 批准的纯 PTFE
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	液体