用于再生医学的高保留人脱细胞皮肤基质制备的脱细胞化方法

摘要

脱细胞人皮肤适用于组织再生。脱细胞过程中的一个主要问题是保持天然结构架构，同时保留适量的结构蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和生长因子。本研究所提出的方法可实现快速且有效的脱细胞，所获得的脱细胞皮肤具有良好的天然特性保留。

摘要

细胞外基质（ECM）因其含有多种生物活性分子，可为周围细胞的自我更新、增殖、存活和分化提供生物物理和生化刺激。基于这些特性，ECM 近来被认为是一种极具前景的生物支架材料，可用于促进组织再生。新兴研究表明，去细胞化的人体组织在结构和生化特征上可模拟天然 ECM，保留其三维（3D）结构以及关键生物分子的成分。因此，去细胞化 ECM 可用于促进多种器官的组织重塑、修复及功能重建。选择合适的去细胞化方法至关重要，以获得能够保留细胞理想微环境特性的无细胞组织。

本文所述方案详细介绍了获得可重复且高效的无细胞生物细胞外基质（ECM）的脱细胞方法。来自接受整形手术患者的皮肤碎片经裁剪后，采用十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100 和抗生素联合处理进行脱细胞。为促进溶液在样品中的规律且均匀传输，将样品置于包埋盒中，以避免机械损伤。脱细胞处理后，皮肤碎片呈现雪白色，表明脱细胞已完全且成功。此外，脱细胞样品显示出完整且保存良好的结构架构。结果表明，所提出的脱细胞方法高效、快速、可重复，并能有效保护样品结构免受损伤。

引言

细胞外基质（ECM）为细胞提供支架，通过不同组分维持的复杂结构对细胞起支持作用，是决定心脏及心肌组织机械特性和功能的主要因素之一^1,2。越来越多的证据表明，ECM在组织重塑中发挥着主动作用，使得过去认为ECM仅为被动组分的传统观点已不再成立^3,4,5,6。ECM的作用是为局部细胞提供生物物理和生化信号。已有充分研究证实，这些信号可影响多种基本的细胞行为，进而调控细胞的收缩功能、增殖、迁移以及分化潜能^7,8,9。因此，ECM正越来越多地被应用于组织工程和再生医学中，作为治疗支持工具^9,10,11,12,<....

方案

人体组织标本的采集遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并遵守大学医院 "Federico II" 的指南。本研究中所有患者均签署了书面知情同意书。

1. 溶液的配制

1. 1% 脱细胞溶液 1200 mL 的制备
   1. 通过量筒量取 588 mL 双蒸水，转移至 1 L 烧杯中，配制 600 mL 2% Triton X-100 溶液。使用血清移液管向烧杯中加入 12 mL Triton X-100 和一个搅拌子。将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至 Triton X-100 完全溶解。
   2. 停止搅拌。使用搅拌子回收器取出搅拌子。室温保存。
   3. 通过量筒量取 550 mL 双蒸水，转移至 1 L 烧杯中，配制 600 mL 2% SDS 溶液。
   4. 在塑料称量舟中称取 12 g SDS 粉末，并转移至步骤 1.1.3 中含有双蒸水的烧杯中。
      注意：步骤 1.1.4 必须在化学通风橱中操作，操作者应佩戴个人防护装备。
   5. 加入一个搅拌子，将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至 SDS 完全溶解。
   6. 停止搅拌过程。使用搅拌子回收器取出搅拌子。
   7. 将溶液转移至量筒中，用双蒸水定容至 600 mL。
   8. 将步骤 1.1.1 中配制的 2% Triton X-100 溶液倒入 2 L 量筒中。

结果

本方案的目的是从生物组织中获取皮肤脱细胞细胞外基质（d-ECM）样品，同时保持其结构良好的三维结构以及生物分子成分的充分保留（图1）。该方法主要基于在含有两种去污剂Triton X-100和SDS的溶液中持续搅拌样品，从而在缩短脱细胞过程暴露时间的同时，保留天然组织典型的生物学和结构特征。样品收到后，经清洗并进行预处理，制备成3 cm × 2.5 cm大小、无毛发或脂肪组织残留的洁净皮肤片段（图2和 图3）。使用包埋盒可最大限度减少组织损伤（图3），从而获得结构更为完整的样品。经肉眼观察，脱细胞后的皮肤未显示明显的机械或化学损伤迹象。在脱细胞过程中，表皮层发生脱落（图4A、B），样品颜色由天然组织典型的米色转变为雪白色，表明脱细胞已完全且成功（

讨论

尽管上述方案相较于先前发表的方法已得到优化和改进，但仍存在几个需要特别注意和精确操作的关键步骤。在配制脱细胞溶液时，必须避免产生泡沫，以防去垢剂被错误稀释。可通过缓慢倾倒溶液并使其沿容器内壁流下以减少泡沫产生。此外，在手动去除样品中的脂肪组织时需格外小心，因为使用Triton X-100和SDS等去垢剂进行脱细胞处理并不能有效清除脂肪，残留的脂质可能对方法的有效性产生不利影响。另一个关键步骤是从样品中去除表皮。在脱细胞过程中，表皮会逐渐从皮肤表面分离。在此阶段，必须仅在表皮已完全松脱时，才使用镊子将其剥离，以避免撕裂或碎片化，防止碎片残留在组织内部。

本方案主要通过两种策略来降低脱细胞化过程对样本的影响：一是联合使用两种去污剂以缩短样本在处理过程中的暴露时间^28,35,36；二是将样本置于包埋盒中，以保护其免受机械损伤³⁷。此外，该方案在应用于皮肤以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl 等渗生理溶液	Sigma-Aldrich	S8776	0.9% 水溶液
1 L 烧杯	VWR	511-0318	使用前清洗并高压灭菌
10 mL 血清移液管	Falcon	357551	无菌的，  聚苯乙烯
100 mm 培养皿	Falcon	351029	经处理的无菌细胞培养皿
15 mL 无菌管	Falcon	352097	离心无菌管，聚丙烯
1 L 量筒	VWR	612-1524	使用前清洗并高压灭菌
2 L 瓶	VWR	215-1596	使用前清洗并高压灭菌
25 mL 血清移液管	Falcon	357525	无菌的，  聚苯乙烯
2 L 量筒	VWR	612-3072	使用前清洗并高压灭菌
500 mL 烧杯	VWR	511-0317	使用前清洗并高压灭菌
两性霉素B	Sigma-Aldrich	Y0000005	粉末
解剖板	VWR	100498-398	由高密度聚乙烯制成。
解剖刀	VWR	233-5526	无菌且一次性使用
包埋盒	Diapath	070191	外部尺寸：40×26×7 毫米（宽×深×高）
精细镊子	VWR	232-1317	使用前清洗并高压灭菌
漏斗	VWR	221-1861	使用前清洗并高压灭菌
六边形称量皿，M号	Sigma-Aldrich	Z708585	六边形，聚苯乙烯，底部内径 51 mm，顶部内径 64 mm
六边形称量皿，S号	Sigma-Aldrich	Z708577	六边形，聚苯乙烯，底部内径 25 mm，顶部内径 38 mm
大型手术剪	VWR	233-1211	使用前清洗并高压灭菌
长柄镊子	VWR	232-0096	使用前清洗并高压灭菌
青霉素和链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	稳定保存，含青霉素10,000单位和链霉素10 mg/mL，0.1 μm 过滤。于 -20 保存°C.  溶液  应分装为较小的工作体积，以避免反复冻融循环。
移液枪	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
塑料托盘	VWR	BELAH162620000	耐腐蚀聚丙烯塑料托盘
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333	粉末
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5665	粉末
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	粉末
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	62862	粉末
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	94046	粉末
刮勺	VWR	RSGA038.210	使用前清洗并高压灭菌
勺子	VWR	231-1314	使用前清洗并高压灭菌
搅拌子	VWR	442-0362	使用前清洗并高压灭菌
搅拌子取出器	VWR	89026-262	采用纯质、经FDA批准的PTFE模制而成
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	液体