乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型

摘要

乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外 乳腺癌研究系统

摘要

乳腺癌是导致女性死亡的主要原因。乳腺癌细胞的生长及其后续转移是疾病进展的关键因素。尽管已有大量研究采用MCF-7细胞等乳腺癌细胞的单层培养体系来探讨促进乳腺癌生长的相关机制，但对于其他与肿瘤生长密切相关细胞类型（如血管和淋巴管内皮细胞）的作用，尚缺乏深入研究。细胞间的相互作用在肿瘤生长和进展过程中发挥着关键作用。新生血管形成（即血管生成）对肿瘤生长至关重要，而淋巴系统则为癌细胞迁移及后续转移提供了通路。近期研究表明，血管和淋巴管内皮细胞可显著影响癌细胞的生长。这些发现提示有必要开发 体外 更真实地反映乳腺癌生长过程的模型 体内此外，动物研究中的限制要求开发出 离体 模型以更清楚地阐明所涉及的机制。

本文描述了由乳腺癌细胞（雌激素受体阳性的MCF-7细胞）和血管及/或淋巴内皮细胞共同组成的乳腺癌类球体的构建方法。该实验方案详细阐述了两种构建双细胞类球体的方法：悬滴法（金标准且成本较低）和96孔U型底板法（成本较高），并提供了逐步操作指南。文中还详细说明了如何精细地挑取已形成的类球体，通过显微测量监测其生长情况，并利用死/活细胞染色评估其活力。此外，本文还列出了固定类球体以进行切片处理，以及使用特异性生长抗体染色以区分类球体中不同生长模式的操作步骤。同时，提供了构建转染细胞类球体的具体方法，以及提取RNA用于分子分析的技术细节。总之，本文为乳腺癌研究中多细胞类球体的制备提供了详尽的操作指导。

引言

使用动物进行实验存在局限性。动物研究无法准确模拟人类疾病的发展过程，且动物与人类对病原体的反应并不完全相同。此外，由于对动物痛苦的关切以及伦理问题，动物实验也受到限制。^1,2 日益限制研究项目的开展。 体外 已广泛开发出各种系统以避免使用动物；此外，使用人类细胞已使得 体外 更适用于病理生理学和治疗研究的模型。传统的单层（2D）细胞培养因其在一定程度上能够模拟人体组织而被广泛使用。然而，2D单层培养无法模拟人体器官，也不能再现原始器官复杂的微环境，难以准确模拟器官功能 体内 情况^3,4,5,6此外，在单层细胞培养中，药物处理可能容易导致所有细胞被破坏或损伤。重要的是，通过转为多层三维（3D）细胞培养，部分上述局限性可得以克服。^7,8事实上，三维培养模型能够更好地反映原代组织中细胞的结构、排列方式和功能。这些三维培养物可使用多种细胞系形成，类似于功能性器官。目前主要有两种三维培养模型：一种是形成....

方案

1. 细胞培养

注意：细胞操作需在无菌条件下进行。

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）传代培养
   1. 用胶原蛋白（5 µg/cm²，大鼠尾部来源）在室温下过夜（ON）或在37 °C下孵育2-3小时，对75 cm²培养瓶进行包被处理，然后用水冲洗，并让培养瓶自然干燥。
   2. 在标准组织培养条件下（37 °C，5% CO₂），将HUVECs培养于生长培养基（EBM-2，内皮基础培养基-2）中，该培养基需添加谷氨酰胺（1x = 2 mM）、抗生素-抗真菌素溶液（AA；含链霉素100 µg/mL、青霉素100 µg/mL和两性霉素B 0.025 µg/mL）、LSGS（2% v/v FCS、1 µg/mL氢化可的松、10 ng/mL人表皮生长因子、3 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子、10 µg/mL肝素）以及10% FCS（胎牛血清）。每2天更换一次培养基，直至细胞达到70%-80%融合度。
   3. 用5 mL HBSS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）洗涤未完全融合的细胞培养物，然后加入3 mL胰蛋白酶（0.25%，溶于HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺）。
      注：HBSS也可用PBS替代。
   4. 在37 °C孵育2分钟（显微镜下检查细胞....

结果

使用上皮细胞和内皮细胞共培养的类球体模型，可更精确地模拟 体内 乳腺肿瘤的条件 体外 实验。图示方案在 图1 展示了一种利用乳腺癌上皮细胞与血管或淋巴管内皮细胞形成球状体的实验方案图1）。每种细胞类型分别接种于3.5 cm圆形培养皿中，并使用Lipofectamine转染寡核苷酸或加入生长刺激剂/抑制剂进行处理。上皮或内皮细胞经胰蛋白酶消化后收集融合的单层细胞，洗涤并按1:1比例混合。随后将细胞接种至96孔U型底培养板中（图1A）或置于直径为10 cm的圆形培养皿倒置的皿盖上，以利于悬滴培养（图1B接种后不久，细胞会呈现为每个孔或液滴底部扁平且致密的细胞层，随后随着时间推移（24–48 小时）逐渐聚集，在 48 小时时形成完整的球状体。为防止对松散形成的细胞聚集体造成损伤，培养板在至少 24 小时内不得扰动。

.......

讨论

与二维细胞培养相比，革命性的三维球体培养技术是一种更优且更强大的工具，可在体外重建器官的微环境、细胞间相互作用以及药物反应。in vitro。本方案是首个描述由多细胞（上皮和内皮）细胞系形成球体以用于乳腺癌研究的实验方法。该方案可确保球体在长达5天内维持三维球形生长状态，并可用于石蜡包埋、切片及组织学染色后观察。有趣的是，球体内部的细胞组分仍表达促进细胞生长的受体，并对增殖性和凋亡性刺激具有响应性。所述方案可产生足量的生物材料，用于蛋白质或RNA/DNA分析。上述共培养系统在实验室条件下易于实现且成本较低，可能在未来应用中具有优势，尤其适用于乳腺癌治疗及药物敏感性测试。此外，该方案可应用于不同类型的上皮和内皮细胞。

极难模拟 体外 一种存在的复杂组织 体内。这是因为 体内 组织由多种相互作用的组分构成，包括神经、血管、间充质和免疫细胞^30,42本实验方案旨在通过采用包含两种不同类型细胞的三维共培.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm × 20 mm 组织培养处理培养皿	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 × 10 mm 组织培养皿	Falcon	353001
5 mL 血清移液管，聚苯乙烯材质，独立包装，无菌	Falcon	357543
Adobe Photoshop			版本：13.0.1 (64位)
抗生素-抗真菌溶液（100×）	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31（分化簇31）	Cell Marque	131M-95	单克隆小鼠抗体，克隆号 JC70
CellTracker Green CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）	Invitrogen	C7025
CK8/18（细胞角蛋白8和18）	DBS	Mob189-05	单克隆小鼠抗体，克隆号 5D3
CKX41 倒置显微镜	Olympus Life Science		Olympus DP27 数码相机
裂解型 Caspase 3	Cell Signaling	9661L	多克隆兔抗体
胶原蛋白（大鼠尾来源）	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II 稀释液	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1 细胞计数器	Coulter Electronics, Luton, UK
脱水培养基： Noble 琼脂	BD Difco	BD 214220
真皮微血管内皮细胞，新生儿，混合供体（HMVEC-DNeo）	Lonza	CC-2516
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F-12 Ham 营养混合物	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 内皮细胞生长基础培养基-2	Lonza	190860
溴化乙啶同聚体（Ethidium homodimer）	Sigma-Aldrich	46043
胎牛血清（FCS）	Thermo Fisher Scientific	SH30070
活性炭处理胎牛血清（FCS sf）	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Leica M205 FA 荧光体视显微镜	Leica Microsystems
GlutaMAX 补充剂（100×）	Gibco	35050038
HBSS，无钙、无镁、无酚红	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – 人脐静脉内皮细胞	Lonza	CC-2517
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）		Wayne Rasband 版本：1.52a (64位)
Ki67	Cell Marque	275R-16	单克隆兔抗体，克隆号 SP6
Leica 全自动荧光体视显微镜	Leica Microsystems	M205 FA
Leica Histocore Multicut 旋转式切片机		149MULTI0C1
低血清生长补充剂试剂盒（LSGS 试剂盒）	Gibco	S003K
MCF-7 细胞 – 人乳腺腺癌细胞系	苏黎世大学医院妇产科诊所		由 Andrè Fedier 博士提供，源自 ATCC
Nunclon Sphera 96U 孔板	Thermo Fisher Scientific	174925
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	P6148
磷酸盐缓冲液（PBS）1×	Gibco	10010015
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Scientific	23225
蛋白裂解缓冲液	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA 小量提取试剂盒	Zymo Research	R1055
RNA 裂解缓冲液	Zymo Research	R1060-1-100	Quick-RNA 小量提取试剂盒组分
Rotina 46R 离心机	Hettich
圆底聚苯乙烯管，5 mL	Falcon	352003
超声破碎仪	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite 系列 M200 酶标仪	Tecan, Salzburg, AU
组织培养瓶 75	TPP	90076
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T3924