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方法文章

使用多重技术检测小鼠迷走感觉神经元中G蛋白偶联受体的表达 原位 杂交

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DOI：

10.3791/62945

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2021年9月20日

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

本文内容

摘要

采用多重原位杂交（ISH）技术，同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合体中两种G蛋白偶联受体和一种转录因子的转录本。该方案可用于生成迷走传入神经元转录谱的精确图谱。

摘要

本研究描述了一种多重检测的实验方案 原位 小鼠颈静脉-结节神经节原位杂交（ISH），重点检测G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达。经甲醛固定的颈静脉-结节神经节采用RNAscope技术进行处理，以同时检测两种代表性GPCRs（胆囊收缩素受体和饥饿素受体）的表达，并分别与结节神经元标志基因（类配对同源盒2b，Phox2b）或颈静脉传入神经元标志基因（PR结构域含锌指蛋白12，Prdm12）联合检测。标记后的神经节通过共聚焦显微镜成像，以确定上述转录本的分布与表达模式。简而言之，Phox2b传入神经元大量表达胆囊收缩素受体（Cck1r），但不表达饥饿素受体（Ghsr）；而一小部分Prdm12传入神经元则表达Ghsr和/或Cck1r。本文还讨论了多重原位杂交在设计、样本处理及结果解读中可能存在的技术局限性。本研究所描述的方法可帮助科研人员精确绘制迷走传入神经元的转录图谱。

引言

迷走神经传入纤维的胞体位于颈静脉、岩下和结状神经节中1,2,3它们的轴突共同走行 通过 迷走神经的多个分支分布至颅颈、胸和腹区域4,5,6,7从其内脏末梢出发，迷走传入神经能够对多种生理性和伤害性刺激产生反应8,9,10然而，参与迷走神经感知的信号分子和受体的分布仍缺乏充分表征。部分原因在于迷走神经节尽管体积微小，却表达多种多样的受体，包括大量G蛋白偶联受体（GPCRs）8,11,12,13此外，迷走感觉神经元本身具有异质性，并表现出不同的分子特征14此外，小鼠的颈静脉神经节、岩神经节和结状神经节相互连接，形成一个单一的神经节团块。最后，在部分动物中，结状神经节还与交感性的颈上神经节相连接。15.

过去，研究人员曾依赖免疫组织化学技术来研究迷走神经传入神经元的神经化学构成16,17,18。尽管使用经过验证的抗体进行免疫组织化学分析具有一定的价值，但对免疫组织化学研究结果的解读必须谨慎。例如，大量针对G蛋白偶联受体（GPCR）的特异性抗体的开发尝试均以失败告终19,20,21,22,23,24,25，导致研究者得出结论：大多数抗GPCR抗体并不可靠。为规避这些问题，定量PCR（qPCR）已被广泛用于评估啮齿类动物迷走神经节组织中的基因表达26,27,28,29。然而，使用qPCR检测基因表达的代价是空间信息的丢失。特别是，无法准确判断有多少细胞或哪些细胞类型表达特定的目标基因（例如结状神经节细胞与颈静脉神经节细胞）。常见的问题还包括在解剖过程中邻近组织的污染，以及迷走神经、颈上神经节和颈静脉神经节被不同程度地包含在样本中15。由于上述困难，关于多种GPCR在迷走神经传入神经元中的表达与分布仍存在争议。其中尤为令人困惑的一个例子是胃饥饿素受体（Ghsr）。一些研究发现该受体在迷走神经传入神经元中广泛表达30,31,32，而另一些研究则发现Ghsr mRNA在结状神经节中几乎无法检测到11,14。因此，有必要对Ghsr mRNA在迷走神经节组织中的分布进行详细的定位分析。

原位杂交（ISH）也已被用于评估迷走神经节团中的基因表达模式7,11,12,33,34,35。由于在大多数情况下，基于RNA的技术仍比基于抗体的技术更可靠且更具特异性36,37，ISH研究已被证明对于深入理解迷走传入神经元的神经化学编码具有重要价值。然而，传统的ISH技术本身也存在局限性。放射性ISH灵敏度高，但会产生背景信号且操作繁琐38。非放射性ISH操作较简便，但灵敏度较低38。相比之下，近年来开发的RNAscope ISH方法具有高度灵敏性且背景信号极低39。本研究采用多重荧光RNAscope技术检测小鼠迷走传入神经元中的G蛋白偶联受体（GPCRs）。我们重点关注Ghsr的分布图谱，并将其分布与胆囊收缩素受体（Cck1r）进行比较，后者是另一种已知在结节神经节中表达的GPCR34。最后，两种转录因子——成对样同源框2b（Phox2b）和PR结构域含锌指蛋白12（Prdm12）——分别被用作结节和颈静脉传入神经元的选择性标志物14。若不显示Phox2b或Prdm12，将难以确切区分颈静脉与结节传入神经元。本文还对潜在的技术陷阱进行了讨论。

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方案

注：本研究使用的小鼠为纯合C57BL/6J背景的野生型雄性小鼠。共使用4只小鼠进行多重原位杂交实验。所有小鼠在处死时均约为8周龄。另使用一只雄性小鼠（约一岁）以展示与衰老相关的内源性荧光。动物饲养于屏障设施内的通风笼中， 随意摄食 食物和饮水的获取。以下所述实验程序已通过德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会（UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee）的审查和批准。有关试剂和工具的详细信息见于 材料清单.

1. 样本采集

  1. 在处死当天，对小鼠腹腔注射过量水合氯醛（500 mg/kg）。使用蠕动泵对深度麻醉的小鼠进行经心脏灌注，先灌注5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注50 mL 10%甲醛溶液，均于室温下进行。
    注意：此操作需在通风橱中进行，以避免吸入甲醛。
  2. 由于在小鼠中，结状神经节、岩下神经节和颈静脉神经节融合形成一个单一的神经节团块15，借助解剖显微镜以及精细弹簧剪刀和镊子，仔细分离并完整采集每侧（左侧和右侧）的迷走神经节团（参见 材料表).
  3. 使用大型剪刀断头处死小鼠时（参见 材料表），避免压碎脑干。
  4. 参照先前在大鼠中描述的解剖方法40，用小镊子去除气管外侧的胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌（材料表)以暴露枕骨。清除该区域的全部肌肉、脂肪组织和结缔组织，直至颈动脉、迷走神经、舌下神经和枕骨大孔清晰可见。用小型弹簧剪刀切断整个舌下神经。材料表).
  5. 在枕骨大孔附近寻找呈半透明团块状的结状神经节15. 使用小型剪刀（材料表），小心击穿枕骨以进一步暴露颈静脉神经节。以颈静脉神经节表面的黑色黑色素细胞作为视觉标志进行辨认。
  6. 用小弹簧剪刀剪断迷走神经节团与周围神经的连接，并在同时向脑干方向剪开颈静脉节，通过轻轻牵拉迷走神经的外周端，完整摘取整个神经节团材料表).
  7. 尽可能去除附着在迷走神经和神经节团块上的结缔组织和脂肪。
  8. 由于在将样本从一个试管转移至另一个试管时容易丢失某个神经节，因此保留约 0.5 cm 的迷走神经以方便样本的操作与定位。
  9. 借助精细镊子将神经节放入1.5 mL微量离心管中，在4 °C下孵育 °在甲醛中固定24小时，再在30%蔗糖中处理24小时。
  10. 将神经节置于一小滴液体中（约4 mm） Ø在铝箔上滴加适量最佳切割温度（OCT）包埋剂，随后将样品置于干冰上冷冻。
  11. 在 -20 ℃ 下用冷冻切片机切割样品 °14 个部分中的 C µm 厚度，并以 3 组系列收集于玻璃载玻片上 42 µ米 apart。
    注意：避免将切片靠近载玻片边缘放置。为节约试剂，应尽量紧密排列组织切片，但不得重叠。
  12. 将样品储存在 -80 °C冰箱中保存，用于后续ISH实验，可保存至少6个月。
    ​注意：参考 图1 用于内源性荧光问题的排查。

2. 预处理和原位杂交（ISH）

  1. 实验前一天，将用于原位杂交（ISH）的实验玻璃器皿（包括染色皿和洗涤缓冲液瓶）进行高压灭菌。
    注意：虽然无需严格维持无RNase环境，但应始终佩戴手套。若怀疑发生污染，请随时使用RNase去污染溶液瓶（材料表），并置于触手可及处。
  2. 第一天，将载玻片置于专用于ISH的实验台上，恢复至室温。用1×PBS冲洗载玻片，并在烘箱（材料表）中60 °C下烘烤30分钟。
  3. 在4 °C条件下，用4%甲醛对载玻片进行后固定15分钟。
  4. 将多重检测试剂盒中的试剂（材料表）恢复至室温。
  5. 依次用50%、70%和100%乙醇对载玻片进行脱水处理，每次5分钟。向样本中加入H2O2溶液，作用10分钟后，用双蒸水（ddH2O）冲洗。
  6. 用靶修复试剂处理样本5分钟，随后用ddH2O冲洗，再用100%乙醇冲洗，然后自然晾干。使用疏水笔在样本周围画出隔离圈。
    注意：疏水屏障不应画得离组织切片过近。
  7. 在杂交炉（材料表）中40 °C条件下，加入蛋白酶处理30分钟。
  8. 在此期间，将探针在40 °C预热，使用前冷却至室温。将载玻片与所需的目标探针组合（Cck1r-C3、Ghsr-C1、Phox2b-C2；或Cck1r-C3、Ghsr-C1、Prdm12-C2）在杂交炉中40 °C孵育2小时。
  9. 将阴性对照组织在杂交炉中40 °C条件下，与二氢二羟酸还原酶（DapB）靶标C1探针孵育2小时。
  10. 用洗涤缓冲液冲洗载玻片，随后在5×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液中室温过夜保存。为方便操作，可将实验分为两天进行。次日，用洗涤缓冲液冲洗载玻片，然后与下述扩增试剂孵育（详见材料表中的使用手册）。
  11. 依次加入AMP1（40 °C孵育30分钟）、AMP2（40 °C孵育30分钟）和AMP3（40 °C孵育15分钟），每步之间均用洗涤缓冲液冲洗。
  12. 将每种Opal染料（材料表）溶解于二甲基亚砜中，配制后储存于4 °C备用。
  13. 对于通道1，将载玻片与HRP-C1（40 °C孵育15分钟）和Opal 520（绿色；稀释比例1/1,500；40 °C孵育30分钟）孵育。每步之间均用洗涤缓冲液冲洗。
  14. 对于通道2，将载玻片与HRP-C2（40 °C孵育15分钟）和Opal 570（黄色；稀释比例1/1,500；40 °C孵育30分钟）孵育。每步之间均用洗涤缓冲液冲洗。
  15. 对于通道3，将载玻片与HRP-C3（40 °C孵育15分钟）和Opal 690（远红光色；稀释比例1/1,500；40 °C孵育30分钟）孵育。每步之间均用洗涤缓冲液冲洗。
  16. 用洗涤缓冲液清洗载玻片，然后与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育30秒。
  17. 立即在每张载玻片上滴加封片介质，并在组织切片上加盖盖玻片。
  18. 将样本水平放置于载玻片架中，于4 °C保存直至成像。

3. 显微镜观察与数据分析

注意：多重原位杂交（ISH）数据可使用配备适当滤光片的多种仪器进行成像。然而，推荐的成像方法是采用20倍和63倍（油镜）物镜的共聚焦显微镜；相关原因请参见讨论部分。有关信噪比最优化的确定，请参见图2。

  1. 使用配备 488、561 和 633 nm 激光线的共聚焦显微镜。采用以下采集参数（见表 1）：Opal 690（HeNe 633 nm，检测范围 668–696 nm，功率 2.0，增益 724）；Opal 570（DPSS 激光 561 nm，检测范围 579–627 nm，<功率 15.0，<增益 450）；Opal 520（氩离子激光 488 nm，检测范围 499–535 nm，<功率 6.0，<增益 830）；DAPI（二极管激光 405 nm，检测范围 415–502 nm，<功率 12.0，<增益 532）。
  2. 为提高图像质量，采用 4 次线平均，像素尺寸至少为 1024 × 1024。
    注意：上述参数仅为示例，建议根据具体仪器、放大倍数（20× 或 63×）、表达水平以及特定组织的内源性荧光水平进行相应调整。
  3. 在确定采集参数满意后，使用相同设置采集图像。为各通道分配伪彩以方便观察。
    注意：例如，红色代表 Phox2b 或 Prdm12，青色代表 Cck1r，黄色代表 Ghsr，灰色代表 DAPI。
  4. 通过数字图像进行细胞计数，识别出 RNAscope 阳性信号轮廓，并确认其细胞核经 DAPI 轻度染色。计算表达各转录本的 RNAscope 阳性轮廓所占百分比 [图 3A–C]。
  5. 为提高估计的严谨性和准确性，应至少从 4 只不同的动物中计数不少于 2,000 个神经元轮廓。左右侧神经节需分别计数。
  6. 将数据输入饼图，并标注总计数的轮廓数量。
  7. 使用成像软件采集图像，并拼接 20× 图像。使用 ImageJ-Fiji 及其他图像处理与设计软件生成最终图版。对所有图像统一调整对比度和亮度。

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结果

尽管RNAScope可应用于任何年龄、性别或遗传背景的动物，但建议使用年轻成年动物（<3个月大），因为老年动物神经元中常见荧光伪影（例如脂褐素）41。来自老年小鼠的甲醛固定神经节常含有出人意料强烈的内源性荧光，容易被误认为真实染色（图1A、B）。无论何种情况，在处理组织前均建议验证其内源性荧光水平。

使用经 DapB 阴性探针孵育的阴性对照组织切片，确定每种激光和放大倍数下的最佳采集参数及信噪比至关重要，如图 2A、B 所示。由于DapB 是一种原核基因，RNAscope 信号在阴性对照组织中应完全不存在。只要采集参数设置适当，除偶尔出现的碎片和晶体外，阴性对照组织的图像中几乎看不到荧光信号。然而，当激光功率和增益超过某一阈值时，会出现非特异性背景信号和随机分布的荧光点（图 2C

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讨论

原位杂交（ISH）技术发明于20世纪60年代末42。然而，直到20世纪80年代中期，该技术才被用于中枢和外周神经系统中mRNA的检测43,44。鉴于神经系统的异质性以及抗体使用中反复出现的问题，在细胞水平上定位特定转录本仍是一项不可替代的重要工具。尽管如此，传统的ISH方法仍然繁琐且敏感性不稳定。幸运的是，本研究采用了一种高灵敏度的ISH技术——RNAscope，该方法通常无背景信号，能够检测多种低水平表达的转录本45,46。具体而言，本研究应用多重荧光RNAscope技术，同时检测Ghsr和Cck1r的转录本。此外，分别利用转录因子Phox2b和Prdm12作为选择性标记物，以区分结节神经元和颈静脉传入神经元。若不显影Phox2b和Prdm12，将难以确切区分颈静脉与结节传入神经元。如上所述，一个关键步骤是保持一致且正确的解剖技术。此外，内源性荧光的验证也...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #5P01DK119130-02 支持的神经解剖学/组织学/脑注射核心实验室提供支持。作者感谢德克萨斯大学西南医学中心活细胞成像中心（由 Phelps 博士领导）及其工作人员（Abhijit Bugde 和 Marcel Mettlen）提供的协助，该设施部分由 NIH 资助项目 #1S10OD021684-01 支持，是 Harold C. Simmons 癌症中心的共享资源，该中心部分由美国国家癌症研究所（NCI）癌症中心支持基金 P30 CA142543 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBS赛默飞世尔科技BP399-4
20x SSC英杰生命技术公司AM9763
-80°C 冷冻柜PHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobe图像与设计软件
烘箱赛默飞世尔科技型号：658
共聚焦显微镜蔡司LSM880 Airyscan
盖玻片脑科学研究实验室2460-1.5D
冷冻切片机徕卡CM 3050 S
Dumont #5 镊子F.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897L封片介质
HybEZ 杂交炉杂交炉
疏水笔Vector LaboratoriesH-4000
ImageJ-Fiji美国国立卫生研究院（NIH）
大剪刀亨利·舍恩100-7561
微量离心管VWR20170-333
可调流速微型泵赛默飞世尔科技13-876-1
Opal 520Akoya 生物科学公司FP1 1487001KT荧光生物标志物
Opal 570Akoya 生物科学公司FP1 1488001KT荧光生物标志物
Opal 690Akoya 生物科学公司FP1 1497001KT荧光生物标志物
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂用于荧光标记细胞的封片介质
RNAscope 多重荧光试剂盒 v2ACD /Bio-Techne323100多重检测试剂盒
RNAscope 探针 小鼠 Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscope 探针 小鼠 DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscope 探针 小鼠 GhsrACD /Bio-Techne426141
RNAscope 探针 小鼠 Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscope 探针 小鼠 Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZap西格玛R2020RNase 去污染溶液
小型解剖剪刀默克生命科学Z265977
Superfrost Plus 载玻片赛默飞世尔 Fisherbrand1255015
Tissue Tek OCT 包埋剂樱花4583
用户手册ACD323100 USM
Vannas 弹簧剪刀RobozRS 5620
ZEN 成像软件蔡司

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G RNAscope Phox2b
使用多重技术检测小鼠迷走感觉神经元中G蛋白偶联受体的表达 原位 杂交
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