采用多重原位杂交（ISH）技术，同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合体中两种G蛋白偶联受体和一种转录因子的转录本。该方案可用于生成迷走传入神经元转录谱的精确图谱。
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摘要
摘要
本研究描述了一种多重检测的实验方案 原位 小鼠颈静脉-结节神经节原位杂交（ISH），重点检测G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达。经甲醛固定的颈静脉-结节神经节采用RNAscope技术进行处理，以同时检测两种代表性GPCRs（胆囊收缩素受体和饥饿素受体）的表达，并分别与结节神经元标志基因（类配对同源盒2b，Phox2b）或颈静脉传入神经元标志基因（PR结构域含锌指蛋白12，Prdm12）联合检测。标记后的神经节通过共聚焦显微镜成像，以确定上述转录本的分布与表达模式。简而言之，Phox2b传入神经元大量表达胆囊收缩素受体（Cck1r），但不表达饥饿素受体（Ghsr）；而一小部分Prdm12传入神经元则表达Ghsr和/或Cck1r。本文还讨论了多重原位杂交在设计、样本处理及结果解读中可能存在的技术局限性。本研究所描述的方法可帮助科研人员精确绘制迷走传入神经元的转录图谱。
引言
迷走神经传入纤维的胞体位于颈静脉、岩下和结状神经节中1,2,3它们的轴突共同走行 通过 迷走神经的多个分支分布至颅颈、胸和腹区域4,5,6,7从其内脏末梢出发，迷走传入神经能够对多种生理性和伤害性刺激产生反应8,9,10然而，参与迷走神经感知的信号分子和受体的分布仍缺乏充分表征。部分原因在于迷走神经节尽管体积微小，却表达多种多样的受体，包括大量G蛋白偶联受体（GPCRs）8,11,12,13此外，迷走感觉神经元本身具有异质性，并表现出不同....
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方案
注：本研究使用的小鼠为纯合C57BL/6J背景的野生型雄性小鼠。共使用4只小鼠进行多重原位杂交实验。所有小鼠在处死时均约为8周龄。另使用一只雄性小鼠（约一岁）以展示与衰老相关的内源性荧光。动物饲养于屏障设施内的通风笼中， 随意摄食 食物和饮水的获取。以下所述实验程序已通过德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会（UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee）的审查和批准。有关试剂和工具的详细信息见于 材料清单.
1. 样本采集
- 在处死当天，对小鼠腹腔注射过量水合氯醛（500 mg/kg）。使用蠕动泵对深度麻醉的小鼠进行经心脏灌注，先灌注5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注50 mL 10%甲醛溶液，均于室温下进行。
注意：此操作需在通风橱中进行，以避免吸入甲醛。 - 由于在小鼠中，结状神经节、岩下神经节和颈静脉神经节融合形成一个单一的神经节团块15，借助解剖显微镜以及精细弹簧剪刀和镊子，仔细分离并完整采集每侧（左侧和右侧）的迷走神经节团（参见 材料表).
- 使用大型剪刀断头处死小鼠时（参见 材料表），避免压碎脑干。
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结果
尽管RNAScope可应用于任何年龄、性别或遗传背景的动物，但建议使用年轻成年动物（<3个月大），因为老年动物神经元中常见荧光伪影（例如脂褐素）41。来自老年小鼠的甲醛固定神经节常含有出人意料强烈的内源性荧光，容易被误认为真实染色（图1A、B）。无论何种情况，在处理组织前均建议验证其内源性荧光水平。
使用经 DapB 阴性探针孵育的阴性对照组织切片，确定每种激光和放大倍数下的最佳采集参数及信噪比至关重要，如图 2A、B 所示。由于DapB 是一种原核基因，RNAscope 信号在阴性对照组织中应完全不存在。只要采集参数设置适当，除偶尔出现的碎片和晶体外，阴性对照组织的图像中几乎看不到荧光信号。然而，当激光功率和增益超过某一阈值时，会出现非特异性背景信号和随机分布的荧光点（图 2C
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讨论
原位杂交（ISH）技术发明于20世纪60年代末42。然而，直到20世纪80年代中期，该技术才被用于中枢和外周神经系统中mRNA的检测43,44。鉴于神经系统的异质性以及抗体使用中反复出现的问题，在细胞水平上定位特定转录本仍是一项不可替代的重要工具。尽管如此，传统的ISH方法仍然繁琐且敏感性不稳定。幸运的是，本研究采用了一种高灵敏度的ISH技术——RNAscope，该方法通常无背景信号，能够检测多种低水平表达的转录本45,46。具体而言，本研究应用多重荧光RNAscope技术，同时检测Ghsr和Cck1r的转录本。此外，分别利用转录因子Phox2b和Prdm12作为选择性标记物，以区分结节神经元和颈静脉传入神经元。若不显影Phox2b和Prdm12，将难以确切区分颈静脉与结节传入神经元。如上所述，一个关键步骤是保持一致且正确的解剖技术。此外，内源性荧光的验证也.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #5P01DK119130-02 支持的神经解剖学/组织学/脑注射核心实验室提供支持。作者感谢德克萨斯大学西南医学中心活细胞成像中心（由 Phelps 博士领导）及其工作人员（Abhijit Bugde 和 Marcel Mettlen）提供的协助，该设施部分由 NIH 资助项目 #1S10OD021684-01 支持，是 Harold C. Simmons 癌症中心的共享资源，该中心部分由美国国家癌症研究所（NCI）癌症中心支持基金 P30 CA142543 提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | 赛默飞世尔科技 | BP399-4 | |
| 20x SSC | 英杰生命技术公司 | AM9763 | |
| -80°C 冷冻柜 | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | 图像与设计软件 | |
| 烘箱 | 赛默飞世尔科技 | 型号：658 | |
| 共聚焦显微镜 | 蔡司 | LSM880 Airyscan | |
| 盖玻片 | 脑科学研究实验室 | 2460-1.5D | |
| 冷冻切片机 | 徕卡 | CM 3050 S | |
| Dumont #5 镊子 | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | 封片介质 |
| HybEZ 杂交炉 | 杂交炉 | ||
| 疏水笔 | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | 美国国立卫生研究院（NIH） | ||
| 大剪刀 | 亨利·舍恩 | 100-7561 | |
| 微量离心管 | VWR | 20170-333 | |
| 可调流速微型泵 | 赛默飞世尔科技 | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya 生物科学公司 | FP1 1487001KT | 荧光生物标志物 |
| Opal 570 | Akoya 生物科学公司 | FP1 1488001KT | 荧光生物标志物 |
| Opal 690 | Akoya 生物科学公司 | FP1 1497001KT | 荧光生物标志物 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 用于荧光标记细胞的封片介质 | ||
| RNAscope 多重荧光试剂盒 v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | 多重检测试剂盒 |
| RNAscope 探针 小鼠 Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope 探针 小鼠 DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope 探针 小鼠 Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope 探针 小鼠 Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope 探针 小鼠 Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | 西格玛 | R2020 | RNase 去污染溶液 |
| 小型解剖剪刀 | 默克生命科学 | Z265977 | |
| Superfrost Plus 载玻片 | 赛默飞世尔 Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT 包埋剂 | 樱花 | 4583 | |
| 用户手册 | ACD | 323100 USM | |
| Vannas 弹簧剪刀 | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN 成像软件 | 蔡司 |
参考文献
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
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