使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂

Summary

泛素化是翻译后修饰的关键蛋白质，其失调与许多人类疾病有关。该协议详细介绍了如何利用噬菌体显示来分离新的泛素变体，这些变体可以结合和调节控制泛素特异性，效率和模式的E3连接酶的活性。

Abstract

泛素是一种8.6 kDa的小蛋白，是泛素蛋白酶体系统的核心成分。因此，它可以与具有高特异性但低亲和力的各种蛋白质结合。通过噬菌体展示，可以设计泛素变体（UbV），使它们表现出比野生型泛素更好的亲和力，并保持与靶蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用噬菌体文库，其中丝状M13噬菌体的pIII包衣蛋白（选择它是因为它显示在噬菌体表面上）与UbV融合。人类野生型泛素的特定残基是软的和随机的（即，偏向于天然野生型序列）以产生UbVs，从而避免蛋白质构象的有害变化，同时引入促进与靶蛋白的新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbV在噬菌体涂层蛋白上表达和显示，并针对感兴趣的蛋白质进行平移。与靶蛋白表现出有利结合相互作用的UbV被保留，而较差的结合剂被冲走并从文库池中除去。保留的UbV附着在含有UbV相应噬菌体颗粒上的UbV被洗脱，扩增和浓缩，以便它们可以在另一轮噬菌体展示中与相同的靶蛋白平移。通常，最多进行五轮噬菌体展示，在此期间，对弱结合和/或混杂结合的UbV施加强大的选择压力，以便集中和富集具有较高亲和力的UbV。最终，分离出比野生型对应物对靶蛋白具有更高特异性和/或亲和力的UbV，并且可以通过进一步的实验进行表征。

Introduction

了解蛋白质 - 蛋白质相互作用的分子细节对于描绘生物过程的信号转导机制至关重要，特别是那些导致临床重要疾病的机制。近年来，噬菌体展示已被用作分离蛋白质/肽的实用且易于使用的方法，其与所需目标蛋白的结合得到了很大的改善^{1，2，3，4}，而靶蛋白相互作用又可用作蛋白 - 蛋白相互作用的细胞内探针。

泛素化是酶促活性（E1激活酶→E2偶联酶→E3连接酶）的级联反应，其共价偶联泛素（Ub）到蛋白质底物以靶向它们进行降解或介导细胞信号传导变化。此外，去泛素酶催化从蛋白质中去除泛素。因此，在细胞中，有成千上万的Ub依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用，其中绝大多数识别具有低亲和力但高特异性的共同表面，以允许通过大而多样化的表面进行弱相互作用。

Ernst等人将突变引入Ub的已知结合区域，以查看它们是否可以增强对目标蛋白质的结合亲和力，同时仍保持高选择性⁵。开发了一个超过100亿（7.5 x ¹⁰¹⁰）Ub变体（UbVs）的组合库，这些变体在Ub表面的位置发生了突变，介导了已知的Ub蛋白相互作用。该文库由表达融合到多样....

Protocol

1. 试剂制备

1. PBS（磷酸盐缓冲盐水）:将50 mL 10x PBS溶液与450 mL超纯_H2 O混合。通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。
2. 10%BSA（牛血清白蛋白）:缓慢加入1克BSA至7mL超纯_H2 O中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终体积为 10 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
3. PB缓冲液（补充有1%BSA的PBS）:缓慢加入5gBSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
4. PBT缓冲液（PBS补充1%BSA和0.05%吐温20）:缓慢加入5克BSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加入250μL吐温20。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
5. PT 缓冲液（补充有 0.05% 吐温 20 的 PBS）:将 1 mL 吐温 20 与 400 mL PBS 混合。加满超纯_H2 O，直到最终体积为2 L.通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。下。
6. 2YT汤:加入16克色蛋白酮，10克酵母提取物....

Results

噬菌体展示产生的粘合剂可以通过多种方式进行验证和分析。建议首先使用引物对噬菌体进行测序，引物位于噬菌体文库中多样化插入片段的两侧。理想的噬菌体展示实验将显示对多个序列的明显偏倚（图1）。其他序列也将存在，但计数较低，更多地显示为背景噪声。在提供的示例中，在泛素变体（UbV）和野生型UBE4B之间进行噬菌体显示时，存在对序列#1-4的特别偏倚。提供了一个用于组织和分析排序文件的示例 Python 脚本（"phageDisplaySeqAnalysis.py"）。为了证实结合剂的重要性，酶联免疫吸附测定（ELISA）可用作与野生型靶蛋白，突变靶蛋白以及脱靶蛋白相对结合亲和力的快速测量（图1）。新结合剂与新结合剂所基于的野生型结合蛋白之间的结合亲和力的差异可以通过将结合剂的ELISA吸光度归一化为野生型蛋白（未显示）或其他显示与靶蛋白没有明显结合的蛋白质的吸光度来确定（图1）。这个例子证明了富集序列对靶蛋白具有更高结合亲和力的趋势。提供了一个用于组织和分析排序文件的.......

Discussion

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可以使用多种方法来评估蛋白质浓度，并且每种方法都将基于用于噬菌体显示的特定靶蛋白具有独特的优缺点。以前已经提供了流行方法的详细描述和协议的来源¹¹。

使用上一轮噬菌体展示保留的噬菌体作为后续一轮的输入，通过逐渐去除结合微弱、瞬时或偶然结合的粘结剂来丰富良好的粘结剂。到第四轮和第五轮，理想情况下，将明显偏向于一组小而特定的肽序列，从而证明目标蛋白的结合偏好。

此协议已针对与 UbV 库一起使用进行了优化。虽然这些步骤通常可能适用于其他类型的文库（例如，肽、抗体等），但它们可能需要进行调整以适应这种非UbV文库。如步骤4.3.1所述，在进行噬菌体展示之前，应了解文库多样性和浓度。有关如何确定这些库属性的详细信息，请参阅用于创建此过程中使用的 UbV 库的协议¹²。

噬菌体展示结果可以非常清晰，并呈现明显的候选粘合剂以进行进一步的表征。例如，通过EL.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen 迷你管系统（0.65 mL，无菌，96 个/架，10 个架/包）	Fisher Scientific	14-222-198	菌体展示后培养噬菌体输出。
BD Difco 脱水培养基：LB 肉汤，Miller （Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	准备用于滴度的板。
牛血清白蛋白 （BSA），组分 V	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分。
羧青霉素二钠盐 89.0-100.5% 无水	Millipore-Sigma	C1389-5G	培养噬菌粒感染的细胞。
紧凑型数字微孔板摇床	Fisher Scientific	11-676-337	在与噬菌体文库孵育期间摇动板。
康宁微孔板铝密封胶带	Fisher Scientific	07-200-684	密封噬菌体甘油原液。
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	准备用于滴度的板。
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	蛋白质浓度测量。
Greiner Bio-One CellStar 96 孔、未处理、U 形底微孔板	Fisher Scientific	7000133	储存噬菌体甘油原液。
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	噬菌体洗脱。
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coli	Fisher Scientific	C854003	菌体感染细菌菌株。
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	培养 M13K07 辅助噬菌体感染的细胞。
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	允许噬菌粒的包装和分泌。
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	细菌细胞培养。
Nunc MaxiSorp 96 孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	固定化蛋白。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬培养基。
用于 ELISA 和孵育的聚酯薄膜	VWR	60941-120	在孵育过程中覆盖微孔板。
聚乙二醇 8000 （PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀。
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀。
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Scientific	14-956-1D	培养噬菌体起始量。
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 大肠杆菌 OmniMax 细胞。
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱噬菌体溶液。
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基成分。
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分。
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基成分。