使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂

Summary

泛素化是翻译后修饰的关键蛋白质，其失调与许多人类疾病有关。该协议详细介绍了如何利用噬菌体显示来分离新的泛素变体，这些变体可以结合和调节控制泛素特异性，效率和模式的E3连接酶的活性。

Abstract

泛素是一种8.6 kDa的小蛋白，是泛素蛋白酶体系统的核心成分。因此，它可以与具有高特异性但低亲和力的各种蛋白质结合。通过噬菌体展示，可以设计泛素变体（UbV），使它们表现出比野生型泛素更好的亲和力，并保持与靶蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用噬菌体文库，其中丝状M13噬菌体的pIII包衣蛋白（选择它是因为它显示在噬菌体表面上）与UbV融合。人类野生型泛素的特定残基是软的和随机的（即，偏向于天然野生型序列）以产生UbVs，从而避免蛋白质构象的有害变化，同时引入促进与靶蛋白的新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbV在噬菌体涂层蛋白上表达和显示，并针对感兴趣的蛋白质进行平移。与靶蛋白表现出有利结合相互作用的UbV被保留，而较差的结合剂被冲走并从文库池中除去。保留的UbV附着在含有UbV相应噬菌体颗粒上的UbV被洗脱，扩增和浓缩，以便它们可以在另一轮噬菌体展示中与相同的靶蛋白平移。通常，最多进行五轮噬菌体展示，在此期间，对弱结合和/或混杂结合的UbV施加强大的选择压力，以便集中和富集具有较高亲和力的UbV。最终，分离出比野生型对应物对靶蛋白具有更高特异性和/或亲和力的UbV，并且可以通过进一步的实验进行表征。

Introduction

了解蛋白质 - 蛋白质相互作用的分子细节对于描绘生物过程的信号转导机制至关重要，特别是那些导致临床重要疾病的机制。近年来，噬菌体展示已被用作分离蛋白质/肽的实用且易于使用的方法，其与所需目标蛋白的结合得到了很大的改善^{1，2，3，4}，而靶蛋白相互作用又可用作蛋白 - 蛋白相互作用的细胞内探针。

泛素化是酶促活性（E1激活酶→E2偶联酶→E3连接酶）的级联反应，其共价偶联泛素（Ub）到蛋白质底物以靶向它们进行降解或介导细胞信号传导变化。此外，去泛素酶催化从蛋白质中去除泛素。因此，在细胞中，有成千上万的Ub依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用，其中绝大多数识别具有低亲和力但高特异性的共同表面，以允许通过大而多样化的表面进行弱相互作用。

Ernst等人将突变引入Ub的已知结合区域，以查看它们是否可以增强对目标蛋白质的结合亲和力，同时仍保持高选择性⁵。开发了一个超过100亿（7.5 x ¹⁰¹⁰）Ub变体（UbVs）的组合库，这些变体在Ub表面的位置发生了突变，介导了已知的Ub蛋白相互作用。该文库由表达融合到多样化UbV的M13噬菌体pIII涂层蛋白的噬菌体组成。因此，单个UbV可以在表达时通过包衣蛋白显示在噬菌体表面上。在选择过程中，显示与目标蛋白具有显着结合相互作用的UbV的噬菌体将在随后的噬菌体显示轮中被保留和富集，而显示与靶蛋白结合不良的UbV的噬菌体将被冲走并从噬菌体池中去除。保留的噬菌体颗粒含有与其显示的UbV相对应的噬菌体粒，允许它们在分离后进行测序和进一步表征。

利用这种蛋白质工程策略，开发了用于人类去泛素酶⁵和病毒蛋白酶的UbV抑制剂⁶。重要的是，我们通过劫持E2结合位点并激活占据HECT结构域上Ub结合外源的UbVs，为人类HECT家族E3连接酶生成了抑制性^UbV7。我们还可以通过靶向E2结合位点来抑制单体环家族E3s，并诱导UbV二聚化以激活同源二聚体RING E3s8。对于多亚基RING E3s，UbVs可以通过靶向RING亚基（例如，对于APC / C复合物⁹）或破坏复合物形成（例如，对于SCF E3s10）来实现抑制。总的来说，可以利用UbV来系统地询问Ub蛋白酶体系统（UPS）中的蛋白质 - 蛋白质相互作用，以便我们可以更好地破译UPS酶的生化机制，并识别和验证治疗干预的功能位点。

以下方案描述了如何利用先前生成的Phage显示的UbV文库来靶向感兴趣的蛋白质，以及如何通过连续几轮噬菌体显示来富集与目标蛋白质相互作用的UbV结合剂。

Protocol

1. 试剂制备

1. PBS（磷酸盐缓冲盐水）:将50 mL 10x PBS溶液与450 mL超纯_H2 O混合。通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。
2. 10%BSA（牛血清白蛋白）:缓慢加入1克BSA至7mL超纯_H2 O中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终体积为 10 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
3. PB缓冲液（补充有1%BSA的PBS）:缓慢加入5gBSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
4. PBT缓冲液（PBS补充1%BSA和0.05%吐温20）:缓慢加入5克BSA至400 mL超纯_H2O和50 mL PBS中，混合直至完全溶解（无团块）。加入250μL吐温20。加满超纯 _H2O，直至最终容积为 500 mL。过滤灭菌并储存在4°C。
5. PT 缓冲液（补充有 0.05% 吐温 20 的 PBS）:将 1 mL 吐温 20 与 400 mL PBS 混合。加满超纯_H2 O，直到最终体积为2 L.通过过滤灭菌并储存在4°C或室温（〜20-25°C）。下。
6. 2YT汤:加入16克色蛋白酮，10克酵母提取物和5克NaCl至800毫升超纯_H2O，混合直至完全溶解（无团块）。加满超纯_H2 O，直到最终体积为1升，通过高压灭菌灭菌并储存在室温（〜20-25°C）。下。
7. LB/碳水化合物板:加入12.5克预制的LB混合物和7.5克琼脂至400毫升H _2O.加入超纯H _2O，直至最终体积为500毫升，并通过高压灭菌灭菌。确保琼脂完全溶解，等待其冷却至60°C以下。 加入500μL100mg mL羧苄青霉素，混合均匀，倒入平板。储存在4°C。
8. LB/tet 平板:加入 12.5 g 预制 LB 混合物和 7.5 g 琼脂至 400 mL 超纯 _H2 O。加满超纯 _H2 O，直至最终体积为 500 mL，并通过高压灭菌灭菌。确保琼脂完全溶解，并等待其冷却至60°C以下。 加入500μL10mg mL四环素，充分混合，倒入平板。储存在4°C。
9. 20% PEG（聚乙二醇）/2.5 M NaCl:加入 50 g PEG-8000 和 36.5 g NaCl 至 200 mL 超纯 _H2 O。混合直至完全溶解。
   注意:这可能需要一段时间;暖气可以帮忙。加满超纯 _H2 O，直至最终体积为 250 mL。通过过滤或高压灭菌进行灭菌。
10. 0.1 M HCl:将20 mL的1 M HCl与180 mL的超纯_H2 O混合。
11. 1 M Tris （pH 11.0）:将 6.1 g Tris 碱加入 40 mL 超纯 _H2 O 中，用 HCl 将 pH 值调节至 11.0，混合直至 Tris 完全溶解。加满超纯 _H2O，直至最终体积为 50 mL。通过过滤灭菌并储存在室温（〜20-25°C）。
12. 100 mg/mL （1000x） 羧苄青霉素:将 2 g 羧苄青霉素二钠盐加入 20 mL 超纯 _H2 O 中，混合直至完全溶解。通过过滤灭菌并储存在-20°C。
13. 50 mg/mL （1000x） 卡那霉素:将 1 g 硫酸卡那霉素加入 20 mL 超纯 _H2 O 中。混合直至完全溶解。通过过滤灭菌并储存在-20°C。
14. 10 mg/mL （1000x） 四环素: 将 0.2 g 盐酸四环素加入 20 mL 70% 乙醇中。混合直至完全溶解。通过过滤灭菌并储存在-20°C。

2. 蛋白质制备

1. 确定目标蛋白储备的浓度（以μM为单位）。评估蛋白质浓度的最方便方法是测量蛋白质储备在280nm处的吸光度。如果浓度以mg / mL为单位已知，则使用目标蛋白的分子量将其转换为μM。根据感兴趣的蛋白质，可以使用一系列方法;有关详细信息，请参阅讨论部分。
   注意:如果蛋白质被截断（特定蛋白质结构域/基序）或标记，请记住在从mg / mL转换为μM时考虑分子量的这些变化。
2. 准备三个标有"圆形1"，"圆形2/3"和"圆形4/5"的微量离心管。
   1. 计算将其稀释至800 μL PBS中的1μM所需的蛋白质体积，并将该体积等分到管中而不添加PBS。
      注意:如果可用的靶蛋白量较低，则浓度可降至0.25μM。

3. 为第一轮选拔做准备

1. 准备种子培养物以培养噬菌体输入，以进行第二轮选择。
   1. 用分离良好的 大肠杆菌 集落接种5mL 2YT / tet，并在37°C下孵育过夜，200rpm轨道振荡。
2. 为第一轮选择涂上盘子。
   1. 用适量的PBS将"圆形1"管中的靶蛋白稀释，并将100μL等分试样到96孔结合板（即靶板）的八个孔中。
      注意:噬菌体显示可以通过在板的角落涂覆孔来同时在单个板上完成四种不同蛋白质的显示。
   2. 可选对照:如果标记了目标蛋白，例如用GST或MBP（麦芽糖结合蛋白），则在另一个96孔结合板中涂覆8个孔，其中含有100μL含有适当表位标签的1μM溶液。这将用于去除与标签非特异性结合的不需要的噬菌体。
   3. 在4°C下振荡板过夜，200rpm轨道振荡。

4. 第一轮选拔

1. 准备第二轮输入。
   1. 接种30 mL 2YT / tet与步骤3.1开始的200μL种子培养物。
   2. 在37°C下孵育，200rpm的轨道振荡，直到细菌处于对数中期（_OD600 0.6 - 0.8）。这大约需要三个小时。
2. 块目标板。
   1. 通过倒置并在水槽上摇晃，从板或两个板（如果已制成控制板）中取出涂层溶液。在纸巾上拍干。
   2. 向每个包被孔中加入300μLPB缓冲液。
   3. 如步骤4.2.1中取出PB缓冲液，再加入200μLPB缓冲液。
   4. 在室温（〜20-25°C）下孵育1小时，300rpm轨道振荡。
3. 准备噬菌体文库。
   1. 在冰上解冻噬菌体库，并将其稀释至PBS中文库多样性的100倍。例如，如果文库多样性为 1 x ¹⁰¹⁰ ，文库浓度为 1 x ¹⁰¹³，则稀释文库，使浓度为 1 x ¹⁰¹²。对于此处使用的文库，通过将 1 mL 文库与 9 mL PBS 组合，将它们稀释 10 倍于 PBS。
      注意:图书馆多样性应该在图书馆创建期间确定，否则无法轻松评估。文库浓度可以通过接种中对数期（OD _{600 0.6 - 0.8}）和接种LB / carb来确定。
   2. 加入1/5体积的PEG / NaCl。例如，对于10mL先前稀释的文库，加入2mLPEG / NaCl。
   3. 在冰上孵育30分钟。
   4. 在4°C下以11，000× g 离心30分钟，弃去上清液，重新分散2分钟以拉下剩余的上清液。
      注意:第二次将管子放在转子中以与第一个将颗粒保持在相同位置的相同方向，因此，使其更容易看到。
   5. 将噬菌体沉淀轻轻重悬在每块蛋白质1mL的PBT中。对于四种蛋白质，将沉淀重悬于4mL PBT中。
      注意:尽量不要触摸颗粒，也不要引入气泡。
4. 向目标蛋白显示噬菌体。
   1. 可选对照:向对照板中的每个包衣孔中加入100μL噬菌体文库。在室温（~20-25°C）下孵育1小时，300rpm轨道振荡，并将库从控制板转移到目标板。跳过步骤 4.4.2。
   2. 如步骤4.2.1中所述，从靶板中取出PB缓冲液，并向每个包被孔中加入100μL噬菌体文库。
   3. 在室温（〜20-25°C）下孵育1小时，300rpm轨道振荡。
5. 洗脱圆形一个噬菌体。
   1. 除去噬菌体库并用PT缓冲液洗涤包被的孔四次。倒置盘子，然后轻拍纸巾以除去最后一滴。
      注意:如果将多个靶蛋白包被涂在一个板上，请尝试最小化孔之间所有后续溶液的流量。
   2. 向每个包被孔中加入100μL0.1M HCl，并在室温下孵育5分钟，300rpm轨道振荡。
   3. 通过向每个包被孔中加入12.5μL的1 M Tris-HCl（pH 11）来中和pH。
   4. 将来自所有8个孔的洗脱噬菌体汇集到单个1.5mL微量离心管中。在转移过程中上下移液，使溶液均匀，并从孔中吸出所有液体。
   5. 向合并的洗脱噬菌体中加入10%BSA，终浓度为1%。对于950μL的典型第一轮洗脱体积，加入95μL的10%BSA。储存在4°C。 这是第一轮输出。

5. 为后续选拔做准备

1. 准备种子培养物，用于培养噬菌体输入，以便进行下一轮选择，如步骤3.1所示。
2. 按照步骤3.2中的步骤3.2，在板上涂上第三轮选择，并进行如下所述的更改。
   1. 在96孔结合板中，每个蛋白质仅涂覆四孔。使用"圆形2/3"或"圆形4/5"管的一半内容物进行适当的圆形。根据需要稀释这些管的内容物，以避免蛋白质从溶液中沉淀出来。
3. 为下一轮选择准备噬菌体输入。
   1. 使用步骤4.5.5的一半输出来接种步骤4.1中的3mL中对数相细胞。对于典型的第一轮输出，接种500μL的输出。
   2. 在37°C下孵育30分钟，200rpm轨道振荡。
   3. 将M13K07辅助噬菌体加入1 x ¹⁰¹⁰ PFU / mL的终浓度。
   4. 在37°C下孵育1小时，200rpm的轨道振荡。
   5. 将整个3 mL培养物转移到30 mL 2YT / carb / kan中。在37°C下生长过夜，200rpm轨道振荡。
   6. 第二天，将培养物转移到50mL离心管中，并在4°C下以11，000× g 离心10分钟以沉淀细胞。
   7. 将上清液倒入新的50 mL离心管中，与8 mL PEG / NaCl混合并在冰上孵育10分钟。
   8. 在4°C下以11，000× g 离心10分钟，弃去上清液，再次离心2分钟。
      注意:第二次将管子放在转子中以与第一个将颗粒保持在相同位置的相同方向，因此，使其更容易看到。
   9. 将噬菌体沉淀重悬于800μLPBT中，使其完全均匀且不可见团块。
   10. 将噬菌体溶液转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以16，200× g 离心4分钟以沉淀碎片。
   11. 将上清液转移到新的微量离心管中。这是下一轮选择的输入。
4. 可选:滴定输入和输出溶液。
   1. 使用500μL 大肠杆菌 种子培养物接种5mL2YT / tet，并在37°C下孵育，200rpm轨道振荡，直到细菌处于中间对数阶段（_OD600 0.6 - 0.8）。这大约需要1小时。
   2. 将噬菌体输入/输出溶液稀释至PBS中的^{10-3 -10-5}，并将每次稀释的10μL加入90μL培养细胞中。
      注意:立即使用稀释的噬菌体溶液，因为噬菌体会随着时间的推移吸附到管中，并且转化可能会产生假阴性。
   3. 在37°C下孵育20分钟，200rpm轨道振荡。
   4. 在单独的LB /碳水化合物板上板上板5μL。
      注意:电镀量取决于之前的结果/个人喜好。

6. 后续选拔

1. 分别按照步骤3和4中的准备工作执行所有后续回合，并在下面注明差异。
   1. 使用上一轮中产生的输入作为噬菌体源而不是文库。每个目标蛋白涂覆4孔，从上一轮获得的100μL噬菌体输入。将剩余的噬菌体输入储存在4°C。
   2. 使4.5.1中的洗涤步骤在每一轮选择中更加严格。第一轮需要洗涤4次，第二轮需要6次，第三轮需要8次，第四轮和第五轮都需要洗涤10次。
   3. 与第一轮相比，减少了一些体积，因为后续的几轮只涂了四口井而不是八口井。例如，在步骤4.5.5中，仅向噬菌体输出中加入45μL的10%BSA，而在步骤5.3.1中，仅使用250μL噬菌体输出用于接种细胞。

7. 选型后处理和噬菌体分离

1. 滴定第四轮和第五轮的输入和输出溶液。
   1. 如果在步骤5.4中尚未完成，请按照相同的步骤滴定第四轮和第五轮噬菌体输出，理想情况下，在几个板上产生30-300个菌落的范围。
2. 培养和分离噬菌体。
   1. 将450μL2YT / carb / M13K07等分到96迷你管培养箱的每个管中。
   2. 从步骤7.1的任何板中挑选分离良好的菌落，以接种每个管。
      注意:框的上半部分用于第四轮输出，下半部分用于第五轮输出。
   3. 在37°C下孵育过夜，200rpm的轨道振荡。
   4. 在4°C下以1，200× g 离心10分钟。
   5. 将尽可能多的上清液转移到新的96迷你管培养箱中，而不会干扰细胞沉淀并丢弃旧的。储存在4°C。
   6. 从新盒子中，将100μL从每个管转移到所有孔中含有100μL50%甘油的96孔非结合板中。充分混合并储存在-80°C作为备用储备。

Results

噬菌体展示产生的粘合剂可以通过多种方式进行验证和分析。建议首先使用引物对噬菌体进行测序，引物位于噬菌体文库中多样化插入片段的两侧。理想的噬菌体展示实验将显示对多个序列的明显偏倚（图1）。其他序列也将存在，但计数较低，更多地显示为背景噪声。在提供的示例中，在泛素变体（UbV）和野生型UBE4B之间进行噬菌体显示时，存在对序列#1-4的特别偏倚。提供了一个用于组织和分析排序文件的示例 Python 脚本（"phageDisplaySeqAnalysis.py"）。为了证实结合剂的重要性，酶联免疫吸附测定（ELISA）可用作与野生型靶蛋白，突变靶蛋白以及脱靶蛋白相对结合亲和力的快速测量（图1）。新结合剂与新结合剂所基于的野生型结合蛋白之间的结合亲和力的差异可以通过将结合剂的ELISA吸光度归一化为野生型蛋白（未显示）或其他显示与靶蛋白没有明显结合的蛋白质的吸光度来确定（图1）。这个例子证明了富集序列对靶蛋白具有更高结合亲和力的趋势。提供了一个用于组织和分析排序文件的...

Discussion

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可以使用多种方法来评估蛋白质浓度，并且每种方法都将基于用于噬菌体显示的特定靶蛋白具有独特的优缺点。以前已经提供了流行方法的详细描述和协议的来源¹¹。

使用上一轮噬菌体展示保留的噬菌体作为后续一轮的输入，通过逐渐去除结合微弱、瞬时或偶然结合的粘结剂来丰富良好的粘结剂。到第四轮和第五轮，理想情况下，将明显偏向于一组小而特定的肽序列，从而证明目标蛋白的结合偏好。

此协议已针对与 UbV 库一起使用进行了优化。虽然这些步骤通常可能适用于其他类型的文库（例如，肽、抗体等），但它们可能需要进行调整以适应这种非UbV文库。如步骤4.3.1所述，在进行噬菌体展示之前，应了解文库多样性和浓度。有关如何确定这些库属性的详细信息，请参阅用于创建此过程中使用的 UbV 库的协议¹²。

噬菌体展示结果可以非常清晰，并呈现明显的候选粘合剂以进行进一步的表征。例如，通过EL...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen 迷你管系统（0.65 mL，无菌，96 个/架，10 个架/包）	Fisher Scientific	14-222-198	菌体展示后培养噬菌体输出。
BD Difco 脱水培养基：LB 肉汤，Miller （Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	准备用于滴度的板。
牛血清白蛋白 （BSA），组分 V	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分。
羧青霉素二钠盐 89.0-100.5% 无水	Millipore-Sigma	C1389-5G	培养噬菌粒感染的细胞。
紧凑型数字微孔板摇床	Fisher Scientific	11-676-337	在与噬菌体文库孵育期间摇动板。
康宁微孔板铝密封胶带	Fisher Scientific	07-200-684	密封噬菌体甘油原液。
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	准备用于滴度的板。
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	蛋白质浓度测量。
Greiner Bio-One CellStar 96 孔、未处理、U 形底微孔板	Fisher Scientific	7000133	储存噬菌体甘油原液。
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	噬菌体洗脱。
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coli	Fisher Scientific	C854003	菌体感染细菌菌株。
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	培养 M13K07 辅助噬菌体感染的细胞。
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	允许噬菌粒的包装和分泌。
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	细菌细胞培养。
Nunc MaxiSorp 96 孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	固定化蛋白。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬培养基。
用于 ELISA 和孵育的聚酯薄膜	VWR	60941-120	在孵育过程中覆盖微孔板。
聚乙二醇 8000 （PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀。
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀。
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Scientific	14-956-1D	培养噬菌体起始量。
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 大肠杆菌 OmniMax 细胞。
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱噬菌体溶液。
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基成分。
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分。
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基成分。