利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

摘要

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。

摘要

泛素是一种小分子蛋白质，分子量为8.6 kDa，是泛素-蛋白酶体系统的核心组分。因此，它能够以高特异性但低亲和力的方式与多种多样的蛋白质结合。通过噬菌体展示技术，可以对泛素变体（UbVs）进行改造，使其相较于野生型泛素具有更高的亲和力，同时保持对靶标蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用一种噬菌粒文库，将丝状M13噬菌体的pIII外壳蛋白（因其在噬菌体表面外显表达而被选用）与UbVs融合表达。通过对人源野生型泛素的特定残基进行温和随机化（即偏向于保留原始野生型序列）来生成UbVs，从而在避免蛋白质构象发生有害改变的同时，引入促进与靶标蛋白产生新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbVs被表达并展示在噬菌体外壳蛋白上，并与目标蛋白进行筛选。其中，与目标蛋白具有有利结合相互作用的UbVs被保留下来，而结合能力差的变体则被洗脱并从文库中去除。被保留的UbVs（其与携带对应UbV噬菌粒的噬菌体颗粒相连）被洗脱、扩增并浓缩，以便在下一轮噬菌体展示中再次针对同一靶标蛋白进行筛选。通常进行最多五轮噬菌体展示，在此过程中施加强烈的选择压力，以淘汰结合微弱和/或非特异结合的UbVs，从而使高亲和力的UbVs得以富集。最终，可分离出相较于野生型泛素对靶标蛋白具有更高特异性或亲和力的UbVs，并可通过进一步实验对其进行表征。

引言

了解蛋白质-蛋白质相互作用的分子细节对于阐明生物过程中的信号转导机制至关重要，特别是那些与临床重要疾病相关的机制。近年来，噬菌体展示技术已被用作一种实用且易于操作的方法，用于分离对特定靶标蛋白质具有显著增强结合能力的蛋白质或多肽^1,2,3,4，这些蛋白质或多肽随后可作为细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的探针。

泛素化是一系列酶促反应（E1 激活酶 → E2 结合酶 → E3 连接酶），通过该过程将泛素（Ub）共价连接到蛋白质底物上，从而靶向其降解或介导细胞信号转导的改变。此外，去泛素化酶可催化从蛋白质上切除泛素。因此，在细胞中存在数千种依赖泛素的蛋白质-蛋白质相互作用，其中绝大多数通过低亲和力但高特异性的共同表面识别，使得能够在大而多样的表面上形成较弱的相互作用。

Ernst 等人对泛素（Ub）中已知的结合区域引入突变，以探究是否能在保持高选择性的同时增强其对目标蛋白的结合亲和力⁵。研究人员构建了一个包含超过 100 亿（7.5 × 10¹⁰）种泛素变体（UbVs）的组合文库，这些变体在介导已知泛素-蛋白相互作用的泛素表面位点上存在突变。该文库由噬菌粒组成，可表达 M13 噬菌体 pIII 衣壳蛋白与多样化 UbVs 的融合蛋白。因此，在表达时，单个 UbVs 可通过衣壳蛋白展示在噬菌体表面。在筛选过程中，展示出与目标蛋白具有较强结合能力的 UbVs 的噬菌体会被保留并在后续的噬菌体展示轮次中富集，而展示出与目标蛋白结合能力较弱的 UbVs 的噬菌体则会被洗脱并从噬菌体库中去除。被保留的噬菌体颗粒含有与其展示的 UbV 对应的噬菌粒，从而可在分离后对其进行测序和进一步表征。

利用这种蛋白质工程策略，已针对人类去泛素化酶⁵和病毒蛋白酶⁶开发出UbV抑制剂。重要的是，我们通过劫持E2结合位点以及激活占据HECT结构域上泛素结合外位点的UbV，成功生成了针对人类HECT家族E3连接酶的抑制性UbV⁷。我们还可以通过靶向E2结合位点来抑制单体形式的RING家族E3，并通过诱导UbV二聚化来激活同源二聚体RING E3连接酶⁸。对于多亚基RING E3连接酶，UbV可通过靶向RING亚基（例如APC/C复合物⁹）或破坏复合物的形成（例如SCF E3连接酶¹⁰）实现抑制作用。综上所述，UbV可用于系统性地探究泛素-蛋白酶体系统（UPS）中的蛋白质-蛋白质相互作用，从而更深入地解析UPS酶的生化机制，并识别和验证可用于治疗干预的功能位点。

以下方案描述了如何利用先前构建的噬菌体展示UbV文库来靶向目标蛋白，以及如何通过多轮噬菌体展示技术富集与目标蛋白相互作用的UbV结合物。

方案

1. 试剂准备

1. PBS（磷酸盐缓冲液）：将50 mL的10倍浓缩PBS溶液与450 mL超纯H₂O混合。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。
2. 10% BSA（牛血清白蛋白）：缓慢将1 g BSA加入7 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H₂O定容至终体积10 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
3. PB缓冲液（含1% BSA的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H₂O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H₂O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
4. PBT缓冲液（含1% BSA和0.05% Tween 20的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H₂O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。加入250 µL Tween 20。用超纯H₂O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
5. PT缓冲液（含0.05% Tween 20的PBS）：将1 mL Tween 20加入400 mL PBS中，混合均匀。用超纯H₂O定容至终体积2 L。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。
6. 2YT培养基：将16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物和5 g NaCl加入800 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H₂O定容至终体积1 L。高压灭菌后，于室温（~20–25 °C）保存。
7. LB/氨苄青霉素平板：将12.5 g预混LB培养基和7.5 g琼脂加入400 mL H₂O中。用超纯H₂O定容至终体积500 mL，高压灭菌。确保琼脂完全溶解，冷却至60 °C以下。加入500 µL浓度为100 mg/mL的羧苄青霉素，充分混匀后倒入培养皿。于4 °C保存。
8. LB/四环素平板：将12.5 g预混LB培养基和7.5 g琼脂加入400 mL超纯H₂O中。用超纯H₂O定容至终体积500 mL，高压灭菌。确保琼脂完全溶解，冷却至60 °C以下。加入500 µL浓度为10 mg/mL的四环素，充分混匀后倒入培养皿。于4 °C保存。
9. 20% PEG（聚乙二醇）/2.5 M NaCl：将50 g PEG-8000和36.5 g NaCl加入200 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解。
   注意：此过程可能耗时较长，可适当加热以助溶解。用超纯H₂O定容至终体积250 mL。可通过过滤或高压灭菌进行灭菌。
10. 0.1 M HCl：将20 mL 1 M HCl与180 mL超纯H₂O混合。过滤除菌后，于室温（~20–25 °C）保存。
11. 1 M Tris（pH 11.0）：将6.1 g Tris碱加入40 mL超纯H₂O中，用HCl调节pH至11.0，并搅拌至Tris完全溶解。用超纯H₂O定容至终体积50 mL。过滤除菌后，于室温（~20–25 °C）保存。
12. 100 mg/mL（1000倍浓缩）羧苄青霉素：将2 g羧苄青霉素二钠盐加入20 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。
13. 50 mg/mL（1000倍浓缩）卡那霉素：将1 g硫酸卡那霉素加入20 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。
14. 10 mg/mL（1000倍浓缩）四环素：将0.2 g盐酸四环素加入20 mL 70%乙醇中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。

2. 蛋白质制备

1. 测定目标蛋白储备液的浓度（单位：µM）。最便捷的蛋白浓度测定方法是测量蛋白储备液在280 nm处的吸光度。如果浓度已知单位为mg/mL，可利用目标蛋白的分子量将其换算为µM。具体方法可根据目标蛋白的特性选择；详见讨论部分。
   注意：如果蛋白为截短形式（特定蛋白结构域/基序）或带有标签，需在将mg/mL换算为µM时考虑分子量的相应变化。
2. 准备三个微量离心管，分别标记为“第1轮”、“第2/3轮”和“第4/5轮”。
   1. 计算将蛋白稀释至800 µL PBS中浓度为1 µM所需的蛋白体积，并将该体积的蛋白分装至各管中，暂不加入PBS。
      ​注意：若目标蛋白的可用量较少，浓度可降低至最低0.25 µM。

3. 第一轮筛选的准备工作

1. 准备用于第二轮筛选的噬菌体输入种子培养物。
   1. 取一个单菌落的 Escherichia coli 接种于5 mL 2YT/tet培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
2. 包被第一轮筛选的酶标板。
   1. 将“第1轮”管中的靶蛋白用适量PBS稀释，并取100 µL加入96孔结合板（即靶标板）的八个孔中。
      ​注意：通过在酶标板的四个角孔包被，可在同一块板上同时进行四种不同蛋白的噬菌体展示筛选。
   2. 可选对照：若靶蛋白带有标签（如GST或MBP（麦芽糖结合蛋白）），则另取一块96孔结合板，在八个孔中各加入100 µL含相应表位标签的1 µM溶液。此对照用于去除非特异性结合标签的非目标噬菌体。
   3. 4 °C、200 rpm振荡孵育过夜。

4. 第一轮筛选

1. 准备第二轮输入。
   1. 取步骤 3.1 中的种子培养物 200 µL 接种至 30 mL 的 2YT/tet 培养基中。
   2. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养，直至细菌进入对数中期（OD₆₀₀ 0.6 - 0.8），约需 3 小时。
2. 封闭目标板。
   1. 将包被板（若已制备对照板，则包括两块板）倒置并在水槽上方轻轻振荡，去除包被液，然后用纸巾轻拍干燥。
   2. 向每个包被孔中加入 300 µL PB 缓冲液。
   3. 参照步骤 4.2.1 的方法去除 PB 缓冲液，再向每孔加入 200 µL PB 缓冲液。
   4. 在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。
3. 准备噬菌体文库。
   1. 将噬菌体文库置于冰上解冻，并用 PBS 稀释至文库多样性（diversity）的 100 倍。例如，若文库多样性为 1 × 10¹⁰，文库浓度为 1 × 10¹³，则应将文库稀释至浓度为 1 × 10¹²。对于本实验所用文库，可将 1 mL 文库与 9 mL PBS 混合，实现 10 倍稀释。
      注：文库多样性应在文库构建过程中确定，通常无法轻易重新评估；文库浓度可通过将处于对数中期（OD₆₀₀ 0.6 - 0.8）的 E. coli 细胞接种并在 LB/carb 培养基上培养后测定。
   2. 加入 PEG/NaCl 至终体积的 1/5。例如，对于 10 mL 已稀释的文库，加入 2 mL PEG/NaCl。
   3. 在冰上孵育 30 分钟。
   4. 在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 30 分钟，弃上清液，再以相同转速离心 2 分钟以去除残留上清液。
      注：第二次离心时，应将离心管在转子中保持与第一次相同的朝向，以便沉淀始终位于同一位置，便于观察。
   5. 每种蛋白使用 1 mL PBT 缓冲液轻柔重悬噬菌体沉淀。若含四种蛋白，则用 4 mL PBT 重悬沉淀。
      注：操作时尽量避免触碰沉淀，且不要引入气泡。
4. 使噬菌体与目标蛋白结合。
   1. 可选对照步骤：向对照板的每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库，在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时，随后将文库从对照板转移至目标板。此情况下跳过步骤 4.4.2。
   2. 参照步骤 4.2.1 的方法去除目标板中的 PB 缓冲液，向每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库。
   3. 在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。
5. 洗脱第一轮噬菌体。
   1. 去除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液清洗包被孔 4 次。将板倒置并在纸巾上轻拍，去除最后的液滴。
      注：若一块板上包被了多种目标蛋白，应尽量减少后续溶液在各孔之间的流动。
   2. 向每个包被孔中加入 100 µL 0.1 M HCl，在室温下以 300 rpm 振荡孵育 5 分钟。
   3. 通过向每个包被孔中加入 12.5 µL 1 M Tris-HCl（pH 11）中和 pH。
   4. 将全部 8 个孔中洗脱的噬菌体合并至一个 1.5 mL 微量离心管中。转移过程中反复吹打，确保溶液均匀，并完全吸出各孔中的液体。
   5. 向合并的洗脱液中加入 10% BSA，使其终浓度为 1%。对于典型的 950 µL 第一轮洗脱体积，加入 95 µL 10% BSA。4 °C 保存。此即为第一轮输出产物。

5. 后续筛选轮次的准备工作

1. 按照步骤 3.1 的方法制备用于下一轮筛选的噬菌体输入种子培养物。
2. 按照步骤 3.2 的方法对板进行第三轮筛选包被，但需注意以下更改：
   1. 在 96 孔结合板中，每种蛋白质仅包被四个孔。使用“第 2/3 轮”或“第 4/5 轮”管中一半的内容物用于相应轮次。根据需要稀释这些管中的内容物，以避免蛋白质从溶液中沉淀析出。
3. 准备下一轮筛选的噬菌体输入：
   1. 取步骤 4.5.5 中第一轮输出的一半，接种步骤 4.1 中的 3 mL 对数中期菌液。对于典型的首轮输出，使用 500 µL 输出液进行接种。
   2. 在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 30 分钟。
   3. 加入 M13K07 辅助噬菌体，使其终浓度达到 1 × 10¹⁰ PFU/mL。
   4. 在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 1 小时。
   5. 将全部 3 mL 培养物转移至 30 mL 的 2YT/carb/kan 培养基中，在 37 °C 下以 200 rpm 振荡过夜培养。
   6. 次日，将培养物转移至 50 mL 离心管中，在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。
   7. 将上清液倾入新的 50 mL 离心管中，加入 8 mL PEG/NaCl，冰上孵育 10 分钟。
   8. 在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液后再次离心 2 分钟。
      注：第二次离心时，将离心管在转子中保持与第一次相同的朝向，以确保沉淀位于同一位置，便于观察。
   9. 用 800 µL PBT 重悬噬菌体沉淀，使其完全均匀，无可见团块。
   10. 将噬菌体溶液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 16,200 × g 离心 4 分钟，沉淀碎片。
   11. 将上清液转移至新的微量离心管中。此即为下一轮筛选的输入样品。
4. 可选：滴定输入和输出溶液。
   1. 使用 500 µL 的 E. coli 种子培养物接种 5 mL 的 2YT/tet 培养基，在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养，直至细菌达到对数中期（OD₆₀₀ 0.6 - 0.8）。此过程约需 1 小时。
   2. 将噬菌体输入/输出溶液用 PBS 稀释至 10^-3–10^-5，取每种稀释液 10 µL 加入 90 µL 培养细胞中。
      注：稀释后的噬菌体溶液应立即使用，因为噬菌体会随时间吸附到管壁上，可能导致转化出现假阴性结果。
   3. 在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 20 分钟。
   4. 分别取 5 µL 涂布于不同的 LB/carb 平板上。
      ​注：涂布量可根据先前结果或个人偏好调整。

6. 后续轮次的筛选

1. 进行所有后续轮次，其操作步骤分别与步骤 3 和步骤 4 相同，但需注意以下差异。
   1. 使用上一轮产生的产物作为噬菌体来源，而非文库。每种靶蛋白包被 4 个孔，每孔加入 100 µL 上一轮获得的噬菌体输入液。将剩余的噬菌体输入液储存于 4 °C。
   2. 在每一轮筛选中逐步增加步骤 4.5.1 洗涤步骤的严格程度。第一轮需洗涤 4 次，第二轮需洗涤 6 次，第三轮需洗涤 8 次，第四轮和第五轮均需洗涤 10 次。
   3. 由于后续轮次仅包被 4 个孔而非 8 个孔，因此需减少部分体积。例如，在步骤 4.5.5 中仅向噬菌体输出液中加入 45 µL 的 10% BSA，在步骤 5.3.1 中仅使用 250 µL 的噬菌体输出液接种细胞。

7. 筛选后处理与噬菌体分离

1. 对第四轮和第五轮的输入液与输出液进行滴定。
   1. 如果尚未在步骤5.4中完成，请按照相同步骤对第四轮和第五轮噬菌体输出液进行滴定，理想情况下应在若干平板上获得30–300个菌落的范围。
2. 培养并分离噬菌体。
   1. 向96孔微型管培养盒的每个管中分装450 µL的2YT/羧苄青霉素/M13K07培养基。
   2. 从步骤7.1的任一平板中挑选分离良好的单菌落，接种至各管中。
      注意：使用盒子的上半部分存放第四轮输出样品，下半部分存放第五轮输出样品。
   3. 在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
   4. 在4 °C下以1,200 × g 离心10分钟。
   5. 尽可能多地将上清液转移至新的96孔微型管培养盒中，避免扰动细胞沉淀，弃去原管。将新管储存于4 °C。
   6. 从新管中各取100 µL转移至一个96孔非结合板中，该板每孔已预先加入100 µL 50%甘油。充分混匀后储存于-80 °C作为备份菌种库。

结果

通过噬菌体展示技术获得的结合物可通过多种方式进行验证和分析。建议首先对噬菌体进行测序，使用引物扩增噬菌粒文库中可变插入片段两侧的区域。理想的噬菌体展示实验应显示出对若干序列的明显富集趋势（图1）。其他序列也可能存在，但数量较少，表现为背景噪音。在所提供的示例中，当在泛素变体（UbVs）与野生型UBE4B之间进行噬菌体展示时，序列#1-4表现出明显的富集倾向。本文提供了一个用于整理和分析测序文件的Python脚本示例（“phageDisplaySeqAnalysis.py”）。为确认结合物的显著性，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）快速评估其对野生型靶蛋白、突变型靶蛋白以及非靶标蛋白的相对结合亲和力（图1）。新结合物与其所基于的野生型结合蛋白之间在结合亲和力上的差异，可通过将结合物的ELISA吸光度值相对于野生型蛋白（未显示）或其他与靶蛋白无明显结合的蛋白进行归一化处理来确定（图1）。该示例表明，富集序列倾向于对靶蛋白具有更高的结合亲和力。本文提供了一个用于整...

讨论

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可采用多种方法测定蛋白质浓度，而每种方法的优缺点均取决于用于噬菌体展示的具体靶蛋白。有关常用方法的详细描述和实验方案，先前已有文献提供¹¹。

将前一轮噬菌体展示中保留下来的噬菌体作为下一轮的输入，可通过逐步去除弱结合、瞬时结合或非特异性结合的噬菌体，从而富集出高亲和力的结合子。理想情况下，在第四轮和第五轮后，将明显富集到少数特定的肽序列，从而揭示目标蛋白的结合偏好性。

本方案已针对UbV文库的使用进行了优化。尽管这些步骤通常可能适用于其他类型的文库（例如肽段、抗体等），但很可能需要进行相应调整以适应非UbV文库。如步骤4.3.1中所述，在进行噬菌体展示之前，应事先了解文库的多样性及浓度。有关如何确定这些文库特性的更多信息，请参见本实验所用UbV文库构建所依据的方案¹²。

噬菌体展示实验结果可能非常明确，能够呈现出明显值得进一步表征的候选结合物。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axygen Mini Tube System（0.65 mL，无菌，96/架，每包10架）	Fisher Scientific	14-222-198	噬菌体展示后培养噬菌体产物。
BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	制备滴定用平板。
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分。
羧苄青霉素二钠盐，89.0–100.5% 无水物	Millipore-Sigma	C1389-5G	培养噬粒感染的细胞。
Compact Digital 微孔板振荡仪	Fisher Scientific	11-676-337	与噬菌体文库共孵育期间振荡微孔板。
Corning 微孔板铝封膜	Fisher Scientific	07-200-684	密封噬菌体甘油保存液。
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	制备滴定用平板。
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	蛋白质浓度测定。
Greiner Bio-One CellStar 96孔未处理U型底微孔板	Fisher Scientific	7000133	储存噬菌体甘油保存液。
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	噬菌体洗脱。
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coli	Fisher Scientific	C854003	用于噬菌体感染的细菌菌株。
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	培养M13K07辅助噬菌体感染的细胞。
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	介导噬粒的包装与分泌。
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	细菌培养。
Nunc MaxiSorp 96孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	固定蛋白质。
磷酸盐缓冲液（PBS）10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬介质。
ELISA及孵育用聚酯薄膜	VWR	60941-120	孵育期间覆盖微孔板。
聚乙二醇8000（PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀。
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀。
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Fisher Scientific	14-956-1D	培养噬菌体输入样本。
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 E. coli OmniMax 细胞。
Tris碱	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱后的噬菌体溶液。
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基组分。
吐温20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分。
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基组分。