利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

摘要

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。

摘要

泛素是一种小分子蛋白质，分子量为8.6 kDa，是泛素-蛋白酶体系统的核心组分。因此，它能够以高特异性但低亲和力的方式与多种多样的蛋白质结合。通过噬菌体展示技术，可以对泛素变体（UbVs）进行改造，使其相较于野生型泛素具有更高的亲和力，同时保持对靶标蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用一种噬菌粒文库，将丝状M13噬菌体的pIII外壳蛋白（因其在噬菌体表面外显表达而被选用）与UbVs融合表达。通过对人源野生型泛素的特定残基进行温和随机化（即偏向于保留原始野生型序列）来生成UbVs，从而在避免蛋白质构象发生有害改变的同时，引入促进与靶标蛋白产生新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbVs被表达并展示在噬菌体外壳蛋白上，并与目标蛋白进行筛选。其中，与目标蛋白具有有利结合相互作用的UbVs被保留下来，而结合能力差的变体则被洗脱并从文库中去除。被保留的UbVs（其与携带对应UbV噬菌粒的噬菌体颗粒相连）被洗脱、扩增并浓缩，以便在下一轮噬菌体展示中再次针对同一靶标蛋白进行筛选。通常进行最多五轮噬菌体展示，在此过程中施加强烈的选择压力，以淘汰结合微弱和/或非特异结合的UbVs，从而使高亲和力的UbVs得以富集。最终，可分离出相较于野生型泛素对靶标蛋白具有更高特异性或亲和力的UbVs，并可通过进一步实验对其进行表征。

引言

了解蛋白质-蛋白质相互作用的分子细节对于阐明生物过程中的信号转导机制至关重要，特别是那些与临床重要疾病相关的机制。近年来，噬菌体展示技术已被用作一种实用且易于操作的方法，用于分离对特定靶标蛋白质具有显著增强结合能力的蛋白质或多肽^1,2,3,4，这些蛋白质或多肽随后可作为细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的探针。

泛素化是一系列酶促反应（E1 激活酶 → E2 结合酶 → E3 连接酶），通过该过程将泛素（Ub）共价连接到蛋白质底物上，从而靶向其降解或介导细胞信号转导的改变。此外，去泛素化酶可催化从蛋白质上切除泛素。因此，在细胞中存在数千种依赖泛素的蛋白质-蛋白质相互作用，其中绝大多数通过低亲和力但高特异性的共同表面识别，使得能够在大而多样的表面上形成较弱的相互作用。

Ernst 等人对泛素（Ub）中已知的结合区域引入突变，以探究是否能在保持高选择性的同时增强其对目标蛋白的结合亲和力⁵。研究人员构建了一个包含超过 100 亿（7.5 × 10¹⁰）种泛素变体（UbVs）的组合文库，这些变体在介导已知泛素-蛋....

方案

1. 试剂制备

1. PBS（磷酸盐缓冲液）：将50 mL的10倍浓缩PBS溶液与450 mL超纯H₂O混合。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。
2. 10% BSA（牛血清白蛋白）：缓慢将1 g BSA加入7 mL超纯H₂O中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H₂O定容至终体积10 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
3. PB缓冲液（含1% BSA的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H₂O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H₂O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
4. PBT缓冲液（含1% BSA和0.05% Tween 20的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H₂O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。加入250 µL Tween 20。用超纯H₂O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。
5. PT缓冲液（含0.05% Tween 20的PBS）：将1 mL Tween 20加入400 mL PBS中，混合均匀。用超纯H₂O定容至终体积2 L。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。
6. 2YT培养基：将16 g胰蛋白胨、10....

结果

通过噬菌体展示技术获得的结合物可通过多种方式进行验证和分析。建议首先对噬菌体进行测序，使用位于噬粒文库中多样化插入片段两侧的引物。理想的噬菌体展示实验将显示出对若干序列的明显富集趋势（图1）。其他序列也可能存在，但数量较少，主要表现为背景噪音。在所提供的示例中，当在泛素变体（UbVs）与野生型UBE4B之间进行噬菌体展示时，序列#1-4表现出明显的富集倾向。已提供一个用于整理和分析测序文件的Python脚本示例（“phageDisplaySeqAnalysis.py”）。为确认结合物的显著性，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）快速评估其对野生型靶蛋白、突变型靶蛋白以及非靶标蛋白的相对结合亲和力（图1）。通过将结合物的ELISA吸光度值相对于野生型蛋白（未显示）或其他与靶蛋白无明显结合的蛋白进行归一化处理，可确定新结合物与其所基于的野生型结合蛋白之间的结合亲和力差异（图1）。此示例展示了富集序列倾向于对靶蛋白具有更高结合亲和力的现象。已提供一个用于整理和分析E.......

讨论

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可采用多种方法测定蛋白质浓度，而每种方法的优缺点均取决于用于噬菌体展示的具体靶蛋白。有关常用方法的详细描述和实验方案，先前已有文献提供¹¹。

将前一轮噬菌体展示中保留下来的噬菌体作为下一轮的输入，可通过逐步去除弱结合、瞬时结合或非特异性结合的噬菌体，从而富集出高亲和力的结合子。理想情况下，在第四轮和第五轮后，将明显富集到少数特定的肽序列，从而揭示目标蛋白的结合偏好性。

本方案已针对UbV文库的使用进行了优化。尽管这些步骤通常可能适用于其他类型的文库（例如肽段、抗体等），但很可能需要进行相应调整以适应非UbV文库。如步骤4.3.1中所述，在进行噬菌体展示之前，应事先了解文库的多样性及浓度。有关如何确定这些文库特性的更多信息，请参见本实验所用UbV文库构建所依据的方案¹²。

噬菌体展示实验结果可能非常明确，能够呈现出明显值得进一步表征的候选结合物。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axygen Mini Tube System（0.65 mL，无菌，96/架，每包10架）	Fisher Scientific	14-222-198	噬菌体展示后培养噬菌体产物。
BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	制备滴定用平板。
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分。
羧苄青霉素二钠盐，89.0–100.5% 无水物	Millipore-Sigma	C1389-5G	培养噬粒感染的细胞。
Compact Digital 微孔板振荡仪	Fisher Scientific	11-676-337	与噬菌体文库共孵育期间振荡微孔板。
Corning 微孔板铝封膜	Fisher Scientific	07-200-684	密封噬菌体甘油保存液。
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	制备滴定用平板。
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	蛋白质浓度测定。
Greiner Bio-One CellStar 96孔未处理U型底微孔板	Fisher Scientific	7000133	储存噬菌体甘油保存液。
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	噬菌体洗脱。
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coli	Fisher Scientific	C854003	用于噬菌体感染的细菌菌株。
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	培养M13K07辅助噬菌体感染的细胞。
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	介导噬粒的包装与分泌。
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	细菌培养。
Nunc MaxiSorp 96孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	固定蛋白质。
磷酸盐缓冲液（PBS）10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬介质。
ELISA及孵育用聚酯薄膜	VWR	60941-120	孵育期间覆盖微孔板。
聚乙二醇8000（PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀。
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀。
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Fisher Scientific	14-956-1D	培养噬菌体输入样本。
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 E. coli OmniMax 细胞。
Tris碱	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱后的噬菌体溶液。
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基组分。
吐温20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分。
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基组分。