使用斑马鱼鉴定色素沉着调节因子的反向遗传方法

摘要

黑色素细胞功能的调节剂控制色素沉着结果的可见差异。破译候选色素沉着基因的分子功能是一项挑战。在这里，我们演示了使用斑马鱼模型系统来识别候选者并将其分类为黑色素含量和黑色素细胞数量的调节因子。

摘要

黑色素细胞是存在于表皮皮肤中的特化神经嵴衍生细胞。这些细胞合成黑色素色素，保护基因组免受有害紫外线辐射。黑色素细胞功能的紊乱导致色素性疾病，如花斑病、白化病、白癜风、黄褐斑和黑色素瘤。斑马鱼是了解黑色素细胞功能的优秀模型系统。明显的色素黑色素细胞的存在、易于遗传操作以及转基因荧光系的可用性有助于色素沉着的研究。本研究采用野生型和转基因斑马鱼系，在标记黑色素细胞不同阶段的 mitfa 和 tyrp1 启动子下驱动绿色荧光蛋白 （GFP） 表达。

基于吗啉基的候选基因沉默，以评估幼虫色素沉着的表型结果，适用于色素沉着调节因子的筛选。该协议展示了从显微注射到成像和荧光激活细胞分选（FACS）基于表型解剖的方法，使用两个候选基因碳酸酐酶14（Ca14）和组蛋白变体（H 2afv），以全面评估色素沉着结果。此外，该协议展示了将候选基因分离为黑色素细胞说明符和分化因子，分别选择性地改变每个细胞的黑色素细胞数量和黑色素含量。

引言

虽然黑色素用于光保护的使用在整个动物王国中已经发展了几次，但脊椎动物似乎已经完善了这一过程。具有合成和含有黑色素的精密机器的专用色素产生细胞从鱼到人类都是保守的¹。然而，色素沉着的结果差异很大，从颜色到颜色不等，并在外皮、皮肤和头发上呈现生动的图案².尽管存在多样性，但参与色素沉着反应的基因库却非常保守。黑色素合成机制的核心成分，如关键的黑色素合成酶、黑色素体的成分以及与信号通路的上游连接，在生物体之间基本相同。微妙的遗传差异导致跨物种观察到的色素沉着模式发生巨大变化³.因此，在低等脊椎动物生物斑马鱼（Danio rerio）中进行的反向遗传方法为破译基因参与呈现^{色素状态提供了}绝佳的机会4。

斑马鱼胚胎在受精后~24小时（hpf）的时间内从单细胞受精受精卵发育为幼虫⁵。引人注目的是，黑色素细胞等效细胞 - 黑色素载体 - 是存在于真皮中的大细胞，由于黑色^素含量深6而显眼。这些神经嵴衍生的细胞发出~11 hpf并开始色素~24 hpf^6，7。保守的基因表达模块能够鉴定协调黑色素细胞功能的关键因子，并导致转基因荧光报告系Tg（sox10:GFP），Tg（mitfa:GFP）和Tg（ftyrp1:GFP）⁸，⁹，¹⁰的发展^，这些细胞系标记黑色素细胞发育的选择阶段。使用这些转基因鱼系可以在组织环境中的生物体水平上询问黑色素细胞的细胞生物学，并根据发育时间表提供适当的线索。这些报告器补充了基于色素的黑色素细胞定量，无论黑色素含量如何，都可以对黑色素细胞数量进行不同的评估。

本文通过评估两个关键参数（即黑色素含量和黑色素细胞数量）来破译黑色素细胞生物学的详细方案。虽然前者是由色素减退反应引起的常见功能读数，但后者与黑色素细胞规格或存活率的降低有关，并且通常与遗传或获得性色素脱失有关。这种反向遗传筛选的总体策略是使用吗啉诺沉默选定的基因并研究黑色素细胞特异性结果。使用基于图像的平均灰度值定量分析黑色素含量，然后使用黑色素含量测定进行确认。使用基于图像的定量分析成熟不同阶段的黑色素细胞数量，并使用FACS分析进一步确认。在这里，使用两个候选基因（即参与黑色素生成的碳酸酐酶 14）和参与神经嵴前体群体黑色素细胞规格的组蛋白变体 H2AFZ.2 来证明筛选方案。前者改变黑色素含量而不是黑色素细胞数量，后者改变指定黑色素细胞的数量，从而改变胚胎中的黑色素含量。总之，该方法提供了一个详细的方案来识别候选基因在色素沉着中的作用，并区分其在控制黑色素细胞数量与黑色素含量中的作用。

方案

斑马鱼实验严格按照印度CSIR-基因组学和综合生物学研究所（IGIB）的机构动物伦理批准（IAEC）进行（提案第45a号）。尽一切努力尽量减少动物的痛苦。

1. 将吗啉素注射到斑马鱼胚胎中

1. 使用标准拔针器，抽出非常锋利和封闭的移液管。
2. 使用微量加载器尖端将含有吗啉诺的溶液装入微量移液器中，并将其插入微量进样器装置中。正确拧紧螺钉以锁定微量移液器。
   注意:吗啉诺的剂量标准化是必要的。适当剂量的存活率为>70%，特定表型为24 hpf。
3. 使用细镊子切割微量移液器的尖端并校准¹¹.
4. 为了校准，从微量移液器将1体积的吗啉基溶液注入毛细管中，将注射时间保持在1秒。重复此操作五次。使用标准，1 mm = 30 nL 体积，通过将毛细管保持在测量刻度上，在 5 秒内找到注入的体积。使用上述信息，计算每次进样1-3nL所需的时间（以秒为单位）¹².
   注意:标准 1 mm = 30 nL 特定于用于校准的微进样器压力设置和毛细管直径。理想情况下，必须将注射到卵黄细胞界面中，该界面在受精后15-20分钟内形成。为了促进多次注射，通过将胚胎保持在较低的温度（18°C）可以稍微延迟发育。然而，由于较低温度对基因表达变化的复合效应，这应保持在最低限度，并且不会超过30分钟。
5. 将胚胎安装在琼脂糖铸型培养皿（60毫米）上。将胚胎紧紧地堆叠在脊内。使用火抛光玻璃移液器，将它们对准正确的方向进行注射。
6. 在显微镜下，使用操纵器使微量移液器更接近胚胎，并通过按下脚踏开关注入卵黄细胞界面。
7. 以类似的方式注射所有胚胎;将它们收集在含有新鲜胚胎水培养基的培养皿中，并在28°C下孵育。
8. 6-8小时后检查注射的胚胎。去除所有由于其高不透明度而可识别的死胚胎，并每天至少更换一次胚胎水以避免感染。

2. 色素沉着分析

1. 计数 3 dpf 斑马鱼胚胎中侧中线黑色素细胞的制备
   1. 用0.016%神经肌肉麻醉剂治疗胚胎以固定它们。
   2. 为了安装胚胎进行成像，在培养皿（60毫米）中加入几毫升1.5-2%甲基纤维素，使其形成薄层。使用巴斯德移液管，挑选胚胎并将其轻轻放置在甲基纤维素中，以限制成像过程中的进一步移动。
   3. 调整其位置以获得最佳侧向（背条纹、腹侧条纹、卵黄条纹和中线黑色素细胞）或背侧（头部背侧的黑色素细胞）成像。为了更好地分离相邻的黑色素细胞，请在更高的放大倍率（>5x）下成像
2. 明场成像
   注意:明场成像是使用具有8-10倍放大倍率的体视显微镜进行的。
   1. 将含有斑马鱼胚胎的培养皿放在显微镜下。使用操纵器，以这样的方向调整鱼，以便同时看到所有五个黑色素细胞胚胎条纹（背侧，腹侧，两个侧侧，蛋黄）（图1C）。使用采集软件快速捕获图像。如果动物在成像之前恢复运动，请将其重新浸入麻醉剂中，并在充分固定后进行成像。
   2. 对所有鱼重复此操作，并确保每个图像的放大倍率保持不变。
3. 使用 ImageJ 软件计算平均灰度值
   1. 拍摄 2 个 dpf 斑马鱼胚胎的背侧和侧向图像。
   2. 使用 "打开 "工具在 ImageJ 中打开要量化的图像。使用 手绘形状 工具勾勒出要分析的区域。转到 设置度量 选项，然后选择 平均灰度值|面积。按 M （或 "分析|测量）以计算所选区域的平均灰度值。
   3. 保持要分析的区域恒定，分别计算每只动物的平均灰色区域。
   4. 使用采集的数据绘制条形图（图2F）。
4. 黑色素含量测定
   1. 在 2 dpf 下，使用玻璃巴斯德移液管收集 ~25 个斑马鱼胚胎。
   2. 使用 1 mL 胰岛素针进行手动去皮，并将其添加到 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 小心丢弃胚胎培养基，并加入 1 mL 冰冷的裂解缓冲液（20 mM 磷酸钠 （pH 6.8）、1% Triton X-100、1 mM PMSF、1 mM EDTA）和蛋白酶抑制剂混合物，并通过超声处理制备蛋白质裂解物。
   4. 将裂解物溶解在 1 mL 的 1 N NaOH 中，并将样品在 100 °C 下在水浴中孵育 50 分钟。间歇性地涡旋以完全匀浆裂解物。
   5. 使用分光光度计在490nm处读取样品的吸光度读数。
   6. 通过将样品吸光度与已知浓度的合成黑色素的标准曲线进行比较来计算黑色素含量（图2G）。

3. 黑色素细胞计数

注意:转基因斑马鱼胚胎中的荧光分析可以通过两种方法进行:1）计数GFP阳性细胞;2）测量荧光强度。

1. 早期斑马鱼胚胎中基于FACS的GFP阳性细胞计数的制备
   1. 收集200-250 ftyrp:GFP胚胎，并使用普通胚胎水在过滤器中洗涤它们。作为阴性对照，处理GFP阴性，阶段匹配的野生型（阿萨姆野生型）胚胎¹²。
   2. 根据感兴趣的阶段，将胚胎转移到含有0.6mg / mL蛋白酶的培养皿中。5-10分钟后，使用巴斯德移液管将去皮的胚胎转移到含有普通胚胎水的新鲜培养皿中。使用玻璃巴斯德移液管收集~100个胚胎并将其转移到2 mL微量离心管中。
   3. 小心丢弃培养基，加入 200 μL 冰冷的林格氏溶液（脱脂缓冲液）。将试管放在冰上，上下移液内容物~20次，直到蛋黄溶解。在4°C的台式离心机中以100× g 离心管1分钟。 再次离心并小心地弃去上清液。
   4. 使用 1 mL 移液管，将脱卵胚胎转移到含有 10 mL 胰蛋白酶溶液（细胞解离缓冲液）的培养皿中。在多个培养皿中进行，以避免胚胎过度拥挤和胰蛋白酶消化效率低下。使用 1 mL 移液器，将含有胚胎体的溶液混合一次或两次以减少聚集。
   5. 将培养皿在室温下孵育15分钟（<24hpf胚胎）或30分钟（24-30hpf胚胎）。偶尔使用 1 mL 移液器吸出并分配悬浮液，以帮助细胞崩解。
   6. 在孵育期间，初始化流式细胞仪进行细胞计数。
   7. 将 70 μm 细胞过滤器置于 50 mL 锥形管上方，并将胰蛋白酶化的悬浮液通过过滤器以获得单细胞悬液。用相同的悬浮液清洗培养皿几次，以去除粘附在表面上的细胞。
   8. 在水平吊桶转子中以450× g，4°C旋转样品5分钟。
   9. 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL冰冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
   10. 再次在450× g，4°C下旋转5分钟，弃去上清液。
   11. 最后，将沉淀重悬于PBS + 5%胎牛血清中，并将其保持在冰上，直到FACS运行。
2. 准备流式细胞仪
   1. 打开流式细胞仪并开始启动。
      注意: 在打开机器之前，请清空垃圾箱并填充护套液罐。
   2. 对 70 μm（或 85 μm）喷嘴的流流进行归一化。如果不稳定，请将其不受干扰10-15分钟。
3. 使用流式细胞仪计数荧光标记的细胞
   1. 初始化新的实验文件夹，并制作前向散射与侧向散射的散点图以及异硫氰酸荧光素 （FITC） 强度的直方图。
   2. 首先加载百搭型单元以设置前向和侧向散射门（以排除双峰和碎片）和 FITC阈值。
   3. 设置门后，取出样品并加载从Tg（ftyrp1:GFP）胚胎中分离的细胞以计数黑色素细胞。
      注意:在这里，由于 ftyrp1:GFP特异性标记成熟的黑色素细胞，FITC门下的GFP阳性细胞数量将与黑色素细胞的数量相对应。
   4. 用吗啉诺注射的样品重复上述步骤，以估计并与对照组比较黑色素细胞的数量。
4. 测量斑马鱼胚胎中的荧光强度
   1. 使用玻璃巴斯德移液管，收集100-120个胚胎并将它们转移到含有普通胚胎水的培养皿中。
   2. 在~10-12 hpf下，将胚胎转移到0.003%的1-苯基-2-硫脲中以抑制色素沉着。
   3. 使用胰岛素针进行手动去皮，对<48 hpf胚胎进行成像。
   4. 要固定胚胎，请用0.016%的三卡因处理它们。
   5. 要安装胚胎进行成像，请将几毫升1.5-2%甲基纤维素放入培养皿（60毫米）中，使其形成薄层。将胚胎添加到甲基纤维素中以限制成像过程中的任何进一步运动。将含有样品的培养皿放在显微镜下。使用移液器吸头，以所需的方向调整动物。
   6. 使用采集软件采集图像。对于 <24 hpf 的胚胎，在 10 倍放大镜下立即捕获整个胚胎。对于>24 hpf载物台，获取多个扫描区域，然后将它们组装（缝合）在一起。
   7. 对所有鱼重复此操作，并确保在整个实验过程中采集设置保持不变。
5. 量化
   1. 使用 ImageJ 软件进一步分析图像。
   2. 使用 "打开 "工具在 ImageJ 中打开要量化的图像。
   3. 使用 手绘形状 工具勾勒出要分析的区域（图3E）。
   4. 按 M （或 "分析|测量）以获取 选定的区域 强度测量值。
   5. 保持要分析的区域恒定，分别计算每只动物的每个区域的平均强度。

结果

图1中描述的工作流程用于在斑马鱼单细胞阶段进行基于吗啉基的遗传扰动。如下所述，使用各种方法进行色素沉着分析。为了说明代表性结果，在斑马鱼胚胎的卵黄或单细胞阶段注射了靶向h2afv和ca14基因的标准化体积的反义吗啉素。基于明场成像的初始表型在受精后48小时（hpf）进行，当时所有五个色素黑色素细胞条纹（背侧，腹侧，卵黄，两个侧侧）都很明显。

图2A，B 表示一种通过计算每个胚胎的侧黑色素细胞数量来分析色素沉着的方法。通过放大倾斜斑马鱼的侧面区域，在 48 hpf 阶段手动计数横向黑素细胞。量化色素黑色素载体的另一种方法（补充图S1）涉及通过对斑马鱼的背视图进行成像来手动计数头部黑色素细胞。

每个胚胎的黑色素含量是通过测量平均灰度值来计算的，在 ImageJ 软件的帮助下保持感兴趣的区域恒定。

讨论

色素沉着表型通常表现为黑色素含量或含色素黑色素细胞数量的改变。本文描述的方法允许解剖这种二分法，并允许对黑色素含量和每个胚胎的黑色素载体数量进行定性和定量评估，而与黑色素含量无关。斑马鱼的高繁殖力、色素黑色素细胞的可见性质以及缺乏黑色素体转移使得使用这种适合中等通量筛选的反向遗传方法解剖黑色素细胞生物学成为可能。

选择基于吗啉诺的沉默源于沉默的便利性和并行测试多个候选物的能力。使用基于吗啉诺的沉默方法存在一定的局限性，前面已经描述了使用和解释这些有价值的工具的指南¹³。从本质上讲，使用多个MO敲低时验证表型为这个问题提供了一个切实的解决方案。另一种策略是使用基于CRISPR的遗传扰动。由于遗传事件的频率固有较低，表型的外显率受到限制，并且可能因异质突变而加剧。这限制了其用于反向基因筛查¹⁴。

黑色素细胞选择性扰动的表型评估通常会导致由于黑色素生成反应改变而导致色素含量降低。然而，有几个基因扰乱了黑色素细胞的规格，因此由于整体黑色素细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微管	Axygen	MCT-150-A	用于制备 MO 溶液
2 mL 微管	Axygen	MCT-200-C	用于 FACS 方案中的洗涤步骤
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	用于显微注射
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	用于细胞分选
毛细管	Drummond	1-000-0010
康宁细胞过滤器	康宁	CLS431751	用于制备单细胞悬液
DMEM 高葡萄糖培养基	Sigma-Aldrich	D5648	FACS 方案
3-氨基苯甲酸乙酯 甲磺酸盐（三卡因）	Sigma-Aldrich	E10521-50G	固定 ZF 用于成像
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 （EDTA）	Sigma-Aldrich	E5134	用于冷裂解缓冲液
FACS 管	BD-Biosciences 342065		FACS 协议
胎牛血清 （FBS）	Invitrogen	10270	FACS 协议
Graphpad 棱镜软件	Graphstats 技术	NA	用于数据表示
ImageJ 软件	国立卫生研究院	NA	用于图像分析
胰岛素注射器 （1 mL）	DispoVan	NA	用于手动去绒毛
黑色素，合成	Sigma-Aldrich	M8631	用于黑色素含量测定
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M7027-250G	用于固定 ZF 用于成像
Microloader 吸头	Eppendorf	5242956003	用于显微注射
Morpholino	Gene-tools	NA	用于敲低实验
N-苯硫脲 （PTU）	Sigma-Aldrich	P7629	抑制黑色素形成
拔针器	萨特仪器	P-97	用于显微注射
Nunc 15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS 方案
Petridish （60 mm）	Tarsons	460090	用于胚胎板
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	10837091001	用于冷裂解缓冲液
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	HiMedia	TL1099-500mL	用于洗涤细胞
链霉蛋白酶	Sigma-Aldrich	53702	用于去绒毛膜蛋白酶
抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	用于冷裂解缓冲液
鞘液体	BD FACSFlowTM	342003	FACS 方案
磷酸钠	Merck	7558-79-4	冷裂解缓冲液
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	用于冷裂解缓冲液
TrypLE	Gibco	1677119	用于胰蛋白酶消化