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方法文章

利用斑马鱼鉴定色素调控因子的反向遗传学方法

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DOI：

10.3791/62955

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2022年3月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research, 3Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

黑色素细胞功能的调控因子决定了色素沉着表型的可见差异。解析候选色素基因的分子功能具有挑战性。本文中，我们展示了利用斑马鱼模型系统来鉴定候选基因，并将其分类为黑色素含量和黑色素细胞数量的调控因子。

摘要

黑色素细胞是存在于表皮皮肤中的一类特化的神经嵴来源细胞。这些细胞合成黑色素，可保护基因组免受有害紫外线辐射的损伤。黑色素细胞功能异常会导致色素性疾病，如斑驳病、白化病、白癜风、黄褐斑和黑色素瘤。斑马鱼是研究黑色素细胞功能的优良模型系统。其明显的色素性黑色素细胞、易于进行遗传操作以及存在多种转基因荧光品系，均有利于色素沉着的研究。本研究采用野生型及转基因斑马鱼品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）在mitfa和tyrp1启动子驱动下表达，标记黑色素细胞的不同发育阶段。

通过基于吗啉代的候选基因沉默技术，评估幼虫色素沉着的表型结果，并可用于筛选色素沉着调控因子。本方案以碳酸酐酶14（Ca14）和组蛋白变体（H2afv）两个候选基因为例，系统演示从显微注射到成像以及基于荧光激活细胞分选（FACS）的表型解析方法，全面评估色素沉着效应。此外，本方案还展示了如何将候选基因区分为黑素细胞决定因子和分化因子，前者选择性改变黑素细胞数量，后者则特异性影响单个细胞内的黑色素含量。

引言

尽管动物界中多次独立演化出了利用黑色素进行光保护的现象，但脊椎动物似乎已将这一过程发展至完善。从鱼类到人类，均保守存在专门的色素生成细胞，这些细胞具备复杂的机制来合成并储存黑色素1。然而，色素沉着的结果却表现出显著差异，其颜色、分布范围以及在表皮、皮肤和毛发上的呈现形式多种多样，形成鲜明的图案2。尽管表型多样，参与色素沉着反应的基因集合却惊人地保守。黑色素合成机制的核心组分，例如关键的黑色素合成酶、黑色体的组成成分以及与上游信号通路的连接方式，在不同生物中基本相同。微小的遗传差异即可导致不同物种间色素分布模式的巨大变化3。因此，在一种低等脊椎动物——斑马鱼（Danio rerio）中采用反向遗传学方法，为解析基因在形成色素表型中的作用提供了极佳的研究途径4。

斑马鱼胚胎在受精后约24小时内（hpf）从单细胞的受精合子发育为幼虫5。值得注意的是，相当于黑色素细胞的黑色素细胞（melanophores）是存在于真皮中的大细胞，因其富含深色的黑色素而十分明显6。这些源自神经嵴的细胞大约在11 hpf时出现，并在约24 hpf时开始产生色素6,7。保守的基因表达模块有助于鉴定调控黑色素细胞功能的关键因子，并推动了转基因荧光报告品系Tg(sox10:GFP)、Tg(mitfa:GFP)和Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10的发展，这些品系可标记黑色素细胞发育的特定阶段。利用这些转基因鱼品系，可以在组织环境中依据发育时间轴，结合适当的信号，在整体生物水平上研究黑色素细胞的细胞生物学特性。这些报告系统补充了基于色素的黑色素细胞定量方法，使得在不受黑色素含量影响的情况下，独立评估黑色素细胞数量成为可能。

本文提供了一种详细的研究方案，通过评估两个关键参数——黑色素含量和黑色素细胞数量，来解析黑色素细胞的生物学特性。前者是色素减退反应中常见的功能读出指标，后者则与黑色素细胞的特化或存活减少相关，通常出现在遗传性或获得性脱色疾病中。该反向遗传学筛选的整体策略是利用吗啉代寡核苷酸（morpholino）沉默特定基因，并研究其对黑色素细胞的特异性影响。黑色素含量通过基于图像的平均灰度值定量分析进行评估，并进一步通过黑色素含量测定实验加以验证。不同成熟阶段的黑色素细胞数量通过基于图像的定量分析进行评估，并通过流式细胞术（FACS）分析进一步确认。本文以两个候选基因为例演示了该筛选流程：其一是参与黑色素生成的碳酸酐酶14（carbonic anhydrase 14），其二是参与神经嵴前体细胞向黑色素细胞特化过程的组蛋白变体H2AFZ.2。前者改变黑色素含量但不影响黑色素细胞数量，后者则改变特化黑色素细胞的数量，从而继发影响胚胎中的黑色素含量。综上所述，该方法提供了一套详细的实验流程，可用于鉴定候选基因在色素沉着中的作用，并区分其在调控黑色素细胞数量与黑色素含量中的不同功能。

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方案

斑马鱼实验严格遵循印度CSIR-基因组学与综合生物学研究所（IGIB）的机构动物伦理批准（IAEC）（提案编号45a）。所有努力均旨在最大程度减少动物痛苦。

1. 向斑马鱼胚胎注射吗啉代寡核苷酸

  1. 使用标准的拉针仪，拉制出尖端非常尖锐且闭合的移液管。
  2. 使用微量移液器吸头将含有吗啉寡核苷酸（morpholino）的溶液装入微移液管中，并将其插入显微注射装置。适当拧紧螺丝以固定微移液管。
    注意：必须进行吗啉寡核苷酸的剂量标准化。合适的剂量应使胚胎在24 hpf时的存活率超过>70%，并表现出特异性表型。
  3. 使用精细镊子剪断微移液管的尖端，并进行校准11。
  4. 校准时，通过微移液管将一份体积的吗啉寡核苷酸溶液注入毛细管中，注射时间保持为1秒。重复此操作五次。根据标准换算关系（1 mm = 30 nL），将毛细管对准刻度尺，测量5秒内注入的液柱长度，从而确定注入体积。利用上述数据，计算每次注射1–3 nL所需的时间（单位为秒）12。
    ​注意：标准换算关系“1 mm = 30 nL”仅适用于校准时所用的显微注射仪压力设置及特定直径的毛细管。理想情况下，注射应靶向卵黄-细胞交界处，该结构在受精后15–20分钟内形成。为便于进行多次注射，可通过将胚胎维持在较低温度（18 °C）来轻微延缓其发育。然而，由于低温会对基因表达变化产生累积效应，因此延迟时间应尽可能缩短，且不得超过30分钟。
  5. 将胚胎固定在琼脂糖包埋的培养皿（60 mm）中，使胚胎紧密排列于凹槽内。使用火焰抛光的玻璃移液管将胚胎调整至适合注射的正确方向。
  6. 在显微镜下，使用操纵器将微移液管移近胚胎，并通过踩下脚踏开关将溶液注入卵黄-细胞交界处。
  7. 以相同方式完成所有胚胎的注射；将注射后的胚胎收集至含有新鲜胚胎培养液的培养皿中，并在28 °C条件下孵育。
  8. 注射后6–8小时检查胚胎状态，清除因高度不透明而可识别的死亡胚胎，并每天至少更换一次胚胎培养液，以防感染。

2. 色素分析

  1. 3 dpf 斑马鱼胚胎中线侧黑素细胞计数的准备工作
    1. 使用 0.016% 神经肌肉麻醉剂处理 胚胎，使其固定不动。
    2. 为将胚胎固定用于成像，在培养皿（60 mm）中加入几毫升 1.5–2% 甲基纤维素，使其形成一层薄层。使用巴斯德移液管吸取胚胎，并轻轻将其置于甲基纤维素中，以限制成像过程中的进一步移动。
    3. 调整胚胎位置，以便获得最佳的侧面（背侧条纹、腹侧条纹、卵黄条纹及中线黑素细胞）或背侧（头部背侧区域的黑素细胞）成像效果。为更清晰地分辨相邻的黑素细胞，应使用较高倍率（>5x）进行成像。
  2. 明场成像
    注意：明场成像使用体视显微镜在 8–10x 放大倍率下进行。
    1. 将含有斑马鱼胚胎的培养皿置于显微镜下。使用操作器调整鱼体方向，使全部五条黑素细胞胚胎条纹（背侧、腹侧、两条侧线、卵黄）同时可见（图 1C）。使用采集软件快速拍摄图像。若动物在成像前恢复活动，需重新将其浸入麻醉剂中，并在其充分固定后继续成像。
    2. 对所有鱼 重复此操作，并确保每张图像的放大倍率保持一致。
  3. 使用 ImageJ 软件计算平均灰度值
    1. 获取 2 dpf 斑马鱼胚胎的背侧和侧面图像。
    2. 使用打开工具在 ImageJ 中打开待定量图像。使用自由手绘形状工具勾勒分析区域。进入设置测量值选项，选择平均灰度值 | 面积。按下M键（或选择分析 | 测量），计算所选区域的平均灰度值。
    3. 保持分析区域大小恒定，分别计算每条鱼的平均灰度值。
    4. 使用获得的数据绘制柱状图（图 2F）。
  4. 黑色素含量测定
    1. 在 2 dpf 时，使用玻璃巴斯德移液管收集约 25 条斑马鱼胚胎。
    2. 使用 1 mL 胰岛素针头进行手动去壳，并将胚胎转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    3. 小心弃去胚胎培养液，加入 1 mL 冰冷裂解缓冲液（20 mM 磷酸钠（pH 6.8）、1% Triton X-100、1 mM PMSF、1 mM EDTA），并加入蛋白酶抑制剂混合物，通过超声处理制备蛋白裂解液。
    4. 将裂解物溶解于 1 mL 1 N NaOH 中，并在水浴中 100 °C 孵育 50 分钟。间歇性涡旋震荡，以确保裂解物完全均质化。
    5. 使用分光光度计在 490 nm 处测定样品的吸光度。
    6. 通过将样品吸光度与已知浓度合成黑色素的标准曲线进行比较，计算黑色素含量（图 2G）。

3. 黑色素细胞计数

注意：转基因斑马鱼胚胎中的荧光分析可通过两种方法进行：1）计数GFP阳性细胞；2）测量荧光强度。

  1. 基于FACS的早期斑马鱼胚胎中GFP阳性细胞计数的准备工作
    1. 收集 200–250 ftyrp:GFP 胚胎用普通胚胎水通过滤网冲洗。作为阴性对照，处理不表达 GFP 的、发育阶段匹配的野生型（Assam Wildtype）胚胎12.
    2. 根据所需发育阶段，将胚胎转移至含有 0.6 mg/mL 链霉蛋白酶的培养皿中。5–10 分钟后，使用巴斯德吸管将去壳胚胎转移至另一新鲜培养皿中，内含普通胚胎水。使用玻璃巴斯德吸管收集约 100 个胚胎，并转移至 2 mL 微离心管中。
    3. 小心弃去上清液，加入 200 µL 冰冷的林格氏液（去卵黄缓冲液）。保持离心管置于冰上，用移液器吹打管内液体约 20 次，直至卵黄完全溶解。将离心管以 100 × g 在4 °C下，于台式离心机中离心1分钟。再次离心，并小心弃去上清液。
    4. 使用1 mL移液器将去卵黄囊的胚胎转移至含有10 mL胰蛋白酶溶液（细胞解离缓冲液）的培养皿中。为避免胚胎过于密集导致胰蛋白酶消化效率降低，应在多个培养皿中分别进行操作。使用1 mL移液器将含有胚胎团块的溶液轻柔吹打混匀一至两次，以减少聚集。
    5. 将培养皿在室温下孵育15分钟（<24 hpf 胚胎）或 30 分钟（24–30 hpf 胚胎）。使用 1 mL 移液器偶尔吸吹悬浮液，以促进细胞解离。
    6. 孵育期间，启动流式细胞仪以进行细胞计数。
    7. 将70 µm细胞筛置于50 mL锥形管上方，将胰蛋白酶消化后的细胞悬液过筛，以获得单细胞悬液。用同一悬液反复冲洗培养皿数次，以去除黏附在表面的细胞。
    8. 将样品在450 × g，4 °C 下以摆桶转子离心 5 分钟。
    9. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    10. 再次以 450 × g，4 °C 下离心 5 分钟，弃去上清液。
    11. 最后，将沉淀重悬于含5%胎牛血清的PBS中，冰上保存直至进行流式细胞术检测。
  2. 准备流式细胞仪
    1. 打开流式细胞仪并启动开机程序。
      ​注意：开机前，清空废液桶并注满鞘液箱。
    2. 为70 µm（或85 µm）喷嘴调节液流至稳定状态。若液流不稳定，静置10–15分钟。
  3. 使用流式细胞仪计数荧光标记细胞
    1. 新建一个实验文件夹，绘制前向散射光与侧向散射光的散点图，以及异硫氰酸荧光素（FITC）强度的直方图。
    2. 首先上样野生型细胞，以设定前向角散射和侧向角散射门（用于排除双联体和碎片）以及FITC阈值。
    3. 设定门控后，移除样本，加入从 Tg(ftyrp1:GFP) 胚胎中分离的细胞，以计数黑色素细胞。
      注意：此处，作为 ftyrp1GFP 特异性标记成熟的黑色素细胞，因此在FITC通道下GFP阳性细胞的数量即对应于黑色素细胞的数量。
    4. 用注射了吗啉寡核苷酸的样品重复上述步骤，以估算并比较与对照组相比的黑色素细胞数量。
  4. 测量斑马鱼胚胎中的荧光强度
    1. 使用玻璃巴斯德吸管收集100–120枚胚胎，并转移至含有普通胚胎水的培养皿中。
    2. 在约10-12 hpf时，将胚胎转移至0.003% 1-苯基-2-硫脲中以抑制色素形成。
    3. 使用胰岛素针进行人工去卵膜以用于成像 <48 hpf 胚胎
    4. 为固定胚胎，使用0.016%三卡因处理。
    5. 为成像准备胚胎时，将几毫升1.5–2%的甲基纤维素加入培养皿（60 mm）中，使其形成一层薄层。将胚胎置于甲基纤维素中，以限制成像过程中任何进一步的移动。将含有样本的培养皿置于显微镜下。使用移液器吸头调整胚胎至所需的方向。
    6. 使用采集软件获取图像。对于胚胎 <24 hpf时，在10倍放大倍数下一次性捕获整个胚胎。对于 >24 hpf 时期，获取多个扫描视野，随后将它们拼接在一起。
    7. 对所有鱼类重复此操作，并确保整个实验过程中采集参数设置保持恒定。
  5. 定量分析
    1. 使用 ImageJ 软件进一步分析图像。
    2. 使用 ImageJ 打开待量化的图像 打开 工具
    3. 使用 徒手绘图 用于划定分析区域的工具（图3E).
    4. 按压 M 或 分析 | 测量以获得一个 选定区域 强度测量
    5. 在保持待分析区域恒定的情况下，分别计算每只动物单位面积的平均强度。

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结果

文中所述的工作流程 图1 用于在斑马鱼单细胞阶段进行基于吗啉代的基因扰动。如后文所述，采用多种方法进行色素沉着分析。为展示代表性结果，使用了靶向的反义吗啉代寡核苷酸的标准体积 h2afv 和 ca14 将基因注射至斑马鱼胚胎的卵黄或单细胞期。基于明场成像的初步表型分析在受精后48小时（hpf）进行，此时五条具色素的黑色素细胞条纹（背侧、腹侧、卵黄、两条侧线）均已清晰可见。

图2A、B 展示了一种通过计算每个胚胎体侧黑色素细胞数量来分析色素沉着的方法。在48 hpf阶段，通过放大倾斜的斑马鱼体侧区域，手动计数体侧黑色素细胞。另一种量化色素化黑色素细胞的方法（补充图S1）涉及对斑马鱼背侧视图进行成像，手动计数头部黑色素细胞。

通过测量灰度平均值并借助ImageJ软件保持感兴趣区域恒定，计算每个胚胎的黑色素含量。...

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讨论

色素沉着表型通常表现为黑色素含量或含色素黑色素细胞数量的变化。本文所述方法能够区分这两种情况，允许对每个胚胎中黑色素的含量以及黑色素细胞的数量进行定性和定量评估，且不受黑色素含量的影响。斑马鱼具有繁殖力高、黑色素细胞色素可见性强以及不存在黑素体转移的特点，因此可利用这种适用于中等通量筛选的反向遗传学方法来深入研究黑色素细胞的生物学特性。

选择基于吗啉代的沉默技术源于其操作简便以及能够平行测试多个候选分子。然而，基于吗啉代的沉默方法存在一定的局限性，此前已有文献对这些宝贵工具的使用和结果解读提供了指导原则13。从根本上说，通过使用多个吗啉代（MO）敲低后对表型进行验证，可为这一问题提供切实可行的解决方案。另一种策略是采用基于CRISPR的遗传扰动技术。由于遗传事件本身发生频率较低，且可能因突变的异质性而进一步加剧，该方法的表型外显率受到限制，从而制约了其在反向遗传筛选中的应用14。

黑色素细胞特异性扰动的表型评估通常因黑色素生成反应的...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

我们感谢科学与工业研究委员会通过项目MLP2008以及科学技术部通过项目GAP165为本论文所展示工作的资助支持。感谢Jeyashri Rengaraju和Chetan Mishra在实验方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微管AxygenMCT-150-A用于制备 MO 溶液
2 mL 微管AxygenMCT-200-C用于 FACS 方案中的洗涤步骤
琼脂糖Sigma-AldrichA-9539-500G用于显微注射
BD FACSAria IIBD BiosciencesNA用于细胞分选
毛细管Drummond1-000-0010
Corning 细胞筛CorningCLS431751用于制备单细胞悬液
DMEM 高糖培养基Sigma-AldrichD5648FACS 方案
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）Sigma-AldrichE10521-50G用于固定斑马鱼以进行成像
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）Sigma-AldrichE5134用于冷裂解缓冲液
FACS 管BD-Biosciences342065FACS 方案
胎牛血清（FBS）Invitrogen10270FACS 方案
Graphpad Prism 软件Graphstats TechnologiesNA用于数据呈现
ImageJ 软件美国国立卫生研究院NA用于图像分析
胰岛素注射器（1 mL）DispoVanNA用于手动去壳
合成黑色素Sigma-AldrichM8631用于黑色素含量检测
甲基纤维素Sigma-AldrichM7027-250G用于固定斑马鱼以进行成像
微量加样枪头（Microloader tips）Eppendorf5242956003用于显微注射
MorpholinoGene-toolsNA用于基因敲低实验
N-苯硫脲（PTU）Sigma-AldrichP7629用于抑制黑色素形成
拉针仪Sutter InstrumentP-97用于显微注射
Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific339650FACS 方案
培养皿（60 mm）Tarsons460090用于胚胎培养板
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-Aldrich10837091001用于冷裂解缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS）HiMediaTL1099-500mL用于洗涤细胞
蛋白酶 K（Pronase）Sigma-Aldrich53702用于去壳
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340用于冷裂解缓冲液
鞘液BD FACSFlowTM342003FACS 方案
磷酸钠Merck7558-79-4冷裂解缓冲液
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500ML用于冷裂解缓冲液
TrypLEGibco1677119用于胰蛋白酶消化

参考文献

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