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方法文章

开发用于野外测量线粒体能量学的移动式线粒体生理学实验室

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DOI：

10.3791/62956

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2021年8月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

本文内容

摘要

我们设计并构建了一个移动实验室，用于测量在野外捕获的野生动物分离线粒体的呼吸速率。本文介绍了移动线粒体实验室的设计与装备，以及相关的实验方案。

摘要

线粒体能量代谢是动物生物化学与生理学的核心主题，研究人员常以线粒体呼吸作为评估代谢能力的指标。为获得线粒体呼吸的测量数据，必须使用新鲜的生物样本，且整个实验操作需在约2小时内完成。此外，此类实验还需多种专用仪器设备。这为远离生理学实验室的野生动物组织中线粒体呼吸的测定带来了挑战，因为野外采集后的活体组织无法长期保存。此外，长距离运输活体动物会引发应激反应，进而可能改变线粒体的能量代谢状态。

本文介绍了奥本大学（Auburn University, AU）MitoMobile，这是一种可移动的线粒体生理学实验室，可运往野外并在现场使用，用于测量从野生动物采集的组织中的线粒体代谢。文中展示了该移动实验室的基本特征，以及测定分离线粒体呼吸速率的逐步方法。此外，所提供的数据验证了该移动线粒体生理学实验室的配置成功，并证实了在线粒体呼吸测定方面的可行性。该移动实验室的创新之处在于能够前往野外，对现场捕获动物的组织直接进行线粒体功能测定。

引言

迄今为止，旨在测量线粒体能量代谢的研究仅限于实验室动物或在已建立的生理学实验室附近捕获的动物，这使得科学家无法对动物在迁徙、潜水和冬眠等活动过程中采集的组织进行线粒体生物能量学研究1,2,3,4,5,6。尽管许多研究人员已成功测定了野生动物的基础代谢率、峰值代谢率以及每日能量消耗7,8，但研究人员对线粒体功能的测定能力仍然有限（但见1,4,9）。部分原因在于需要获取新鲜组织以分离线粒体，并且必须在获取新鲜组织后约2小时内于实验室内完成线粒体的分离。一旦线粒体被分离出来，应于约1小时内完成线粒体呼吸的测定。

通常通过测量连接至克拉克电极的密闭容器中的氧气浓度来测定分离线粒体的呼吸速率。该方法的理论基础在于一个基本观察：在氧化磷酸化过程中，氧气是线粒体呼吸的最终电子受体。因此，在实验过程中随着氧气浓度的下降，可推断三磷酸腺苷（ATP）正在生成10。消耗的氧气量可作为生成ATP量的间接指标。研究人员可利用不同底物建立特定的实验条件，并通过向反应室中加入预定量的二磷酸腺苷（ADP）来启动ADP刺激的呼吸（状态3）。当外源性ADP被磷酸化为ATP后，氧气消耗速率下降，系统进入状态4，该状态可被测量。此外，加入特定抑制剂可获得有关质子漏呼吸和解偶联呼吸的信息10。状态3与状态4的比值决定了呼吸控制比（RCR），该指标反映线粒体整体的偶联程度10,11。较低的RCR值表明线粒体功能障碍，而较高的RCR值则提示线粒体偶联程度更高10。

如前所述，生物样本的采集、线粒体的分离以及呼吸速率的测定必须在获取组织后2小时内完成。为了在不将动物长距离运输至固定实验室的情况下完成此项工作，专门建造了一个可移动的线粒体生理学实验室，以便前往野外现场进行数据采集。一辆2018款Jayco Redhawk房车被改装成一个可移动的分子生理学实验室，并命名为奥本大学（Auburn University, AU）MitoMobile (图1A)。选择房车是因为其自带冰箱、冷冻柜、储水箱和管道系统，电力由12伏电池、燃气发电机和丙烷罐提供，并配备自动调平系统。此外，该房车还支持在偏远地区过夜停留，便于开展持续的数据采集工作。车辆前部未作改动，保留了驾驶区和睡眠区 (图1B)。原车后部的卧室设施（床、电视和橱柜）以及炉灶已被拆除。

移除了卧室设施和炉灶，安装了定制的不锈钢货架，以及由80/20铝合金框架支撑的定制石英台面(图1C)。实验台提供了充足的数据采集空间(图1D)。在设计中充分考虑了每台设备（即制冷离心机、线粒体呼吸舱、酶标仪、计算机、匀浆器、天平、便携式超低温冰箱以及其他常规实验用品）的功耗。为满足离心机对高电压和大电流的需求，电力系统已升级至航空级标准。车辆后部的一个外部隔间被改造为液氮储存舱，符合美国交通部关于液氮储存与运输的规范。该储存单元采用不锈钢制造，并配备适当的通风装置，以防止膨胀的氮气泄漏至车辆的乘客舱内。

为了验证移动式实验室可用于线粒体生物能量学研究，本研究分离了野生来源的家鼠（Mus musculus）后肢骨骼肌中的线粒体，并测定了其线粒体呼吸速率。由于Mus musculus是一种模式生物，该物种的线粒体呼吸速率已有充分研究记录12,13,14。尽管已有研究报道过通过差速离心法分离线粒体的方法15,16,17，下文仍简要概述了在移动式线粒体生理学实验室中所采用的方法。

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方案

以下部分描述了线粒体实验室方法。所有动物操作和组织采集程序均经奥本大学机构动物护理和使用委员会批准（#2019-3582）。

1. 数据采集所用缓冲液的描述

注意：这些缓冲液可在固定实验室中配制，然后在野外考察前转移至移动实验室（除非下文另有说明）。

  1. 使用牛血清白蛋白（BSA）配制骨骼肌线粒体分离缓冲液，如图所示 表1.
    1. 将化学品溶解于去离子水（约 90% 体积）中 除了 对于无脂肪酸的BSA，将缓冲液置于冰箱中，直至温度降至4 °C。
    2. 在4 °C下将溶液pH值调节至7.5。
    3. 加入无脂肪酸的BSA，并加水至终体积100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
  2. 制备不含BSA的骨骼肌线粒体分离缓冲液，如所示 表1.
    1. 将化学物质溶解于去离子水（约总体积的90%）中。将缓冲液置于冰箱中，冷却至4 °C。
    2. 在4 °C下将溶液pH值调节至7.5。
    3. 将体积调至100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
  3. 按照所示配制骨骼肌重悬缓冲液 表1.
    1. 将化学物质溶解于去离子水中（约总体积的90%）。将缓冲液置于冰箱中，冷却至4 °C。
    2. 在4 °C下保持温度的同时，将溶液pH值调节至7.4。
    3. 将体积调至100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
  4. 按照所示方法配制骨骼肌呼吸缓冲液 表2.
    1. 将化学物质溶解于去离子水（约总体积的90%）中 除了 对于无脂肪酸的BSA，将缓冲液加热至37 °C。
    2. 在保持温度为 37 °C 的同时，将溶液 pH 调节至 7.0。
    3. 加入无脂肪酸的BSA，并加水至终体积为100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
  5. 按照所示方法制备呼吸底物 表2.
    1. 确保这些底物在数据收集当天用100 mM Tris-HCl（pH 7.4）新鲜配制，并在使用前置于冰上保存。
      ​注意：所提供的数值旨在配制足够浓度的溶液，以确保线粒体可摄取充足的底物。底物的终浓度分别为 2 mM 丙酮酸、2 mM 苹果酸、10 mM 谷氨酸和 5 mM 琥珀酸。

2. 线粒体分离操作（图2）

注意：线粒体分离和线粒体呼吸测定在移动实验室的实验台区域进行，所有溶液应置于 4 °C 保存，除非另有说明。

  1. 将移动实验室停放在平坦地面上。启动发电机并调平车辆。展开滑轨并设置设备。
  2. 解冻所需量的缓冲液。
    注意：通常每块肌肉需要30 mL含BSA的骨骼肌分离缓冲液和10 mL不含BSA的骨骼肌分离缓冲液。
  3. 根据制造商说明，将线粒体呼吸室设置并校准至实验所需的温度和当前大气压。实验所用具体呼吸室详见材料表。
  4. 通过断头法处死动物。
    注意：本研究采用断头法进行安乐死。某些气体（如二氧化碳和异氟烷）会影响线粒体功能18,19,20；在为每项研究选择最佳安乐死方法时应考虑这些影响。具体采用何种方法应由研究的科学问题决定。
  5. 切除骨骼肌，迅速去除脂肪和结缔组织，称重后将肌肉置于含BSA的骨骼肌分离缓冲液中（至少1/10 w/v）（例如，1 g骨骼肌加入10 mL缓冲液）。
  6. 在冰上用剪刀将骨骼肌剪碎。
  7. 使用剪去尖端的5 mL移液器吸头将剪碎的组织转移至50 mL离心管中。用刀片（见材料表）以50%功率匀浆5秒。加入蛋白酶（5 mg/g湿肌肉），消化7分钟，每30秒混匀一次。通过加入等体积含BSA的分离缓冲液终止反应。
  8. 将匀浆液在500 × g下离心10分钟。使用剪去尖端的5 mL移液器吸头将上清液通过双层纱布滤入干净的50 mL离心管中。将上清液在3,500 × g下离心10分钟，以沉淀出棕色线粒体沉淀。
  9. 倒掉剩余上清液。向离心管中加入与沉淀等体积的含BSA分离缓冲液。用柔性刮刀（警察刮刀）轻轻刮下管壁上的线粒体沉淀，重悬沉淀。在3,500 × g下离心10分钟。
  10. 倒掉剩余上清液。向离心管中加入与沉淀等体积的不含BSA的分离缓冲液。用洁净的警察刮刀轻轻刮下管壁上的线粒体沉淀，重悬沉淀。在3,500 × g下离心10分钟。
  11. 倾去上清液，用洁净的警察刮刀轻轻刮下管壁上的线粒体沉淀，将其重悬于重悬缓冲液中。
    注意：重悬缓冲液的体积取决于线粒体沉淀的大小。
  12. 使用另一支剪去尖端的1 mL移液器吸头，将重悬的线粒体转移至Dounce匀浆器中。使用Dounce匀浆器，小心地进行4–5次匀浆。
  13. 使用另一支剪去尖端的1 mL移液器吸头，将线粒体悬液转移至标记好的2 mL微量离心管中。

3. 线粒体呼吸作用测量（图3）

  1. 复合物 I 底物
    1. 向反应室中加入 945 µL 呼吸缓冲液。确保搅拌器正在旋转，并将缓冲液温度维持在 37 °C。开始数据采集的记录。
    2. 待氧浓度稳定后，加入 20 µL 线粒体，并盖上反应室盖子。在软件中注明已向反应室中加入线粒体。
    3. 使用不同的注射器分别向反应室中加入 10 µL 1 M 谷氨酸、10 µL 200 mM 苹果酸和 10 µL 200 mM 丙酮酸，等待信号稳定。在软件中注明底物已加入。
      注：这些底物通常用于测量碳水化合物驱动的呼吸作用。如需测量脂肪驱动的呼吸作用所用的其他底物组合，请参见21。
    4. 使用另一支注射器加入 5 µL ADP，观察快速的氧气消耗（状态 3）。在软件中注明已加入 ADP。
      注：在所加入的 ADP 被磷酸化后，氧气消耗速率将进入平台期，即状态 4。
    5. 在完成 4 分钟的状态 4 数据采集后，终止记录。保存数据文件。
  2. 复合物 II 底物
    1. 向反应室中加入 963 µL 呼吸缓冲液。确保搅拌器正在旋转，并将缓冲液温度维持在 37 °C。开始数据采集的记录。
    2. 待氧浓度稳定后，加入 20 µL 线粒体，并盖上反应室盖子。在软件中注明已向溶液中加入线粒体。
    3. 先使用一支注射器加入 2 µL 浓度为 4 µg/µL 的鱼藤酮，再使用另一支注射器加入 10 µL 500 mM 琥珀酸，等待信号稳定。在软件中注明底物已加入。
    4. 使用另一支注射器加入 5 µL ADP，观察快速的氧气消耗（状态 3）。在软件中注明已加入 ADP。
      注：在所加入的 ADP 被磷酸化后，氧气消耗速率将进入平台期，即状态 4。
    5. 在完成 4 分钟的状态 4 数据采集后，终止记录。保存数据文件。

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结果

本研究在移动式线粒体生理学实验室中检测了野生来源的 Mus musculus（n = 7，雄性 = 5，雌性 = 2；年龄 = 1.30 ± 0.2 年）的线粒体呼吸功能（图1）。为测定骨骼肌线粒体呼吸，采用整个后肢组织（包括有氧和无氧肌肉）进行线粒体分离（图2）。原始线粒体呼吸数据示例如 图3 所示。图3A 和 图3B 代表由复合物 I 驱动的线粒体呼吸。图3A 中观察到的陡峭斜率表示较高的最大呼吸速率，该数值用于后续数据分析。线粒体从后肢骨骼肌中成功分离的表现为曲线出现明显拐点并稳定形成新的斜率，此状态定义为状态4（图3B）。

这些数据也可解释为线...

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讨论

移动式线粒体生理学实验室使研究人员能够在偏远野外采样点采集组织后2小时内完成线粒体的分离并测定其呼吸速率。本文展示的结果表明，在AU MitoMobile（移动线粒体实验室）中测得的线粒体呼吸数据与大学研究实验室中获得的数据具有可比性。具体而言，本研究中野生来源的Mus musculus的3态呼吸、4态呼吸及呼吸控制比（RCR）数值，与同一实验室及其他实验室先前发表的结果相近（表3）12,23。然而需指出，由于所用小鼠品系及实验方法存在差异，这些研究之间尚无法进行直接比较。本结果验证了在该移动式线粒体生理学实验室中测定线粒体呼吸功能这一概念的可行性。

用于线粒体分离和呼吸测定的所有化学试剂和材料均可在移动实验室中运输和储存，便于实验设置和操作时取用。此外，在移动线粒体实验室中分离获得的线粒体可作为独特的样本，用于开展其他生化检测，例如活性氧的释放测定。重要的是，冷冻保存的线粒体可被运送至固定实验室，以进行进一步的生...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

作者感谢奥本大学塞缪尔·金工程学院电气与计算机工程系的 Mark Nelms 和 John Tennant，他们在 AU MitoMobile 的结构和电气设备配置方面提供了帮助。此外，作者感谢奥本大学跨学科研究总统奖（PAIR）项目资助了 AU MitoMobile 的设备配置及相关研究。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 离心管VWR87003-294
2.0 mL 离心管VWR87003-298
50 mL 离心管VWR21009-681Nalgene Oak Ridge 离心管
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
透明 96 孔板VWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce 匀浆器VWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
滤纸随 Hansatech OxyGraph 提供
游离脂肪酸 BSAVWR89423-672
葡萄糖VWRBDH8005-500G
谷氨酸VWRA12919
Hamilton 注射器VWR60373-985Gaslight 1700 系列注射器
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments Ltd无目录号，可在产品目录 --> 电极控制单元中找到
KH2PO4VWR97062-350
苹果酸VWR97062-140
甘露醇VWR97061-052
膜随 Hansatech OxyGraph 提供
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
刮棒VWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
氯化钾 (KCl)VWR97061-566
蛋白酶VWR97062-366常用胰蛋白酶；但也可使用其他蛋白酶。
丙酮酸VWR97061-448
连二亚硫酸钠VWRAA33381-22
琥珀酸VWR89230-086
蔗糖VWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258

参考文献

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