我们设计并构建了一个移动实验室，用于测量在野外捕获的野生动物分离线粒体的呼吸速率。本文介绍了移动线粒体实验室的设计与装备，以及相关的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体能量代谢是动物生物化学与生理学的核心主题，研究人员常以线粒体呼吸作为评估代谢能力的指标。为获得线粒体呼吸的测量数据，必须使用新鲜的生物样本，且整个实验操作需在约2小时内完成。此外，此类实验还需多种专用仪器设备。这为远离生理学实验室的野生动物组织中线粒体呼吸的测定带来了挑战，因为野外采集后的活体组织无法长期保存。此外，长距离运输活体动物会引发应激反应，进而可能改变线粒体的能量代谢状态。
本文介绍了奥本大学（Auburn University, AU）MitoMobile，这是一种可移动的线粒体生理学实验室，可运往野外并在现场使用，用于测量从野生动物采集的组织中的线粒体代谢。文中展示了该移动实验室的基本特征，以及测定分离线粒体呼吸速率的逐步方法。此外，所提供的数据验证了该移动线粒体生理学实验室的配置成功，并证实了在线粒体呼吸测定方面的可行性。该移动实验室的创新之处在于能够前往野外，对现场捕获动物的组织直接进行线粒体功能测定。
引言
迄今为止，旨在测量线粒体能量代谢的研究仅限于实验室动物或在已建立的生理学实验室附近捕获的动物，这使得科学家无法对动物在迁徙、潜水和冬眠等活动过程中采集的组织进行线粒体生物能量学研究1,2,3,4,5,6。尽管许多研究人员已成功测定了野生动物的基础代谢率、峰值代谢率以及每日能量消耗7,8，但研究人员对线粒体功能的测定能力仍然有限（但见1,4,9）。部分原因在于需要获取新鲜组织以分离线粒体，并且必须在获取新鲜组织后约2小时内于实验室内完成线粒体的分离。一旦线粒体被分离出来，应于约1小时内完成线粒体呼吸的测定。
通常通过测量连接至克拉克电极的密闭容器中的氧气浓度来测定分离线粒体的呼吸速率。该....
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方案
以下部分描述了线粒体实验室方法。所有动物操作和组织采集程序均经奥本大学机构动物护理和使用委员会批准（#2019-3582）。
1. 数据采集所用缓冲液的描述
注意：这些缓冲液可在固定实验室中配制，然后在野外考察前转移至移动实验室（除非下文另有说明）。
- 使用牛血清白蛋白（BSA）配制骨骼肌线粒体分离缓冲液，如图所示 表1.
- 将化学品溶解于去离子水（约 90% 体积）中 除了 对于无脂肪酸的BSA，将缓冲液置于冰箱中，直至温度降至4 °C。
- 在4 °C下将溶液pH值调节至7.5。
- 加入无脂肪酸的BSA，并加水至终体积100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
- 制备不含BSA的骨骼肌线粒体分离缓冲液，如所示 表1.
- 将化学物质溶解于去离子水（约总体积的90%）中。将缓冲液置于冰箱中，冷却至4 °C。
- 在4 °C下将溶液pH值调节至7.5。
- 将体积调至100%。将溶液分装至50 mL锥形管中。于-20 °C保存，待用。
- 按照所示配制骨骼肌重悬缓冲液 <....
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结果
本研究在移动式线粒体生理学实验室中检测了野生来源的 Mus musculus（n = 7，雄性 = 5，雌性 = 2；年龄 = 1.30 ± 0.2 年）的线粒体呼吸功能（图1）。为测定骨骼肌线粒体呼吸，采用整个后肢组织（包括有氧和无氧肌肉）进行线粒体分离（图2）。原始线粒体呼吸数据示例如 图3 所示。图3A 和 图3B 代表由复合物 I 驱动的线粒体呼吸。图3A 中观察到的陡峭斜率表示较高的最大呼吸速率，该数值用于后续数据分析。线粒体从后肢骨骼肌中成功分离的表现为曲线出现明显拐点并稳定形成新的斜率，此状态定义为状态4（图3B）。
这些数据也可解释为线.......
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讨论
移动式线粒体生理学实验室使研究人员能够在偏远野外采样点采集组织后2小时内完成线粒体的分离并测定其呼吸速率。本文展示的结果表明，在AU MitoMobile（移动线粒体实验室）中测得的线粒体呼吸数据与大学研究实验室中获得的数据具有可比性。具体而言，本研究中野生来源的Mus musculus的3态呼吸、4态呼吸及呼吸控制比（RCR）数值，与同一实验室及其他实验室先前发表的结果相近（表3）12,23。然而需指出，由于所用小鼠品系及实验方法存在差异，这些研究之间尚无法进行直接比较。本结果验证了在该移动式线粒体生理学实验室中测定线粒体呼吸功能这一概念的可行性。
用于线粒体分离和呼吸测定的所有化学试剂和材料均可在移动实验室中运输和储存，便于实验设置和操作时取用。此外，在移动线粒体实验室中分离获得的线粒体可作为独特的样本，用于开展其他生化检测，例如活性氧的释放测定。重要的是，冷冻保存的线粒体可被运送至固定实验室，以进行进一步的生.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
作者感谢奥本大学塞缪尔·金工程学院电气与计算机工程系的 Mark Nelms 和 John Tennant，他们在 AU MitoMobile 的结构和电气设备配置方面提供了帮助。此外，作者感谢奥本大学跨学科研究总统奖（PAIR）项目资助了 AU MitoMobile 的设备配置及相关研究。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 离心管 | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL 离心管 | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL 离心管 | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge 离心管 |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| 透明 96 孔板 | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce 匀浆器 | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| 滤纸 | 随 Hansatech OxyGraph 提供 | ||
| 游离脂肪酸 BSA | VWR | 89423-672 | |
| 葡萄糖 | VWR | BDH8005-500G | |
| 谷氨酸 | VWR | A12919 | |
| Hamilton 注射器 | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 系列注射器 |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | 无目录号，可在产品目录 --> 电极控制单元中找到 | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| 苹果酸 | VWR | 97062-140 | |
| 甘露醇 | VWR | 97061-052 | |
| 膜 | 随 Hansatech OxyGraph 提供 | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| 刮棒 | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| 氯化钾 (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| 蛋白酶 | VWR | 97062-366 | 常用胰蛋白酶；但也可使用其他蛋白酶。 |
| 丙酮酸 | VWR | 97061-448 | |
| 连二亚硫酸钠 | VWR | AA33381-22 | |
| 琥珀酸 | VWR | 89230-086 | |
| 蔗糖 | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
参考文献
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K.
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重印与许可
