本方案介绍了一种提高甲醛固定石蜡包埋组织样本中肿瘤含量百分比的方法。
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摘要
摘要
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中若存在非肿瘤组织污染，会严重削弱基因组学研究的准确性。本文介绍了一种称为宏切割（macrodissection）的方法，该方法通过在进行下游核酸提取之前去除并剔除不需要的组织，从而提高组织样本中的肿瘤含量比例。将FFPE组织块切片，获得厚度为4-5 µm的载玻片组织切片。选取一张代表性切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，并由经认证的病理学家进行评估。在评估过程中，病理学家在H&E染色切片上识别并标记出肿瘤组织区域。完成标记后，利用该已标记的H&E切片作为指引，对来自同一组织块的连续未染色切片进行针对性切除。为展示宏切割的效果，从配对的经宏切割与未经切割的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）样本中提取RNA，并在数字基因表达检测平台上进行分析，该平台可确定DLBCL亚型及BCL2易位状态。结果显示，在所检测的样本中，宏切割改变了60%样本的亚型分类或BCL2易位状态判断结果。综上所述，宏切割是一种在核酸提取前实现肿瘤富集的简单而有效的方法，其产物可被可靠地用于后续基因组学研究。
引言
在常规临床诊断过程中采集并保存在临床组织库中的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，是人类研究（包括癌症研究）的宝贵资源1。随着人们对人类疾病认识的不断深入，过去基于形态学和免疫表型特征被认为属于单一疾病的类别，实际上由不同的分子亚型组成，因而需要进行分子分型检测。因此，能够识别这些亚型的高灵敏度基因组检测方法变得日益重要2。尽管由于固定过程带来的问题，FFPE组织长期以来被认为与基因组学技术兼容性较差，但随着技术与实验方案的进步，这些技术正逐渐适用于这种在临床上广泛存在的组织形式3,4,5。然而，FFPE组织通常含有肿瘤组织与非肿瘤组织的混合成分，其中非肿瘤成分的存在往往是不希望的，若其比例较高，可能显著削弱并影响基因组分析的结果6。事实上，此类分析通常要求肿瘤含量至少达到60%，低于该阈值的样本即使符合其他研究标准，也可能被排除在外7。在罕见病研究中，这一问题尤为突出，因为患者组织极为珍贵且难以大量获取。
大体解剖法是一种通过减少正常组织含量来最小化低肿瘤含量影响的方法3。在核酸提取前去除这些混杂的非肿瘤组织，可显著提高肿瘤所占比例，从而提升所提取核酸的肿瘤纯度。该组织切除过程高度依赖于病理专家的评估：由经认证的病理学家在新制备的苏木精-伊红（H&E）染色组织切片上识别并圈出肿瘤区域8。随后，该标记有圈选的H&E切片将用于指导非目标组织的去除以及目标组织的采集。本实验方案描述了自病理学评估至组织收获的大体解剖操作步骤，该流程由梅奥诊所艾滋病与癌症标本资源中心（ACSR）技术核心实验室实施。
方案
所有样本的采集和使用均符合梅奥诊所机构审查委员会批准的方案（PR16-000507 和 PR2207-02）。
1. 样品制备
- 打开组织漂浮水浴锅，将温度设置为 39 °C，并等待水温升至设定值。将木质收集棒浸泡在水浴中。
- 识别并取出待切片的 FFPE 组织块。
- 使用可耐受溶剂清洗的组织学级永久性记号笔预先标记载玻片。
- 使用切片机对 FFPE 组织块进行切片。每个组织块至少切 2 张完整切面，每张切片厚度为 4–5 μm（图 1A）。
- 将新切下的组织切片带转移至预热的组织漂浮水浴中，用于载玻片贴片（图 1B，C）。
注意：温水有助于"熨平"切片中的皱褶（图 1C）。 - 依次操作每个切片，使用镊子将单个切片从切片带上分离（图 1D）。
- 将单个切片收集到已预先标记的载玻片上。
- 以一定角度将载玻片浸入切片下方，调整位置，使组织切片边缘接触载玻片（图 1E）。
- 当载玻片与组织切片接触后，缓慢将其从漂浮水浴中拉出，使组织切片在离开水面时平整地贴附于载玻片上（图 1F）。
- 每张载玻片上贴附 1 个组织切片，并重复操作直至所有切片均被收集完毕。
- 让贴有组织切片的载玻片在室温（RT）下充分干燥。
2. 病理学复查
- 对每个组织块的一个代表性组织切片进行苏木精-伊红（H&E）染色9。
- 将新近染色的H&E切片提交给经认证的病理学家进行病理学评估。
注意：在评估过程中，病理学家确定并记录每份组织中的肿瘤含量百分比，并在每张H&E切片上圈出肿瘤区域（见图2和图3，第1行）。表1列出了针对图3第1行所示样本A-E的H&E切片在病理学评估中根据细胞含量确定的肿瘤含量百分比。肿瘤含量<60%的切片需要进行大体解剖分离7。用于核酸提取的切片数量取决于所圈出肿瘤区域的大小。如果在本方案第1步中切割的切片数量不足且仍可继续切片，则可能需要进一步切割额外切片。
3. 脱蜡
- 在通风橱中，预先将两个玻璃染色缸装满未稀释的组织学级 d-柠檬烯或基于 d-柠檬烯的溶剂，并将一个玻璃染色缸装满未稀释的200 proof分子级乙醇。
警告：避免 d-柠檬烯接触皮肤和眼睛，避免吸入蒸气或雾滴，并远离点火源。乙醇应远离热源、火花和明火，避免洒出以及接触皮肤或眼睛，保持良好通风，避免吸入蒸气。
注意：染色缸中的液体应足够浸没载玻片架上的载玻片（图4A）；填充所示20片装染色缸需要250 mL。每处理40张载玻片后，应更换 d-柠檬烯和乙醇洗涤液。d-柠檬烯（C10H16）是一种替代二甲苯的脱蜡剂，效果相当，毒性更低，正越来越多地应用于组织学方法中，并可在提取后获得高质量的核酸10,11,12,13,14。尽管本方案也可使用更环保的替代试剂15，但它们对提取核酸质量的影响（如有）仍有待确定。 - 将未染色的FFPE组织切片载玻片插入玻璃Coplens载玻片架中（图4A，插图）。
- 将载玻片架浸入 d-柠檬烯洗涤液1中2分钟；前20秒轻轻振荡。
注意：为尽量减少洗涤液之间的残留，在将载玻片架从洗涤液中取出时，先让其短暂沥干，然后轻轻用纸巾轻拍架底以去除多余的洗涤液。 - 将载玻片架浸入未稀释的 d-柠檬烯洗涤液2中2分钟；前20秒轻轻振荡。取出后再次沥干并轻拍载玻片架。
- 将载玻片架浸入乙醇洗涤液中2分钟；前20秒轻轻振荡。取出载玻片架并置于吸水纸上沥干。让载玻片在空气中干燥至少10分钟，但不超过2小时。
3. 大体解剖
- 在实验台上，用 50 mL 的含 3% 甘油的无 DNase/RNase 水预填充一个 Coplin 玻璃染色缸
注意：每处理 40 张切片后应更换一次甘油洗涤液。 - 预先标记并用 160 µL 组织消化缓冲液填充每支 1.5 mL 微量离心管。
注意：本方案中在显微切割后进行的核酸提取使用了 DNA/RNA FFPE 提取试剂盒（材料表）。因此，本方案所用的组织消化缓冲液包含 10 µL 蛋白酶 K 和 150 µL PKD 缓冲液。 - 将 H&E 染色切片上的病理标记描画到脱蜡组织切片的背面。
注意：与未脱蜡组织（图 3，第 2 行 和 图 4B）相比，脱蜡组织呈白色且清晰可见（图 3，第 3 行，以及 图 4C）。正是由于脱蜡后组织特征的可见性和可辨识性增强，才使得显微切割成为可能。将 H&E 染色切片正面朝下放置于实验台上，将脱蜡切片的正面贴合至经病理医生审阅的对应 H&E 染色切片的背面（图 4D）。使脱蜡组织与 H&E 染色组织对齐（图 4E）。描画病理医生的标记是显微切割过程中的关键步骤，应尽可能准确地复制这些标记。对于较小或不连续的组织（如样本 B、D 和 E），此步骤可能尤为困难（图 3、图 4E 及 图 4E 插图 i）。为便于描画，应使用墨水细尖或超细尖记号笔（图 4E，插图 ii）描画病理医生绘制的标记。必要时可使用乙醇擦拭去除错误标记，并重新描画。 - 将已标记的脱蜡切片翻转至组织面朝上，用洁净剃刀刀片的角沿标记线轻轻划痕，以预先切割肿瘤区域的边缘。
- 依次处理每张切片，将脱蜡切片浸入 3% 甘油溶液中。在缓慢取出切片前，确保组织完全浸没（图 4F）。
注意：甘油浸润的目的是使组织湿润，便于组织收集，同时减少静电积聚，避免组织与用于收集组织的塑料微量离心管之间产生排斥。 - 用纸巾轻轻擦拭切片背面以去除多余的甘油溶液，并将切片放置于实验台上，擦拭面朝下。让组织短暂风干 1–2 分钟。
注意：过量甘油带入提取过程可能对核酸提取的得率和质量产生不利影响。收集时组织应略微湿润，但不可明显潮湿。 - 根据切片上目标肿瘤区域的位置，使用剃刀刀片的平边采用以下两种方式之一进行操作：(a) 直接使用刀片刮取并收集肿瘤组织，或将目标组织从切片上刮下收集；或 (b) 先去除并丢弃非肿瘤组织，再收集目标肿瘤组织（图 3）。
注意：收集的组织倾向于在刀片底部聚集或卷起（图 4G）。 - 使用木制挑针将收集的组织从刀片上取下（图 4H 及插图），并转移至相应已预先标记并填充的微量离心管中（图 4I）。
注意：消化缓冲液的作用是"将组织从木制挑针上洗脱"进入液体中。 - 继续进行核酸提取。
注意：核酸提取按照制造商说明书使用 DNA/RNA FFPE 提取试剂盒完成，所得核酸通过紫外-可见分光光度计进行定量。所得 RNA 用于基于数字基因表达谱的 DLBCL90 检测16。
结果
共对5个弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块进行切片，所得切片在核酸提取前或进行宏观分离，或不进行宏观分离。提取的RNA用于DLBCL90检测16。对于经宏观分离的样本，分别以两种方式重复检测：第一次使用5 µL RNA原液浓度，但总RNA输入量不超过300 ng；第二次将5 µL RNA原液稀释至与其对应未分离样本的RNA输入量一致。DLBCL90检测结果见表2。
DLBCL 包含3种不同的细胞起源（COO）亚型，其治疗反应性各异，分别为GCB、ABC以及一种被称为未分类或UNC的中间亚型17,18涉及 MYC、BCL2 和/或 BCL6 的易位，单独或组合出现（双打击或三打击），在弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中也常被观察到，尤其是在生发中心 B 细胞样亚型中19DLBCL90检测是其前身Lymph2Cx临床检测的扩展，因此不仅能够进行DLBCL的细胞来源分型（COO）亚型判定，主要还被开发用于通过数字基因表达分析来识别涉及BCL2的双打击（double hit, DH）易位样本，从而作为荧光原位杂交（FISH）的替代方法。16,20. 结果在 表 2 结果显示，巨体解剖改变了所检测样本中60%（3/5）的COO或DHITsig状态判定。
样本A的宏观解剖对COO分型结果无影响，但使DHITsig分型结果从NEG变为UNCLASS，且该变化与宏观解剖样本的RNA投入量无关，概率评分相近（0.224，0.254）。相比之下，样本C的宏观解剖对DHITsig分型结果无影响，但使COO分型结果从GCB变为UNC。同样，该变化亦与宏观解剖样本的RNA投入量无关。然而，在RNA投入量减少的宏观解剖样本中，COO分型概率为0.117，接近0.1的分型阈值。与样本A类似，样本E的宏观解剖对COO分型结果无影响，但改变了DHITsig分型结果；然而，样本E的分型结果由UNCLASS变为NEG，且该变化与宏观解剖样本的RNA投入量无关，概率评分较为接近（0.849，0.833）。值得注意的是，DHITsig分型结果变为NEG具有生物学意义，因为样本E被鉴定为ABC-DLBCL，而涉及BCL2的双重打击易位仅在GCB-DLBCL中被报道过19。
图1：使用切片机生成载玻片贴附的组织切片。（A）通过切片机卡盘固定FFPE组织块，并进行切割以产生连续的FFPE组织切片带。（B）使用预先浸湿的木棒，将切片带从切片机上收集并转移至温水浴中。（C）水的热量有助于展平组织切片带中的皱褶。（D）通过将闭合的镊子置于两个切片交界处并轻轻打开镊子，使切片彼此分离，从而从切片带上取下单个FFPE组织切片。（E）将玻璃载玻片以倾斜角度浸入水中，并轻轻将玻片侧边移向组织切片，直至切片边缘接触载玻片，从而将切片从水中收集。（F）当载玻片与切片接触后，缓慢将载玻片从水中取出，使组织切片平整地贴附于载玻片上。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：苏木精和伊红（H&E）染色切片的病理学与组织学评估。 （A，B）由经认证的病理学家对 H&E 染色的组织切片进行显微镜下评估。（C，D）当病理学家观察完整个组织切片并确认其并非全部为肿瘤组织后，将使用标记笔圈出组织中的肿瘤区域。（E，F）将标记好的 H&E 切片与原始的 FFPE 组织块对照，显示并非所有组织均为肿瘤成分。请点击此处查看本图的放大版本。
图 3：组织样本。 本图像展示了经病理学复核并标记肿瘤区域的苏木精-伊红（H&E）染色切片（第1行），未处理的载玻片固定石蜡包埋（FFPE）组织切片（第2行），脱蜡后的载玻片固定FFPE组织切片（第3行），脱蜡后并在载玻片背面描记病理标记的载玻片固定FFPE组织切片（第4行），以及脱蜡后经大体解剖分离的载玻片固定FFPE组织切片（第5行），对应于用于演示本实验方案的5个样本（A–E）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：FFPE 组织切片的脱蜡与宏观解剖：（A）在通风橱中，将载有 FFPE 组织的载玻片置于玻片架上，依次用两步 d-柠檬烯清洗和一步乙醇清洗。 （B、C）清洗后，所有石蜡均已去除，仅剩组织保留在载玻片上，此时组织呈白色，与清洗前相比更清晰可见。 （D）将脱蜡后的载玻片组织切片正面朝下放置在其对应的标记有 H&E 的玻片背面。 （E）使用细或超细永久性记号笔，将 H&E 玻片上的肿瘤区域标记描画到脱蜡玻片的背面。 （F）将标记后的脱蜡载玻片组织切片浸入甘油清洗液中，使组织切片湿润以便采集。缓慢将玻片从甘油中取出，并用纸巾擦拭玻片背面以去除多余甘油，然后将组织面朝上平放在实验台上。 （G）使用洁净剃刀片的平直侧对组织进行宏观解剖，将病理学家标记区域外的非目标组织弃去，保留目标组织，后者会聚集在刀片边缘。 （H）使用木棒将聚集在刀片边缘的组织取下。 （I）将组织转移至预先标记并已加入组织消化缓冲液的微量离心管中，即可用于核酸提取。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 样本编号 | 完整组织 (a) | 组织圈选区域 (b) | 完整组织的总体肿瘤含量 (c) | 通过大体解剖法提高的肿瘤含量倍数 (d) | 未进行大体解剖 (e) | 进行大体解剖 (f) | ||||
| 活肿瘤百分比 | 其他成分百分比 | 活肿瘤百分比 | 其他成分百分比 | 提取的5 µm切片数量 | RNA浓度 (ng/µL) | 提取的5 µm切片数量 | RNA浓度 (ng/µL) | |||
| 样本A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| 样本B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| 样本C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| 样本D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| 样本E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
表1：病理学复查数据。该表格显示了（a）整个组织切片中活性肿瘤所占面积的百分比，（b）病理学家在复查过程中根据细胞密度圈出/标记区域中活性肿瘤的百分比，（c）整个组织样本的估计总体肿瘤细胞含量（a × b），（d）通过大体解剖（macrodissection）实现的肿瘤细胞含量估计倍数增加，（e 和 f）提取的未染色FFPE包埋组织5 µm切片的数量，以及配对的非大体解剖与大体解剖样本所获得的RNA浓度。% 其他（% Other）指给定样本中存在的所有非肿瘤组织成分，包括结缔组织、间质成纤维细胞、血管以及其他固有间质成分。请点击此处下载该表格。
| 样本编号 | RNA 输入量 (ng) | DLBCL90 COO 分类结果 | DLBCL90 分类概率 | DHITsig 分类结果 | DHITsig 阳性概率 | DHITsig 阴性概率 | |
| 未进行显微切割 | Sample A | 95.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.135 | 0.865 |
| Sample B | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.032 | 0.968 | |
| Sample C | 68.5 | GCB | 0.028 | NEG | 0.033 | 0.967 | |
| Sample D | 286.5 | ABC | 0.998 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Sample E | 126.0 | ABC | 0.989 | UNCLASS | 0.212 | 0.788 | |
| 经显微切割 | Sample A_M | 291.7 | GCB | 0.000 | UNCLASS | 0.224 | 0.776 |
| Sample B_M | 300.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.016 | 0.984 | |
| Sample C_M | 231.2 | UNCLASS | 0.210 | NEG | 0.015 | 0.985 | |
| Sample D_M | 300.0 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Sample E_M | 223.2 | ABC | 0.987 | NEG | 0.151 | 0.849 | |
| 经显微切割并稀释 RNA | Sample A_M | 95.0 | GCB | 0.000 | UNCLASS | 0.254 | 0.746 |
| Sample B_M | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.023 | 0.977 | |
| Sample C_M | 68.5 | UNCLASS | 0.117 | NEG | 0.027 | 0.973 | |
| Sample D_M | 286.5 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Sample E_M | 126.0 | ABC | 0.995 | NEG | 0.167 | 0.833 | |
表2：DLBCL90 数字基因表达检测结果。 五个样本（A-E）在进行核酸提取前，部分未进行显微切割，部分进行了显微切割。提取得到的RNA随后用于DLBCL90检测，该检测的最大RNA加样体积为5 µL。未显微切割的样本使用5 µL原液RNA进行检测。每个显微切割样本分别进行两次检测：(a) 使用5 µL原液RNA（除非可获得60 ng/µL的分装样本），以及(b) 将原液RNA稀释至与其未显微切割对应样本相同浓度/加样量后，使用5 µL进行检测。后缀_M表示该样本经过显微切割。请点击此处下载该表格。
讨论
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织通常是肿瘤组织与非肿瘤组织的异质性混合物。高灵敏度基因组检测在临床和科研领域正变得日益普遍，但其结果可能因混杂的非肿瘤组织而受到干扰。事实上，基因组研究通常建议肿瘤含量最低应达到60%。肿瘤百分比可通过肿瘤组织所占面积或组织内肿瘤细胞所占比例来确定。尽管基于面积的肿瘤含量是评估肿瘤纯度的常用指标，但它并不总能准确反映组织的真实情况。考虑两种组织，每种均含有1000个细胞，其中500个为肿瘤细胞。在组织A中，500个非肿瘤细胞为间质细胞，其体积与肿瘤细胞相近。在此情况下，该组织的肿瘤百分比在细胞数量和面积上均可视为50%。在组织B中，500个非肿瘤细胞为脂肪细胞，其体积为肿瘤细胞的4倍。此时，该组织的肿瘤百分比在细胞数量上仍为50%，但在面积上仅为20%。第三种组织（组织C）由500个肿瘤细胞、400个脂肪细胞和800个间质细胞组成，其体积分别为肿瘤细胞的4倍和0.5倍。由于100个脂肪细胞的体积相当于800个间质细胞的体积，因此组织C的肿瘤细胞百分比为29%（500/1700），而面积百分比仍为20%。组织D同样包含肿瘤细胞、脂肪细胞和间质细胞，其体积比分别为1x、4x和0.1x，但细胞数量分别为400个、10个和720个。因此，组织D的肿瘤细胞百分比为35%（400/1130），而面积百分比则高达78%。这些例子虽过于简化，未能完全反映真实组织的复杂组成，但清晰地说明了组织组成的重要性，以及基于面积与基于细胞数量的肿瘤含量之间的差异。尤为重要的是，在进行下游核酸提取前富集肿瘤成分时，肿瘤细胞数量比例（细胞百分比）是更为关键的指标，因为从比肿瘤细胞更多的非肿瘤细胞中提取基因组物质可能带来更大的干扰。这不仅强调了以细胞百分比评估组织肿瘤含量的必要性，也突显了切除无关组织以最大限度降低非肿瘤组织潜在负面影响的重要性。目前有多种组织富集方法可供选择，其中主要方法为大体解剖（macrodissection）和显微切割（microdissection）。
本方案所述的宏观解剖法（macrodissection）相对快速、简便，且无需昂贵或专用设备。尽管宏观解剖法可显著提高肿瘤含量，但需明确的是，该方法并不能完全去除非肿瘤组织。宏观解剖的目的是通过剔除不需要的组织，充分富集目标组织，从而降低源自非目标组织的“背景噪声”，进而增强来自目标组织的特异性信号。因此，通过宏观解剖实现的肿瘤富集是一种提高信噪比的方法，有助于更有效地检测目标标志物，尤其是丰度较低或表达微弱的肿瘤特异性分子标志物。然而，由于使用剃刀片等粗略工具，宏观解剖的精度有限，且易受病理医师标记线条宽度以及在描记苏木精-伊红（H&E）染色划定边界时可能出现误差的影响。如上所述，由于肿瘤内部固有且促进肿瘤发生的间质成分（即结缔组织、间质成纤维细胞、血管、良性反应性淋巴细胞、巨噬细胞）的存在，无法实现100%的肿瘤纯度。事实上，许多侵袭性或弥漫浸润性恶性肿瘤会诱导强烈的促纤维增生性间质反应，导致肿瘤细胞簇与间质成纤维细胞及其他非肿瘤细胞类型密切混合；对于具有此类间质反应模式的肿瘤（如胰腺癌组织21），相较于手工宏观解剖，可能更适用于数字引导下的显微切割技术。
在显微镜下进行的手动显微解剖有助于识别、分离和纯化特定细胞或细胞群，通常使用针或手术刀操作，其精度高于宏观解剖22。然而，手动显微解剖是一项费力的过程，难以应对肿瘤含量较低或结构复杂的组织，这些组织的精细特征不适合人工解剖。此类组织可通过高精度自动化方法（如激光捕获显微切割）进行分离。事实上，已有研究表明，在胰腺癌组织中，数字引导下的显微解剖相比手动宏观解剖可获得更高比例的肿瘤成分23。然而，这些高精度自动化方法存在需要专用且昂贵设备以及高度熟练操作人员等局限性，限制了其在常规工作流程中的应用。de Bruin 等人的一项研究比较了宏观解剖与激光捕获显微切割（LCM）对基因表达谱的影响，发现LCM样本的总RNA得率较低（平均30 ng），需进行两轮mRNA扩增才能达到cDNA文库构建所需的起始量24。作者指出，LCM所得基因表达谱受mRNA扩增轮次的影响大于宏观解剖样本受非肿瘤间质成分干扰的影响，因此认为宏观解剖足以用于生成可靠的基因表达数据24。
NanoString 数字化基因表达谱分析的一个显著优势在于，尤其是在处理高度降解的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）来源 RNA 时，无需依赖酶促反应过程，例如 RNA 扩增或 cDNA 文库构建。然而，该检测通常针对 50–300 ng 总 RNA 的投入量进行优化25,26，根据 de Bruin 等人24的研究结果，若不增加组织投入量，这一要求可能与显微切割组织样本不兼容；而在当前组织样本越来越多地以小活检而非手术切除方式获取的时代，增加组织投入量是不现实的。DLBCL90 检测中所用的 RNA 投入量在宏观切割和未切割组织中均介于 68.5–300 ng 之间。结果显示，在所检测的样本中，60% 的样本在进行宏观切割后出现了分类调用（call）的变化，且这些变化与宏观切割样本的 RNA 投入量无关。然而，低 RNA 投入量样本的细胞起源（COO）概率接近 COO GCB/UNC 分类阈值，其中 GCB 的阈值为 0 至 <0.1，UNC 为 0.1–0.9，ABC 为 >0.9 至 1.020。DLBCL 主要的 COO 亚型为 GCB 和 ABC，分别占所有 DLBCL 病例的 41% 和 44%，UNC 代表两者之间的中间群体，而 ABC 是最具侵袭性的亚型20,27。因此，尽管样本 C 在宏观切割后 COO 分类从 GCB 变为 UNC 并未导致明确的亚型转变（即从 GCB 转变为 ABC），但这一变化可能提示疾病正向更具侵袭性的方向发展。此外，近期研究表明，UNC 亚型并非仅仅是中间亚型，其可能具有特定的、可被治疗利用的生物学特征28。类似地，样本 A 和 E 的宏观切割并未导致 DHITsig 分类在 DH 阴性与 DH 阳性之间的明确转变。然而，在宏观切割后，一个 GCB 样本（样本 A）由 NEG 转为 UNCLASS，而一个 ABC 样本（样本 E）由 UNCLASS 转为 NEG，这种变化在生物学上是合理的，因为已有报道指出涉及 BCL2 的双重打击易位 exclusively 发生于 GCB 亚型中19。尽管在临床实践中，易位 traditionally 且普遍通过 FISH 检测，但目前正 increasingly 推动寻找一种更简便、耗时更少的替代检测方法。DLBCL90 检测正是应对这一需求的重要工具，其应用的合理性因以下发现而得到加强：该检测能够识别出临床诊断中所用 FISH 探针无法检出的隐匿性易位29。
上述宏观解剖方案描述了一种简单的方法，使研究人员能够提高组织样本中的肿瘤含量，这些样本原本的肿瘤含量通常低于常用研究纳入标准的阈值。在研究工作流程中加入宏观解剖步骤，可使肿瘤密度较低的组织通过提高其肿瘤含量而避免被排除在研究之外。这进而提高了所获得的RNA和DNA洗脱液能够代表正在进行基因组学研究的肿瘤组织的可信度。尽管存在其他更为精确的组织解剖方法，但对于呈扩张性、非浸润性、片状或实性生长模式的肿瘤，宏观解剖很可能已足够有效。本文展示的结果强调了肿瘤纯度在基因组检测中的重要性，以及宏观解剖作为实现高纯度的一种可靠工具的价值。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助的艾滋病与癌症标本资源中心（ACSR，项目编号：UM1 CA181255-2）的生物标本科学项目支持。视频拍摄及后期制作由梅奥诊所媒体服务部完成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200-proof 乙醇 | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE 试剂盒 | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE 提取试剂盒 |
| 考普林罐（Coplin pots） | Various | x | |
| DLBCL90 探针 | NanoString | various | 基于数字基因表达谱分析的 DLBCL90 检测方法 |
| d-柠檬烯 | VWR | 89376-092 | |
| 镊子 | Various | x | |
| 玻璃显微镜载玻片 | FisherBrand | 12-550-15 | |
| 甘油 | VWR | 0854-1L | |
| 主试剂盒（Master kits） | NanoString | various | |
| 切片机 | Leica | RM2265 | |
| 微量离心管 | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 用于 DNA、RNA 和蛋白质定量的分光光度计 |
| nCounter | NanoString | x | 用于运行 DLBCL90 检测的数字基因表达谱分析平台 |
| 永久性记号笔 | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| 刀片分配器 | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| 剃须刀片 | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| 组织消化缓冲液 | Qiagen | 80234 | |
| 超纯水 | VWR | SH30538.02 | |
| 水浴锅 | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| 木棒 | FisherBrand | 22363158 |
参考文献
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