噬斑实验是一种用于定量病毒群体中活病毒的常规方法。尽管在各类微生物学课程中，噬斑实验常以细菌和噬菌体为例进行教学，但哺乳动物病毒的噬斑实验更为复杂且耗时。本方案描述了在单纯疱疹病毒常规实验中可靠有效的操作步骤。
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摘要
摘要
已有大量关于病毒蚀斑实验的已发表方案，包括原始文献中记载的方法学参考。然而，病毒蚀斑实验的实施可能较为困难，需要关注其具体操作细节并进行优化。对于新学生而言，掌握该方法极具挑战性，主要原因是实验过程中必须极为细致地关注最微小的操作细节。本视频对单纯疱疹病毒蚀斑实验的演示，将有助于多年来在理解该方法（尤其是其细微之处）方面存在困难的研究者。尽管本文所述方法基于标准病毒蚀斑实验的基本原理，但其不同之处在于详细描述了以下三个方面：（1）如何最佳地处理宿主细胞以避免实验过程中细胞层的破坏；（2）使用一种比琼脂糖更有效的黏性培养基以限制病毒粒子的扩散；（3）一种简单且可重复性良好的固定与染色步骤。此外，配套视频有助于展示实验过程中那些在指导他人进行蚀斑实验时常被忽略的精细操作差异。
引言
病毒蚀斑实验的起源可追溯至19世纪90年代病毒的最初发现1。烟草花叶病毒首次被分离并接种于烟草叶片上，其中单个感染病灶可被识别，并被定量为源自单个活病毒颗粒2，后来被确认为病毒粒子（virion）2。随后，针对细菌和噬菌体的开创性研究进一步完善了病毒蚀斑实验技术，包括使用处于对数生长中期的细菌、对噬菌体样品进行连续稀释，以及采用顶层琼脂培养，最终在细菌菌苔上观察到明显的空斑（称为蚀斑，plaques）3。
动物病毒的蚀斑实验研究落后于当时如火如荼开展的噬菌体研究，主要原因在于培养哺乳动物细胞所需的技术直到20世纪40年代才得以建立4。然而，无需完整宿主生物体即可培养小鼠细胞的技术的出现4，开启了病毒培养与计数能力的新纪元。此后，该技术被进一步应用于在鸡细胞中扩增和定量西方马脑脊髓炎病毒，以及在人细胞中扩增和定量脊髓灰质炎病毒5,6。随着可培养的哺乳动物细胞种类不断扩展，多种多样的宿主细胞为研究各类病毒提供了丰富多样的可能性7。其中....
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方案
所有涉及Vero细胞和活体疱疹病毒的操作均已被陶森大学机构生物安全委员会批准。这些操作的通用流程如图1所示。
1. Vero 细胞的接种
- 在进行蚀斑试验的前一天，用胰蛋白酶消化Vero细胞，并将其重悬于常规的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，按照标准细胞培养方法添加补充物19。将消化后的细胞以每T-75培养瓶汇合的Vero细胞（约107个细胞）加入10 mL DMEM进行重悬。
注：蚀斑试验使用DMEM而非α-MEM，因为DMEM可略微减缓细胞生长速率，从而获得更佳的蚀斑试验结果。 - 采用研究者偏好的方法对细胞进行计数（例如，使用台盼蓝排斥法的标准血细胞计数板）19。
- 以每孔4 × 106个细胞的密度接种细胞；对于HSV-2，使用6孔板，每孔加入2.5 mL含补充物的DMEM；对于HSV-1，使用12孔板，每孔加入1.25 mL含补充物的DMEM。
注：无论使用何种培养板，接种的细胞数量应保持恒定，但孔的尺寸会影响蚀斑试验的准确性。必须确保细胞均匀分布，最有效的方法是前后摇动培养板，而非以环形方式晃动。 - 将细胞置于加湿的培养箱中，在37....
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结果
表1显示了一个具有理想结果的实验。所有10倍稀释均表现出噬菌斑计数大约降低10倍的趋势。此类数据也可在图2中观察到，该图为一次真实的噬菌斑测定实验，三个重复样本中可计数的噬菌斑数量均出现在10-4稀释度范围内。同样情况也见于图3的上排，其中可计数的噬菌斑数量出现在10-3稀释度。
然而，图3 的底行显示了当噬斑实验操作不佳时会得到完全不同的结果。首先，任何稀释度下可见的噬斑都极少，因此数据无法使用。其次，在孔板顶部周围可见细胞完全从基质上脱落的区域，这表明实验过程中可能使细胞干燥，或在该区域加样时吹打过于剧烈。
表2 还显示了一组可能异常的噬斑计数结果，需在操作过程中加以注意。值得注意的是，无论是在上排还是下排的重复实验中，当从一个稀释度转移到下一.......
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讨论
虽然蚀斑实验的历史几乎与哺乳动物细胞培养本身一样悠久，但似乎每个实验室都有自己的一套执行这一基本实验的方案5,6,10,11,12,13,14,15,16,20。尽管已发表的每种蚀斑实验方案在操作步骤上仅有细微差异，但很少有文献阐明获得稳定结果所需的关键细节。
因此，本实验方案中某些步骤更依赖操作技巧而非严格的科学规.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢多年来在我们的实验室（PJD 和 BJM）中与我们一起工作并不断完善这些方法的无数学生。特别感谢 Stan Person，在他的指导下，该方法最初得以建立。本研究部分得到了陶森大学费舍尔科学与数学学院本科生研究支持基金以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）“通向学士学位的桥梁”项目资助 5R25GM058264 的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔板 | Corning | 3512 | |
| 6孔板 | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| 抗生素/抗真菌剂 | Gibco | 15240096 | |
| 结晶紫 | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含 Mg++ 或 Ca++） | Gibco | 14190144 | |
| 胎牛血清 | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Glutamax） | Gibco | GS07F161BA | |
| 血细胞计数板 | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| 甲基纤维素 | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| 季铵盐类消毒剂（Lysol I.C.） | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| 台盼蓝 | Corning | 25900CI | |
| 胰蛋白酶 | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero 细胞 | ATCC | CCL-81 |
参考文献
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
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