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方法文章

单纯疱疹病毒的蚀斑实验

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DOI：

10.3791/62962

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2021年11月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

噬斑实验是一种用于定量病毒群体中活病毒的常规方法。尽管在各类微生物学课程中，噬斑实验常以细菌和噬菌体为例进行教学，但哺乳动物病毒的噬斑实验更为复杂且耗时。本方案描述了在单纯疱疹病毒常规实验中可靠有效的操作步骤。

摘要

已有大量关于病毒蚀斑实验的已发表方案，包括原始文献中记载的方法学参考。然而，病毒蚀斑实验的实施可能较为困难，需要关注其具体操作细节并进行优化。对于新学生而言，掌握该方法极具挑战性，主要原因是实验过程中必须极为细致地关注最微小的操作细节。本视频对单纯疱疹病毒蚀斑实验的演示，将有助于多年来在理解该方法（尤其是其细微之处）方面存在困难的研究者。尽管本文所述方法基于标准病毒蚀斑实验的基本原理，但其不同之处在于详细描述了以下三个方面：（1）如何最佳地处理宿主细胞以避免实验过程中细胞层的破坏；（2）使用一种比琼脂糖更有效的黏性培养基以限制病毒粒子的扩散；（3）一种简单且可重复性良好的固定与染色步骤。此外，配套视频有助于展示实验过程中那些在指导他人进行蚀斑实验时常被忽略的精细操作差异。

引言

病毒蚀斑实验的起源可追溯至19世纪90年代病毒的最初发现1。烟草花叶病毒首次被分离并接种于烟草叶片上，其中单个感染病灶可被识别，并被定量为源自单个活病毒颗粒2，后来被确认为病毒粒子（virion）2。随后，针对细菌和噬菌体的开创性研究进一步完善了病毒蚀斑实验技术，包括使用处于对数生长中期的细菌、对噬菌体样品进行连续稀释，以及采用顶层琼脂培养，最终在细菌菌苔上观察到明显的空斑（称为蚀斑，plaques）3。

动物病毒的蚀斑实验研究落后于当时如火如荼开展的噬菌体研究，主要原因在于培养哺乳动物细胞所需的技术直到20世纪40年代才得以建立4。然而，无需完整宿主生物体即可培养小鼠细胞的技术的出现4，开启了病毒培养与计数能力的新纪元。此后，该技术被进一步应用于在鸡细胞中扩增和定量西方马脑脊髓炎病毒，以及在人细胞中扩增和定量脊髓灰质炎病毒5,6。随着可培养的哺乳动物细胞种类不断扩展，多种多样的宿主细胞为研究各类病毒提供了丰富多样的可能性7。其中包括人类疱疹病毒的扩增与定量，特别是引起黏膜皮肤病变的单纯疱疹病毒-1（HSV-1）和-2（HSV-2）8。重要的是，所有蚀斑实验均依赖于样本中具有活性的病毒颗粒的存在，这些病毒颗粒能够以受体介导的方式进入宿主细胞9。尽管关于蚀斑实验操作的文献广泛且数量众多5,10,11,12,13,14,15,16，但针对HSV-1/-2的实验方法仍兼具科学性与技术性；若不对实验方案中的每个细节给予充分关注，则无法成功开展实验，同样，若缺乏对实验过程中细微之处的敏锐观察，也无法获得成功的结果。本文介绍了一种最为稳定且可重复的HSV-1/-2蚀斑实验方法，并详细阐述了该实验技术中极少被讨论的操作要点。

本方案可稳定地获得单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1和HSV-2）的活病毒斑形成单位（PFU）计数。最佳结果采用低代次（传代次数低于155代）的Vero细胞（转化的非洲绿猴肾上皮细胞），并在α-MEM培养基中常规培养获得17 添加10%胎牛血清（FCS）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺及抗生素/抗真菌剂混合物18Vero细胞通常每周在此培养基中传代两到三次 1/5 每次稀释。

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方案

所有涉及Vero细胞和活体疱疹病毒的操作均已被陶森大学机构生物安全委员会批准。这些操作的通用流程如图1所示。

1. Vero 细胞的接种

  1. 在进行蚀斑试验的前一天，用胰蛋白酶消化Vero细胞，并将其重悬于常规的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，按照标准细胞培养方法添加补充物19。将消化后的细胞以每T-75培养瓶汇合的Vero细胞（约107个细胞）加入10 mL DMEM进行重悬。
    注：蚀斑试验使用DMEM而非α-MEM，因为DMEM可略微减缓细胞生长速率，从而获得更佳的蚀斑试验结果。
  2. 采用研究者偏好的方法对细胞进行计数（例如，使用台盼蓝排斥法的标准血细胞计数板）19。
  3. 以每孔4 × 106个细胞的密度接种细胞；对于HSV-2，使用6孔板，每孔加入2.5 mL含补充物的DMEM；对于HSV-1，使用12孔板，每孔加入1.25 mL含补充物的DMEM。
    注：无论使用何种培养板，接种的细胞数量应保持恒定，但孔的尺寸会影响蚀斑试验的准确性。必须确保细胞均匀分布，最有效的方法是前后摇动培养板，而非以环形方式晃动。
  4. 将细胞置于加湿的培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
    ​注：培养箱底部放置含有除藻剂的蒸馏水盘以维持湿度。

2. 样品稀释

  1. 在一个实验环节内完成样品稀释以及将病毒加入细胞的操作。
    注意：HSV-1 和 HSV-2 对人类具有传染性，必须在适当的生物安全防护条件（BSL-2）下操作。所有与病毒接触过的材料均应单独存放，并在从生物安全柜中移出前，使用1/256稀释的季铵盐类消毒剂（见材料表）、碘伏、漂白剂或强离子型去污剂（如SDS）进行消毒处理。
  2. 在Vero细胞接种后的第二天 ，用1×PBS对每种待进行蚀斑分析的病毒样品进行系列稀释；通常采用10倍梯度稀释，以便更精确地追踪。
  3. 根据病毒浓度情况，将样品稀释至10-4（病毒浓度较低时）或10-9（预期样品滴度较高时），并确保每种稀释样品至少保留1 mL用于后续蚀斑实验。
  4. 将所有病毒稀释液置于冰上保存（不超过1小时），待准备将稀释后的病毒样品加入细胞时再取出使用。

3. 将病毒加入细胞

  1. 用移液器从一至两个孔中吸除细胞培养基。
    注意：请勿使用抽吸装置，因其会过度移除细胞单层上的液体，导致细胞干燥。一个关键注意事项是确保在整个实验过程中细胞单层始终保持湿润。若细胞干燥，在最后步骤中将从培养板上脱落，从而产生无法使用的数据。因此，每次仅处理一至两个孔，以降低此风险。
  2. 将稀释后的病毒样品（6孔板每孔使用100–400 µL，12孔板每孔使用50–200 µL）沿孔壁逐滴加入每个细胞单层中。重复此操作，每次处理一至两个孔，直至整块培养板的所有孔均加入待进行蚀斑实验的病毒样品。
    注意：若将液滴滴加至孔中央，可能意外使细胞从基质上脱落。
  3. 用手轻轻晃动整块培养板，确保含有病毒的PBS覆盖每个孔中的全部细胞单层，随后将培养板置于37 °C的CO2培养箱中，使病毒吸附。
  4. 在1小时内每隔10分钟，将培养板从培养箱中取出，再次轻轻晃动以使病毒在各孔中分布更均匀，然后放回培养箱。
    注意：每个实验所需的重复次数及所用稀释度由实验设计决定，由读者自行确定。
  5. 为降低误计未吸附接种物的可能性，使用1000 µL移液器吸头将病毒样品从孔中移除，并放入废液杯中。
    注意：同样，此操作每次仅处理一至两个孔，以维持细胞单层的湿润状态。
  6. 每孔加入2.5 mL甲基纤维素覆盖层（将5%甲基纤维素（w/w）溶于100 mL PBS中，于121 °C、15 psi条件下液体循环灭菌15分钟，然后加入375 mL DMEM和25 mL胎牛血清）。
  7. 当整块培养板均加入覆盖层后，将培养板重新放回培养箱中，继续培养两天。
    注意：若病毒与细胞在DMEM加补充物条件下培养三天，可能导致细胞单层出现显著脱落，从而影响最终数据的可靠性。
  8. 在将废液杯移出生物安全柜前，应对其进行消毒处理，通常可加入漂白剂、碘伏或其他类似病毒灭活剂。

4. 斑块染色

  1. 经过两天的孵育后，用移液器逐个或每次一至两孔地移除甲基纤维素覆盖层，并将其放入废液杯中。
  2. 向每个孔中加入约 2 mL 的 1% 结晶紫溶液（见材料表），溶剂为 50% 乙醇，用于染色噬斑。
    注意：无需完全移除覆盖层的每一滴液体。
  3. 将所有孔加满染液的培养板在 37 °C 下孵育 30 分钟。此时，按照步骤 3.8 的方法对废液杯进行消毒处理。
  4. 用自来水强力冲洗培养板，直至流出的水变澄清。
    注意：轻微的水流冲洗力度不足；必须使用实验室水槽装置的全水压进行冲洗。
  5. 此时应确保每个稀释系列之间的噬斑数量相差约 10 倍。
  6. 将培养板倒置过夜晾干，之后即可对单个噬斑进行计数。

5. 计数噬菌斑并确定病毒滴度

  1. 无论采用何种方法（参见下文注释），均需将噬斑数乘以稀释倍数（例如，若在 10-4 孔中计数噬斑，则噬斑数需乘以 104）。
    注释：尽管在 10–100 个噬斑范围内计数具有一定的实用性5，但对含有 30–300 个噬斑的孔进行计数相对更为可靠，且该方法考虑了约 ½-log 稀释梯度，而非整 log 稀释梯度。
  2. 将上述所得数值除以接种物的体积（同上一步骤 3.2），并对所有处于指定范围内的孔的数值取平均值，以获得原始样本中 HSV 的最准确滴度。
  3. 执行步骤 5.3.1 至 5.3.5 中的计算，可参考使用 表 1 中的模拟数据。
    1. 仅考虑含有 30–300 个噬斑的孔（见步骤 5.1）。因此，在 表 1 中，仅使用第 10-5 列的重复样本 1、2 和 3 的数据。
    2. 取给定稀释度下的噬斑数，乘以该稀释倍数的倒数。因此，样本 1 在 10-5 稀释度下的 81 个噬斑，应换算为 81 个噬斑 × 105。
    3. 然后将该数值除以加入该孔细胞中的病毒稀释液体积（单位为 mL）。假设 表 1 中 HSV-1 的数据来自 12 孔板，则最合适的体积为 0.2 mL。因此，步骤 5.3.2 的计算结果变为 (81 × 105) ÷ 0.2 mL，即 4.0 × 107 PFU/mL 的 HSV-1。
    4. 对所有有效数据重复此计算过程并取平均值。因此，假设所有 10-5 列的样本均来源于同一样本，并且生物学重复实验旨在获得最准确的滴度测量值，则应对 10-5 列中所有样本执行步骤 5.3.2–5.3.3 的计算。以 表 1 为例，将 4.0 × 107、2.1 × 107 和 2.6 × 107 PFU/mL 取平均，得到该样本的最终平均滴度为 2.9 × 107 ± 0.98 × 107 PFU/mL。

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结果

表1显示了一个具有理想结果的实验。所有10倍稀释均表现出噬菌斑计数大约降低10倍的趋势。此类数据也可在图2中观察到，该图为一次真实的噬菌斑测定实验，三个重复样本中可计数的噬菌斑数量均出现在10-4稀释度范围内。同样情况也见于图3的上排，其中可计数的噬菌斑数量出现在10-3稀释度。

然而，图3 的底行显示了当噬斑实验操作不佳时会得到完全不同的结果。首先，任何稀释度下可见的噬斑都极少，因此数据无法使用。其次，在孔板顶部周围可见细胞完全从基质上脱落的区域，这表明实验过程中可能使细胞干燥，或在该区域加样时吹打过于剧烈。

表2 还显示了一组可能异常的噬斑计数结果，需在操作过程中加以注意。值得注意的是，无论是在上排还是下排的重复实验中，当从一个稀释度转移到下一...

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讨论

虽然蚀斑实验的历史几乎与哺乳动物细胞培养本身一样悠久，但似乎每个实验室都有自己的一套执行这一基本实验的方案5,6,10,11,12,13,14,15,16,20。尽管已发表的每种蚀斑实验方案在操作步骤上仅有细微差异，但很少有文献阐明获得稳定结果所需的关键细节。

因此，本实验方案中某些步骤更依赖操作技巧而非严格的科学规...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢多年来在我们的实验室（PJD 和 BJM）中与我们一起工作并不断完善这些方法的无数学生。特别感谢 Stan Person，在他的指导下，该方法最初得以建立。本研究部分得到了陶森大学费舍尔科学与数学学院本科生研究支持基金以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）“通向学士学位的桥梁”项目资助 5R25GM058264 的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning3512
6孔板Corning3516
Alpha-MEMLonza12169F
抗生素/抗真菌剂Gibco15240096
结晶紫Alfa AesarB2193214
DMEMGibco11965092
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含 Mg++ 或 Ca++）Gibco14190144
胎牛血清Millipore-SigmaTMS-013-B
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Glutamax）GibcoGS07F161BA
血细胞计数板Thermo Fisher02-671-54
甲基纤维素Millipore-Sigma27-441-0
季铵盐类消毒剂（Lysol I.C.）Thermo FisherNC9645698
台盼蓝Corning25900CI
胰蛋白酶CytivaSH30042.01
Vero 细胞ATCCCCL-81

参考文献

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