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从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

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DOI：

10.3791/62964

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2022年7月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。

摘要

小胶质细胞作为脑内常驻的巨噬细胞，在多种生理功能中发挥关键作用，包括应对环境应激和维持脑内稳态。小胶质细胞可呈现出广泛的活化表型。此外，表现出促炎表型的小胶质细胞与神经发育障碍及神经退行性疾病均有关联。体外研究被广泛用于评估特定细胞类型中潜在治疗策略的有效性。在此背景下，相较于小胶质细胞系或干细胞来源的小胶质细胞，利用原代小胶质细胞培养进行体外小胶质细胞活化及神经炎症研究更具相关性。然而，某些原代培养方法可能存在可重复性不足的问题。本实验方案提出了一种可重复且有效的方法，即通过磁珠分选技术从新生幼鼠中分离小胶质细胞。本文展示了在刺激后4小时和24小时，通过mRNA表达定量及Cy3标记微球吞噬实验来评估小胶质细胞活化状态的方法。本研究旨在提供一种简便且可重复的技术，用于从幼年发育阶段动物中分离出具有生理相关性的小胶质细胞。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统中定居的巨噬细胞样细胞，起源于卵黄囊的造血前体细胞，在胚胎早期发育过程中迁移至神经上皮1。除了免疫功能外，它们在神经发育过程中也发挥重要作用，特别是在突触形成、神经元稳态和髓鞘化过程中2。在成年期，小胶质细胞会延伸出长长的细胞突起，持续地扫描周围环境。当出现稳态破坏情况，如脑损伤或脑部疾病时，小胶质细胞可改变其形态，转变为阿米巴样形状，迁移至损伤区域，并增加释放多种细胞保护性或细胞毒性因子。小胶质细胞的活化状态具有异质性，取决于其发育阶段以及所受损伤的类型3,4,5。本研究中，这些活化状态被宽泛地分为三种不同表型：促炎/吞噬性、抗炎性和免疫调节性，但需注意实际情况可能更为复杂6。

研究 体内 由于（1）断奶前动物的脆弱性以及（2）小胶质细胞数量较少，脑发育早期阶段的小胶质细胞活化及神经保护策略筛选可能具有挑战性。因此 体外 小胶质细胞研究广泛用于毒性评估7,8,9神经保护策略5,10,11,12,13,14，以及共培养体系15,16,17,18,19,20,21. 体外 研究可采用小胶质细胞系、干细胞来源的小胶质细胞或原代小胶质细胞培养。这些方法各有优缺点，具体选择取决于初始的生物学问题。使用原代小胶质细胞培养的优势在于其均一的遗传背景、无病原体历史，以及可在动物死亡后精确控制小胶质细胞的刺激时间22.

多年来，已开发出多种方法（流式细胞术、振荡或磁性标记）用于培养新生及成年啮齿类动物的原代小胶质细胞23,24,25,26,27,28,29。本研究采用先前描述的磁性激活细胞分选技术，从小鼠新生幼崽中分离小胶质细胞，该技术使用包被抗小鼠CD11b抗体的磁珠25,27,29。CD11b是一种整合素受体，表达于包括小胶质细胞在内的髓系细胞表面。在脑内无炎症刺激的情况下，几乎所有CD11b+细胞均为小胶质细胞30。与此前发表的其他方法23,24,25,26,27,28,29相比，本实验方案在即时的ex vivo小胶质细胞活化分析与常规的in vitro原代小胶质细胞培养之间实现了平衡。因此，小胶质细胞的处理包括：（1）在出生后第8天（P8）进行分离，无需去髓鞘化；（2）无血清培养；（3）在脑组织分离后48小时才暴露于siRNA、miRNA、药理化合物和/或炎症刺激。上述三个方面使本方案具有高效性和时效性。首先，使用幼年小胶质细胞可在培养中获得具有动态性和反应性的活细胞，且无需额外的去髓鞘步骤，从而避免可能影响小胶质细胞in vitro反应性的干扰因素。本方案旨在尽可能模拟小胶质细胞的生理环境。事实上，小胶质细胞在体内从不接触血清，因此本方案也无需使用血清。此外，在培养后仅48小时即进行干预，有助于防止小胶质细胞丧失其生理功能。

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方案

本方案已获批准，所有动物操作均遵循法国国家健康与医学研究院（Inserm）的机构指南。实验从24只P8阶段的OF1小鼠幼崽（雌雄均有）脑组织中分离小胶质细胞，并将其接种于6孔、12孔或96孔板中。实验操作均在超净工作台内进行，以维持无菌条件。

1. 分离和细胞培养用无菌溶液的制备

  1. 使用市售的10倍浓度溶液（参见材料表），配制50 mL不含Ca2+和Mg2+的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS-/-）。
  2. 使用市售组织解离试剂盒（参见材料表），按照表1中提供的组分配制解离混合液。
  3. 使用市售的10倍浓度溶液，配制200 mL含Ca2+和Mg2+的1×HBSS（HBSS+/+）。
  4. 配制200 mL含0.5% BSA的1×PBS（以下简称细胞分选缓冲液）。
  5. 按照表2配制CD11b-磁珠。
  6. 配制500 mL无血清巨噬细胞培养基（SFM）并加入1%青霉素-链霉素（P/S）。分装至50 mL离心管中，4 °C保存。后续文本中将此培养基称为小胶质细胞培养基。
    注意：所有分离用溶液必须在实验当天无菌条件下新鲜配制，并置于冰上保存。小胶质细胞培养基可提前配制，分装至50 mL离心管中，4 °C保存以备后续使用。无需过滤。

2. 大脑解剖

  1. 使用大剪刀剪下幼鼠头部，无需预先进行全身麻醉。
  2. 用小剪刀沿矢状缝从颈部至鼻部剪开皮肤（15–20 mm）（图 1A–C）。
  3. 将小剪刀尖端插入枕骨大孔，与颅骨平行，小心地从两侧向眼睛方向剪开（图 1D、E）。
  4. 用小剪刀在两眼之间剪开，使颅骨和脑组织与头部分离（图 1F）。
  5. 用两把镊子夹住靠近嗅球的颅骨部位，小心撕开颅骨，注意不要损伤下方的脑组织（图 1G–I）。
  6. 用刀片去除小脑和嗅球，并将脑组织切成两部分（图 1J）。
  7. 将脑组织放入含有 30–40 mL HBSS-/- 的培养皿中（图 1K）。

3. 脑组织解离与磁珠法小胶质细胞分离

注意：所有细胞操作和重悬步骤必须使用 1,000 µL 移液器谨慎进行。施加过大的机械力可能会激活或杀死小胶质细胞。

  1. 根据表1，将12个脑组织块（约1.2 g）转移至含有解离混合液的解离管中。对于24只幼鼠，需要四个C管（图2A-B）。
  2. 将C管置于解离仪上（开启加热模式）。按照制造商说明，在设备中启动优化的NTDK程序（图2D）。
  3. 在4 °C条件下以300 × g离心20秒以收集全部细胞。使用1,000 µL移液器上下吹打三次，完成机械解离（图2E）。
  4. 将细胞转移至四个含细胞筛的15 mL离心管中。用10 mL HBSS+/+冲洗细胞筛（图2F）。
  5. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟 ，弃去上清液。用10 mL HBSS+/+小心重悬沉淀（图2G）。
  6. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟 ，弃去上清液。用6 mL分选缓冲液（步骤1.4）小心重悬沉淀（图2H）。
  7. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟 ，弃去上清液。每管加入200 µL CD11b磁珠溶液（步骤1.5），并小心重悬（图2I）。
  8. 在4 °C条件下孵育15–20分钟。用6 mL分选缓冲液小心重悬沉淀（图2I-J）。
  9. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟 ，弃去上清液。用8 mL分选缓冲液小心重悬沉淀（图2K）。
  10. 按照分离仪上的POSSEL程序（见材料表）准备八根柱子。将细胞以每管1 mL逐次转移至柱子上。每次加入下一毫升前，需等待所有细胞完全通过柱体。用1 mL分选缓冲液在无菌洗脱板中洗脱CD11b+细胞（图2L）。
  11. 将CD11b+细胞收集至一个新的50 mL离心管中（图2M）。
  12. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟 ，弃去上清液。用10 mL冷的微胶质细胞培养基（步骤1.6）小心重悬沉淀（图2N）。
  13. 计数CD11b+细胞。在P8阶段，每只小鼠大脑可获得约650,000个细胞。
    注：在本方案中，细胞计数使用自动细胞计数仪完成（见材料表）。
  14. 将细胞重悬于冷的微胶质细胞培养基中，终浓度为650,000–700,000个细胞/mL，并分装至细胞培养板中。
    注：6孔板用于Western Blot （每孔2 mL）；12孔板用于RT-qPCR分析（每孔1 mL）；96孔板用于吞噬功能检测（每孔250 µL）；本研究使用了上述三种板型。然而，本文未展示Western Blot分析结果，但该方法可用于本方案。
  15. 将培养板置于37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。使用1,000 µL移液器小心更换为预热的微胶质细胞培养基。
  16. 在刺激前，将培养板继续置于37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。
    注：不建议从超过36只幼鼠或P9以后的小鼠中分离微胶质细胞。这将增加污染风险以及细胞碎片积累，从而激活微胶质细胞。

4. 细胞刺激

  1. 根据表3使用市售试剂（参见材料表）配制刺激试剂。
  2. 向每个刺激孔中加入适当体积的试剂。
    注意：适当体积取决于刺激物的浓度和孔的大小。
  3. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至完成6 h、24 h或48 h的刺激。
  4. 进行Western Blot分析时，吸除上清液，用移液器加入50 µL蛋白裂解缓冲液（参见材料表）。使用枪头刮取培养板底部，使裂解的细胞脱落，并将其转移至1.5 mL离心管中，于-80 °C保存。
    注意：若正确吸除上清液，培养板可在-80 °C长期保存数年。
  5. 进行RT-qPCR分析6,31时，吸除上清液，将培养板直接于-80 °C保存，直至进行mRNA提取（步骤5）。
  6. 关于吞噬功能检测，请参见步骤6。

5. mRNA 提取与 RT-qPCR 分析

  1. 按照制造商的说明进行RNA提取、逆转录PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（RT-qPCR）（参见材料表）。引物序列见表45,6,31。
  2. 参照先前发表的研究方法5进行实时定量PCR（RT-qPCR）分析。

6. 吞噬功能检测

  1. 在刺激的最后3小时进行细胞刺激并执行吞噬实验。例如，若刺激时间为6小时，则在刺激开始3小时后启动吞噬实验；若刺激时间为12小时，则在刺激开始9小时后启动吞噬实验。
  2. 根据细胞与微珠的比例（1个细胞: 50个微珠）计算所需微珠数量。对于96孔板中的每孔，需要8.1 × 106个微珠。按照表5配制微珠混合液。
    注意：在将微珠加入PBS/FBS混合液前，需充分涡旋震荡微珠储存管。
  3. 在37 °C水浴中孵育1小时，每10分钟涡旋震荡一次。
  4. 计算需加入每孔的溶液体积，加入溶液后孵育3小时。
  5. 用1× PBS洗涤各孔三次，于550 nm波长处检测荧光发射（Cy3发射波长）。

7. 纯度质量控制

  1. 通过流式细胞术（FACS）评估 CD11b 磁珠分离的纯度（细胞分选前后），然后进行 RT-qPCR。
    1. 计数细胞，并重悬于 FACS 缓冲液（PBS + 2 mM EDTA + 0.5% 牛血清白蛋白）中，以在步骤 3.5 和步骤 3.14 后获得 10 × 106 个细胞/mL 的稀释浓度。
    2. 常规 Fc 封闭孵育 15 分钟后32,33，加入活力探针（FVS780）以及针对小鼠 CD45、CD11b、CX3CR1、ACSA-2、O4 的荧光标记抗体或其相应的同型对照抗体32,33 ，继续孵育 15 分钟（抗体浓度按制造商推荐，参见 材料表）。
    3. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞，固定并使用市售的透化试剂盒进行透化处理（参见 材料表）。
    4. 对透化后的细胞再次进行 Fc 封闭，然后加入针对 NeuN 的荧光标记抗体或其同型对照抗体（参见 材料表），孵育 15 分钟。
    5. 用 FACS 缓冲液洗涤后进行流式细胞术分析。
    6. 根据形态学参数和 FVS780 染色分别排除双联体和死细胞，随后设定门控策略，分析 CX3CR1（小胶质细胞）、ACSA-2（星形胶质细胞）、O4（少突胶质细胞）的表面表达以及 NeuN（神经元）的胞内表达，以确定各细胞类型的阳性细胞百分比。
  2. 在步骤 5 之后提取 mRNA，并进行 RT-qPCR，以定量 Itgam (CD11b)、Cx3cr1、Olig2、Synaptophysin 和 Gfap mRNA 的表达水平。使用 Rpl13a mRNA 作为内参对 Cq 值进行归一化，并以 Itgam mRNA 为参照计算相对表达量。

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结果

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，在暴露于环境刺激（如创伤、毒性分子、炎症）时会被激活。4,5,6,34 (图3A). 体外 小胶质细胞研究常用于评估与这些环境刺激相关的细胞自主机制，并表征药物或遗传干预后的活化状态。本文介绍一种利用磁珠偶联法分离幼年阶段原代小胶质细胞的技术。

小胶质细胞活化的简易检测方法 体外 旨在定量检测多种与促炎表型相关的 小胶质细胞反应性标志物 的 mRNA 表达水平（Cd86、Nos2、Ptgs2、Tnf 或抗炎表型（Cd206、Igf1、Arg1、Lgasl35,

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讨论

本研究采用磁珠分选CD11b+细胞的方法建立了原代小胶质细胞培养体系。除了对小胶质细胞功能进行评估（RT-qPCR和吞噬功能检测）外，还测定了小胶质细胞培养的纯度。

经典的原代小胶质细胞培养通常来源于出生后第1至第2天（P1或P2）的啮齿类动物幼鼠脑组织，并与星形胶质细胞共培养至少10天。随后通过轨道摇床进行机械分离以获取小胶质细胞。小胶质细胞的分离与培养方法 体外 在20世纪90年代末首次从小鼠幼鼠的大脑中被描述40,41自那时起，该方法被广泛用于分析小胶质细胞表型，例如活化/静息状态的小胶质细胞或促炎性/抗炎性小胶质细胞。此外，该实验对于界定与神经元共培养时小胶质细胞的神经毒性作用具有基础性意义。然而，2014年，Biber 及其合作者描述了研究小胶质细胞存在的三个显著缺陷 体外 使用传统方法42.(1) 本实验使用大鼠/小鼠新生脑组织（P1/P2），这些细胞未经历所有可能的成熟...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

图示使用 BioRender 制作。本研究由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、巴黎大学、欧盟“地平线2020”计划（PREMSTEM-874721）、法国基金会、ARSEP 基金会、大脑研究基金会、摩纳哥格蕾丝基金会，以及“未来投资计划”（Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 和 Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.）的额外资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
抗小鼠 CD11b BV421索尼生物技术1106255
抗小鼠 CD45 BV510索尼生物技术1115690
抗小鼠 CX3CR1 PE Cy7索尼生物技术1345075
抗小鼠 NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
抗小鼠O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm 透化试剂盒BD 生物科学554655
牛血清白蛋白Miltenyi Biotec130-091-376
CD11b（小胶质细胞）MicroBeads，人源，鼠源Miltenyi Biotec130-093-634
共聚焦显微镜Leica TCS SP8
D-PBS（10倍浓度）赛默飞世尔科技14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon 细胞培养 12 孔板，平底 + 盖子Dutscher353043
Falcon 细胞培养 96 孔板，平底，带盖Dutscher353072
50 mL Falcon管Dutscher352098
Fc阻断试剂（小鼠CD16/32）BD 生物科学553142
荧光显微镜尼康 ECLIPSE TE300
gentleMACS C 管（4 × 25 支）Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo 组织解离器（带加热模块）Miltenyi Biotec130-096-427
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) +CaCl₂2 +MgCl2 10x赛默飞世尔科技14065049
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）-CaCl₂2 -MgCl2 10x赛默飞世尔科技14185045
iQ SYBR 绿色超级混合液Bio-rad1725006CUST
Iscript cDNA 合成Bio-rad1708890
荧光红色氨基修饰聚苯乙烯乳胶微球Sigma-AldrichL2776-1mL
脂多糖（LPS）来自 大肠杆菌 O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM 无血清培养基赛默飞世尔科技12065074
MACS BSA 储存液Miltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainer（70 μ米），4 × 25 件Miltenyi Biotec130-110-916
小鼠 IgG1 PEMilliporeMABC002H
小鼠 IgG2a PE Cy7索尼生物技术2601265
小鼠 IL1βMiltenyi Biotec130-101-684
多-24 柱块Miltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 分离器Miltenyi Biotec
神经组织解离试剂盒 - 木瓜蛋白酶Miltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top 锥形离心管赛默飞世尔科技362694
OPTILUX 培养皿 - 100 × 20 mmDutscher353003
Pé青霉素-链霉素（10 000 U/mL）赛默飞世尔科技15140122
大鼠 IgG2b，k BV421BD 生物科学562603
大鼠 IgG2b，k BV510索尼生物技术2603230
REA对照（S）PE Vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA对照（S）Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
重组小鼠 IFN-γ 蛋白R&D系统485-MI
重组小鼠 IL-10 蛋白R&D系统417-ML
重组小鼠 IL-4 蛋白R&D系统404-ML
RIPA缓冲液Sigma-AldrichR0278
活力探针（FVS780）BD 生物科学565388

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