本文介绍了一种优化的完整卵巢成像方案，可用于通过整体免疫染色、多光子显微镜以及三维可视化与分析进行定性和定量研究。该方案适用于高通量、可靠且可重复的操作，可用于卵巢功能的毒理学、临床诊断及基因组学检测。
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本文内容
摘要
摘要
女性生育力和生殖寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，在胎儿期卵母细胞减少（FOA）过程以及出生后第一周内，约有80%进入减数分裂前期I的女性生殖细胞被清除。在发育过程中，有三种主要机制调控存活卵母细胞的数量，并最终建立青春期女性的卵巢储备。第一波卵母细胞丢失发生在早期FOA阶段，此时30%至50%的卵母细胞因长散布核元件-1（LINE-1）高表达而被清除。第二波丢失是通过减数分裂质量监控点清除具有减数分裂缺陷的卵母细胞。第三波丢失发生于围产期原始卵泡形成阶段，部分卵母细胞因未能成功形成卵泡而被淘汰。目前尚不清楚这三波卵母细胞丢失各自受何种机制调控，以及它们如何在小鼠和人类中共同塑造卵巢储备。
免疫荧光与三维可视化技术为在完整卵巢的背景下而非信息量较少的二维切片中成像和分析卵母细胞发育开辟了新途径。本文提供了一套完整的全卵巢免疫染色与光学透明化操作方案，所得样品可用于多光子显微镜成像以及利用商业软件进行三维建模。该方法可用于展示C57BL/6J小鼠卵巢发育过程中卵母细胞损耗的动态变化，并量化卵母细胞在三个消除波次中的丢失情况。本方案适用于产前及出生后早期卵巢的卵母细胞可视化与定量分析，也可用于其他定量研究。尤为重要的是，该方案经过战略性设计，可实现高通量、可靠且可重复的处理，满足生殖毒理学、临床诊断以及卵巢功能基因组学检测的需求。
引言
大多数哺乳动物的雌性个体出生时携带有限数量的处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞，这些卵母细胞储存在原始卵泡中，构成了卵巢储备（OR）1,2。卵巢储备决定了雌性整体的生殖寿命和生殖健康3。卵巢储备的规模通常会随着年龄增长而自然减少，并可能因暴露于某些基因毒性物质（如辐射/化疗）或环境应激（如营养不良）而提前耗竭，从而导致不孕4,5,6。特发性女性不孕往往与来自卵巢储备的卵子在发育过程中的遗传和生理质量有关，但其机制仍不甚清楚7,8。由于雌性个体的卵泡储备在出生时已基本确定，因此深入理解卵巢储备建立与维持过程中的调控机制至关重要。
在小鼠中，卵泡（OR）的形成始于胚胎第（E）7.5天左右原始生殖细胞（PGCs）的特化2。PGCs迁移至生殖嵴，并于约E10.5时定植于此9。随后发生广泛的增殖，但由于胞质分裂不完全，形成囊状结构，这些结构将在后续发育过程中....
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方案
本研究所使用的小鼠均为 C57BL/6J 遗传品系（见材料表）。该品系已完成全基因组测序，是研究卵巢结构与功能的常用标准品系。小鼠的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，实验操作均经杰克逊实验室机构动物护理与使用委员会批准。本实验方案中所用的试剂和配方分别列于材料表和表1中。
1. 试剂的准备
- 固定液：在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA）。例如，对于24个样品（每个样品0.5 mL，总体积为12 mL），将3 mL 16%电子显微镜级PFA加入9 mL 1× PBS中。
- 通透缓冲液
- 在需要使用通透缓冲液的前一天，将聚乙烯醇（PVA）称量后加入含有1× PBS的250 mL塑料烧杯中。持续搅拌过夜，以确保PVA完全溶解。
- 向已溶解的PVA中加入硼氢化钠，混合物均质化约3–5分钟。溶液可能出现起泡现象，属正常情况。
- 向溶液中加入Triton X-100，待Triton X-100完全溶解后即可使用该缓冲液。
注意：PVA溶解耗时较长（至少3小时），抗体渗透效果取决于其溶解程度。对于较大的卵巢组织，必须确保PVA完全溶解。
- 封闭缓冲液
- 将牛血清白蛋白（BSA）称量后加入含有1....
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结果
通过全卵巢的免疫染色与成像，可利用相同的技术和标记物对不同发育阶段的卵母细胞或卵巢中的蛋白表达进行可视化与定量分析（图3）。本方案最初为一项大规模研究项目开发，该项目需要对多种发育阶段及多个小鼠品系的卵巢进行分析。本文展示了针对C57BL6/J品系所获得的数据，该品系是遗传学分析中的标准品系。本研究所介绍的技术操作简便，可在14–19天内获得结果（图2D），并适用于产前、青春期前及青春期雌性个体的卵巢分析（图1 和 图2A、B）。
该方法被用于研究在卵巢卵母细胞储备自然形成过程中发生的卵母细胞丢失的动态变化。在包括小鼠在内的许多生物中，卵母细胞数量被认为在胚胎期进入减数分裂时（约E13.5）达到峰值。随后，由于尚不完全明确的胎儿期卵母细胞减少过程（fetal oocyte attrition, FOA）（约E15.......
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讨论
本文介绍了一种针对产前和产后卵巢组织的详细三维免疫染色与成像方案，适用于高通量及比较性研究，可用于生殖细胞定量分析和蛋白质定位。我们开发该方案旨在分析10至16个不同品系小鼠在6个发育时间点（每组N=6-12）卵巢中的卵母细胞数量，通常每次处理2至4块24孔板。该方法可适用于其他器官或细胞标记物的研究。例如，通过选用适当的抗体，本方案可用于标记和可视化卵巢中的体细胞（如颗粒细胞），从而促进对体细胞-生殖细胞相互作用或其他卵巢细胞类型发育的研究。
该方案及抗体组合的一个局限性在于无法明确鉴定不同的卵泡发育阶段。在免疫荧光和二维成像中，通常利用DNA染料通过颗粒细胞核的层数来识别卵泡阶段，但这种方法在三维成像中效果不足。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst染料由于光穿透能力有限且在大块组织内部信号衰减，很少用于全器官染色。碘化丙啶（PI）是一种小分子染料，能够深入组织内部，但由于其光谱与其他荧光信号重叠，在多光子成像系统中难以捕获。通过添加针对颗粒细胞的特异性标记物（如抗苗勒管激素（AMH）或FOXL247.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01 HD093778 资助 E.B-F，T32 HD007065 资助 R.B）的支持。我们感谢 Zachary Boucher 在辐射实验中的协助。我们感谢 Mary Ann Handel 对稿件的审阅。我们衷心感谢 Sonia Erattupuzha 以及杰克逊实验室显微成像核心服务中心在本出版物所述显微成像工作中提供的专业协助，同时感谢杰克逊实验室科学仪器服务中心的 Jarek Trapszo 为设计3D打印适配器载玻片所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 台式培养箱 | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C 培养箱 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | 杰克逊实验室（The Jackson Laboratory） | 000664 | 近交系小鼠品系 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D1435 | 危险物质 |
| D-山梨醇 | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 镊子 | FST | 91150-20 | |
| FastWells 试剂屏障 | GraceBio | 664113 | 具有粘性且柔韧的硅胶垫圈（粘附式微孔） |
| 精细剪刀 | FST | 91460-11 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| 甘氨酸 | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | 稀释比例 1:1000 |
| 山羊抗大鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | 稀释比例 1:1000 |
| 山羊血清 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS 软件 | Oxford Instruments | 版本 9.7.0 | 图像可视化与分析软件 |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 可调超快激光器 | 多光子成像用激光器 |
| LASX 软件 | Leica | 版本 3.5.6 | 图像采集软件 |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | 多光子显微镜 |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee 一体式超快激光器 | 多光子成像用激光器 |
| Masterflex 泵控制器 | SPW Industrial | 型号：7553-50 | 灌注用蠕动泵 |
| 梅奥剪刀 | FST | 14010-17 | 5” –7” 钝头/钝头剪刀，用于断头术 |
| 方形显微盖玻片，No. 1.5，25×25 mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | 适用于 37 °C 培养箱的摇床/振荡器 |
| Nikon 人体工学立体显微镜 SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | 体视显微镜 |
| 16% 多聚甲醛（甲醛水溶液） | 电子显微技术科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 15710 | 危险物质 |
| PBS 片剂，磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | 溶于 Milli-Q 水 |
| 青霉素-链霉素，200 倍浓度，双抗溶液 | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| 聚乙烯醇（PVA） | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol（N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺） | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| 兔抗 DDX4/MVH 抗体 | Abcam | ab27591 | 稀释比例 1:500 |
| 兔抗 LINE-1 ORF1p 抗体 | Abcam | ab216324 | 稀释比例 1:500 |
| 大鼠抗 TRA98/GCNA 抗体 | Abcam | ab82527 | 稀释比例 1:500 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | 危险物质 |
| 硼氢化钠 | Sigma-Aldrich | 452882 | 危险物质 |
| 蔗糖 | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar 轨道摇床 | Bimedis | VXR-S10 | 室温用摇床 |
| 三乙醇胺 | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK 灌注套装 | MYCO Medical | 7001-23 | 灌注用针头 |
| 尿素 | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | 序列号 XT640-W-0147 | 低功率 LED 荧光灯 |
参考文献
- Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).
- Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
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重印与许可
