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小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

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DOI：

10.3791/62972

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2021年9月3日

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1The Jackson Laboratory

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的完整卵巢成像方案，可用于通过整体免疫染色、多光子显微镜以及三维可视化与分析进行定性和定量研究。该方案适用于高通量、可靠且可重复的操作，可用于卵巢功能的毒理学、临床诊断及基因组学检测。

摘要

女性生育力和生殖寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，在胎儿期卵母细胞减少（FOA）过程以及出生后第一周内，约有80%进入减数分裂前期I的女性生殖细胞被清除。在发育过程中，有三种主要机制调控存活卵母细胞的数量，并最终建立青春期女性的卵巢储备。第一波卵母细胞丢失发生在早期FOA阶段，此时30%至50%的卵母细胞因长散布核元件-1（LINE-1）高表达而被清除。第二波丢失是通过减数分裂质量监控点清除具有减数分裂缺陷的卵母细胞。第三波丢失发生于围产期原始卵泡形成阶段，部分卵母细胞因未能成功形成卵泡而被淘汰。目前尚不清楚这三波卵母细胞丢失各自受何种机制调控，以及它们如何在小鼠和人类中共同塑造卵巢储备。

免疫荧光与三维可视化技术为在完整卵巢的背景下而非信息量较少的二维切片中成像和分析卵母细胞发育开辟了新途径。本文提供了一套完整的全卵巢免疫染色与光学透明化操作方案，所得样品可用于多光子显微镜成像以及利用商业软件进行三维建模。该方法可用于展示C57BL/6J小鼠卵巢发育过程中卵母细胞损耗的动态变化，并量化卵母细胞在三个消除波次中的丢失情况。本方案适用于产前及出生后早期卵巢的卵母细胞可视化与定量分析，也可用于其他定量研究。尤为重要的是，该方案经过战略性设计，可实现高通量、可靠且可重复的处理，满足生殖毒理学、临床诊断以及卵巢功能基因组学检测的需求。

引言

大多数哺乳动物的雌性个体出生时携带有限数量的处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞，这些卵母细胞储存在原始卵泡中，构成了卵巢储备（OR）1,2。卵巢储备决定了雌性整体的生殖寿命和生殖健康3。卵巢储备的规模通常会随着年龄增长而自然减少，并可能因暴露于某些基因毒性物质（如辐射/化疗）或环境应激（如营养不良）而提前耗竭，从而导致不孕4,5,6。特发性女性不孕往往与来自卵巢储备的卵子在发育过程中的遗传和生理质量有关，但其机制仍不甚清楚7,8。由于雌性个体的卵泡储备在出生时已基本确定，因此深入理解卵巢储备建立与维持过程中的调控机制至关重要。

在小鼠中，卵泡（OR）的形成始于胚胎第（E）7.5天左右原始生殖细胞（PGCs）的特化2。PGCs迁移至生殖嵴，并于约E10.5时定植于此9。随后发生广泛的增殖，但由于胞质分裂不完全，形成囊状结构，这些结构将在后续发育过程中被分解10,11。约在E12.5时，性腺性别被确定，卵巢中的PGC增殖停止。在雌性个体中，PGCs此时已转变为卵母细胞，并于约E13.5进入减数分裂前期I（MPI）12,13。 卵母细胞经历漫长的MPI后，在出生前后停滞于网状期（dictyate stage）。出生后的第一周内，每个停滞的卵母细胞被颗粒细胞包裹，从而形成原始卵泡。

雌性个体卵巢中原始卵泡的数量，取决于在减数分裂前期 I（MPI）阻滞之前和期间，通过凋亡、自噬或坏死等机制得以存活的卵母细胞数量14,15。第一波卵母细胞淘汰发生在胎儿发育阶段，称为胎儿期卵母细胞凋亡（FOA）。FOA 是雌性个体中一种进化上保守的过程（包括哺乳类和非哺乳类动物），根据物种不同，大约有 50–80% 的卵母细胞在此过程中被淘汰16,17,18,19。在小鼠中，FOA 发生于胚胎期 15.5 天至 18.5 天（E15.5–E18.5），其发生与逆转录转座子 LINE-1 序列的重新激活和表达导致卵母细胞死亡有关20,21。第二波卵母细胞淘汰通过减数分裂检查点实现，清除具有减数分裂缺陷的卵母细胞，例如未修复的 DNA 双链断裂（DSBs）22,23。随后的第三波卵母细胞淘汰发生在卵泡细胞簇解体过程中，并在原始卵泡形成时达到高峰，每个原始卵泡包含一个卵母细胞10,11,24,25。

在小鼠中，原始卵泡储备主要在青春期前建立，此后随着原始卵泡在正常的生殖周期中被激活并开始生长而逐渐减少。不同女性个体以及不同遗传品系的小鼠之间，卵巢储备（OR）的大小存在差异；然而，OR大小的遗传调控机制尚未被充分阐明26,27,28,29。由于缺乏标准化的研究方案来分析产前和产后发育过程中卵母细胞消除的波动规律，OR调控的遗传学研究受到限制。目前已在小鼠中建立了多种卵母细胞定量方法，其中最常见且应用最广泛的是对组织切片进行组织形态计量学评估30,31。该技术通过连续切片并使用组织学染色（如苏木精和伊红（H&E）、过碘酸-雪夫染色（PAS））或荧光标记物来识别卵母细胞。如果所有实验条件保持一致，包括切片厚度、卵巢全组织切片的完整回收以及各实验室采用的计数方案，则该方法具有较高的可靠性。然而，不同实验室报告的数据常存在显著差异，因而难以进行直接比较。

此外，由于遗传差异，使用不同的小鼠品系也可能影响卵母细胞计数。目前已开发出其他计算方法用于组织形态计量学评估，包括采用分样法自动检测卵母细胞、利用计算算法进行自动计数，以及对组织学图像进行三维重建以避免对同一卵母细胞重复计数31,32,33,34,35,36。尽管这些改进已被引入组织形态计量学评估，但该技术仍相对耗时费力，尤其在大规模和高通量研究中更为明显。由于计数方案、计算算法及所用软件的不同，不同研究之间收集的数据可能缺乏可重复性和可比性。

近年来，随着中等分辨率多光子显微镜、光片显微镜以及光学组织透明化技术的发展，对完整卵巢进行三维建模与分析的技术正逐渐成为高效定量卵母细胞数量、研究蛋白质定位与动态变化的首选方法37,38。与传统的组织学方法相比，这些三维分析方法通常具有优势，因为组织和器官在处理过程中能得到更好的保存并维持其完整性。此外，三维分析与建模能够提供有关器官内细胞微环境或亚结构之间及内部功能与相互作用的额外信息，而这些信息在二维分析中可能被遗漏。

对完整器官进行三维分析需要针对特定器官（如卵巢）优化固定、免疫染色和光学透明化方案，同时避免组织变形或损伤。为实现高分辨率显微成像，还需进一步优化样本的装载方式，且该优化可能取决于可用的成像平台。最后，对完整卵巢进行成像将产生大量数据，需进行后续的计算分析。因此，有必要开发标准化的三维方法，用于卵母细胞计数，以支持不同研究间的比较以及跨发育阶段的分析。

本方案采用标准免疫染色和既往报道的组织透明化方法，重点在于一种简单、用户友好且高通量的操作流程38,39,40,41。该方案经过优化，可用于分析大量产前及出生后至出生后第28天（P28）的卵巢，并适用于来自不同小鼠遗传背景、大小各异的卵巢。所有发育阶段的免疫染色步骤基本相似；然而，由于青春期卵巢体积较大，其透明化处理方案有所不同：小卵巢采用ScaleS4(0)，大卵巢则使用CUBIC40,41。此外，在对P28小鼠进行固定前，需先实施全身体灌注，以避免血细胞自发荧光的干扰。本研究选用基于Leica DIVE/4Tune平台构建的多光子显微镜作为光片显微镜的替代方案进行成像，并采用配备多种分析工具的IMARIS三维可视化与分析软件进行图像处理。本方案操作简便，所需人工干预较少，因而节省时间。此外，卵母细胞定量分析相对快速，具体耗时取决于卵巢大小及卵母细胞的排列情况。

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方案

本研究所使用的小鼠均为 C57BL/6J 遗传品系（见材料表）。该品系已完成全基因组测序，是研究卵巢结构与功能的常用标准品系。小鼠的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，实验操作均经杰克逊实验室机构动物护理与使用委员会批准。本实验方案中所用的试剂和配方分别列于材料表和表1中。

1. 试剂的准备

  1. 固定液：在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA）。例如，对于24个样品（每个样品0.5 mL，总体积为12 mL），将3 mL 16%电子显微镜级PFA加入9 mL 1× PBS中。
  2. 通透缓冲液
    1. 在需要使用通透缓冲液的前一天，将聚乙烯醇（PVA）称量后加入含有1× PBS的250 mL塑料烧杯中。持续搅拌过夜，以确保PVA完全溶解。
    2. 向已溶解的PVA中加入硼氢化钠，混合物均质化约3–5分钟。溶液可能出现起泡现象，属正常情况。
    3. 向溶液中加入Triton X-100，待Triton X-100完全溶解后即可使用该缓冲液。
      注意：PVA溶解耗时较长（至少3小时），抗体渗透效果取决于其溶解程度。对于较大的卵巢组织，必须确保PVA完全溶解。
  3. 封闭缓冲液
    1. 将牛血清白蛋白（BSA）称量后加入含有1× PBS的烧杯中，搅拌至BSA完全溶解。
    2. 加入甘氨酸、Triton X-100、青霉素-链霉素和叠氮化钠，搅拌至溶液均质。将缓冲液转移至瓶中，4 °C保存。使用前加入正常山羊血清。
  4. 洗涤缓冲液：将PVA加入含有1× PBS的烧杯中，搅拌过夜以确保PVA完全溶解。随后加入Triton X-100和叠氮化钠。缓冲液混合均匀后，于4 °C保存。
  5. ScaleS4(0)溶液（pH 8.1）：在烧杯中将D-山梨醇溶于PBS，并在≤100 °C条件下搅拌溶解。加入尿素，待其溶解后关闭加热，继续搅拌直至溶液完全均匀。随后加入甘油和二甲基亚砜，搅拌至溶液均质。避光、室温保存。
    注意：ScaleS4(0)溶液必须在卵巢透明化实验第一天新鲜配制。
  6. ScaleCUBIC-1溶液
    1. 在烧杯中将尿素溶于PBS，于≤100 °C条件下搅拌溶解。将N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺称量至另一烧杯中，然后加入已溶解的尿素溶液，在≤100 °C条件下继续搅拌，直至所有试剂完全溶解。所有试剂溶解后关闭加热，室温冷却。避光保存。
    2. 将溶液转移至抽滤瓶中进行脱气处理。通过管路将抽滤瓶连接至真空泵，盖好瓶口，开启真空泵，直至溶液中气泡完全消失。脱气完成后即可使用该溶液。
      ​注意：该溶液可避光保存，最多可使用一个月。
  7. 蔗糖溶液：将蔗糖溶于1× PBS中，使用前进行脱气处理。
    注意：该溶液需在使用前新鲜配制。
  8. ScaleCUBIC-2溶液
    1. 在烧杯中将蔗糖溶于PBS，于≤100 °C条件下搅拌溶解。加入尿素，在≤100 °C条件下继续搅拌至尿素完全溶解，然后关闭加热。
    2. 加入三乙醇胺和Triton X-100，搅拌至溶液均质。待溶液冷却至室温后，避光保存。使用前进行脱气处理。
      注意：该溶液可避光保存，最多可使用一个月。

2. 胚胎卵巢的解剖与固定（图1A）

  1. 根据批准的机构方案，将成年雌性（≥8周龄）与雄性小鼠进行交配。每天早晨检查阴道栓。
    注意：发现阴道栓的当天早晨定义为交配后0.5天（d.p.c）或E0.5。
  2. 在解剖当天，配制4%多聚甲醛（PFA），并将约0.5 mL分装至微量离心管中，置于操作台旁（每只怀孕雌鼠约4管）。
    注意：PFA为有害物质，必须在化学通风橱中操作。
  3. 为每只怀孕雌鼠准备三个100 mm培养皿，每个培养皿中加入约10 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS），分别用于获取子宫、解剖中肾-卵巢复合体以及分离卵巢。
  4. 对处于目标发育阶段胚胎的怀孕雌鼠实施安乐死，并立即进行解剖。每次安乐死的雌鼠数量不超过1–2只。采用机构批准的怀孕小鼠安乐死方案（例如，CO2暴露后行颈椎脱位）。
  5. 雌鼠安乐死后，用70%乙醇喷洒腹部。用镊子提起腹部皮肤，使用剪刀在腹部及体壁上剪出V形切口。沿切口两侧剪开并翻卷皮肤，暴露腹腔内器官及子宫中的胎鼠。
  6. 使用镊子和剪刀，将带有胎鼠的子宫从腹部脂肪及卵巢动静脉中剪下并分离。取出子宫并放入含有1× PBS的100 mm培养皿中。剪开子宫壁并刺破卵黄囊，使胎鼠释放至PBS中，剪断脐带。
    注意：对于妊娠15天以前的胎鼠，母体安乐死后立即取出胎鼠可确保其迅速死亡；妊娠15天以后至出生阶段的胎鼠必须通过断头法实施安乐死。
  7. 将一只胎鼠转移至盛有新鲜1× PBS的新培养皿中。对E15.5胎鼠进行断头操作时，用镊子轻轻将两后肢固定于培养皿两侧以固定胎鼠。用主手操作的另一对镊子夹住颈部并施压切断胎鼠头部，或使用剪刀剪断颈部。
  8. 用主手所持镊子在前肢下方剪开，并轻柔地将上半身拉离。随后，将主手镊子的一端垂直插入腹腔，进入腹部开口处，另一端仍保留在外。闭合镊子，夹紧体壁将其剪开，暴露内部器官。
  9. 使用同一对镊子，轻柔移除包括肠道和肝脏在内的器官，直至肾脏和生殖器官可见。判断胎鼠性别：在E15.5阶段，卵巢呈细长香肠状，而睾丸呈椭圆形。
    注意：在更早的发育阶段，可能需要通过基因分型确定性别。
  10. 用一对镊子固定雌性胎鼠，另一对镊子分别夹住每个中肾-卵巢复合体，轻柔地将其从肾脏和苗勒管中分离。将卵巢放入盛有1× PBS的新培养皿中，保留中肾附着，但去除周围组织以确保卵巢充分暴露。将两个卵巢放入约0.5 mL的4% PFA微量离心管中，于4 °C固定过夜。次日，将PFA替换为70%乙醇。
  11. 对于E18.5卵巢的解剖与固定，按上述方法将胎鼠从子宫中分离后，参照第3节所述的青春期前幼鼠操作流程（图1B）进行。

3. 青春期前卵巢的解剖与固定（图1B）

  1. 配制4%多聚甲醛（PFA），将约0.5 mL分装至1.5 mL离心管中，置于实验台旁备用（每只幼鼠约需一管）。准备含有1×PBS的35 mm培养皿（每只幼鼠约需一个）。按照机构批准的实验动物安乐死规程处死幼鼠。
    注意：对于8日龄或更小的幼鼠，首选的安乐死方法为断头法。新生小鼠可使用3-4"解剖剪或5-7"梅奥剪进行断头。
  2. 通过测量肛门生殖距判断幼鼠性别，雄性幼鼠的肛门生殖距大于雌性。使用锋利的断头剪将雌性幼鼠断头，将尸体切口朝下放置于纸巾上以排出血液（约5-10秒）。
  3. 用针固定每只脚掌的足垫，使幼鼠仰卧位固定。用70%乙醇喷洒腹部。用镊子将皮肤与身体分离，用剪刀在下腹部皮肤处剪出一个小的V形切口。
  4. 将剪刀插入皮下切口，沿腹部两侧剪开。用镊子轻轻掀开皮肤，暴露下腹部区域。轻柔地将肠道向上推移，找到位于膀胱旁的子宫角。沿每侧子宫角向肾脏方向追踪，于每侧肾脏下方找到带有周围脂肪组织的卵巢。
  5. 分离卵巢时，用一对镊子（镊子A，图1B）夹住卵巢和输卵管下方的子宫角，并轻轻将其提起远离身体。用另一对镊子（镊子B）从第一对镊子下方轻轻夹起，使脂肪垫中的卵巢和输卵管显露于第二对镊子上方。然后用剪刀在第二对镊子下方剪断，或小心牵拉以分离卵巢及其附着组织。
  6. 将分离的器官置于含1×PBS的培养皿中。修剪去除多余的脂肪组织、输卵管和子宫角，以清洁并分离出卵巢。轻柔地打开包裹卵巢的卵巢囊，充分暴露整个卵巢。
  7. 修剪卵巢囊膜时注意不要损伤卵巢，并在门部（卵巢与生殖道之间的韧带样结构）周围保留部分组织以便操作卵巢，如图1B中P5所示。修剪完成后，将卵巢放入4% PFA中，在4 °C下固定过夜。次日，将4% PFA更换为70%乙醇，并将卵巢在4 °C下保存，直至进行免疫染色实验步骤。

4. 青春期卵巢的灌注、解剖与固定（图1C）

  1. 根据机构批准的方案，在化学通风橱中对处于深度麻醉状态的小鼠进行灌流。准备灌流设备和试剂。详细方案参见 42。
    注：灌流是一种终末安乐死操作，通过组织固定剂替换整个血管系统中的血液。
  2. 称量一只青春期雌性小鼠（P28），记录其体重（通常在 13 g 至 15 g 之间）。计算所需使用批准麻醉剂的剂量。
    注：本方案中，每 10 g 体重使用 0.35 mL 三溴乙醇。
  3. 使用一支 10 mL 一次性注射器和 20 G 针头，吸取适量批准的麻醉剂。将 20 G 针头更换为 26 G × 3/8 针头。
  4. 用一只手轻轻抓住小鼠背部颈部皮肤以固定小鼠，翻转小鼠使其腹部朝上。将预先计算好的麻醉剂量注入腹腔。将小鼠放入带盖容器中，直至麻醉生效（即小鼠不再活动）。
  5. 当小鼠停止活动后，轻捏其足部以确认无反应，确保小鼠已完全麻醉后再开始灌流操作。将小鼠仰卧位固定，通过脚垫轻轻用大头针将四肢固定在板上。确保四肢处于自然放松状态，避免过度拉伸。
  6. 从腹部至胸部区域喷洒 70% 乙醇。用镊子轻轻夹起并提起腹部皮肤，然后用剪刀在皮肤和体壁上剪出一个小的 V 形切口。
  7. 将皮瓣从体腔上翻起，并将剪刀插入皮肤和体壁下方。沿中线向上直剪至胸腔边缘的胸骨处。
  8. 沿胸骨两侧小心剪开肋骨至肩胛骨稍下方，打开胸腔。注意不要刺破肋骨下方的肺组织。用镊子夹住皮肤/肋骨瓣并固定，以充分暴露内脏器官。
  9. 小心修剪可能阻碍清晰暴露心脏的组织（如胸腺），完全暴露包括胃肠道在内的所有器官，以便肉眼确认全身（包括下腹部）均已灌流。
  10. 用解剖剪剪开心脏右心房，释放循环系统中的血液。用镊子轻轻夹住心脏，并将连接至蠕动泵控制器的灌流针插入左心室。
  11. 以温和但持续的压力泵入约 10 mL PBS，直至肝脏、肾脏和生殖道等组织（图 1E、F）由粉红色变为白色。随后更换为新鲜配制的 1% PFA，继续灌流约 10 mL PFA，或直至小鼠下肢（如尾部）出现抽动。
    注：这些固定性震颤表明灌流成功。
  12. 灌流完成后，找到位于肾脏下方带有卵巢的脂肪垫，小心分离整个生殖道，包括脂肪垫、卵巢和子宫角，并将组织置于含 4% PFA 的小瓶中。室温下固定卵巢过夜（约 16–24 小时）。随后将 4% PFA 更换为 70% 乙醇，至少浸泡一天，然后按照上述方法修剪卵巢（图 1E、F），再开始免疫染色实验流程。

5. 卵巢整体免疫染色（图2A）

注意：在免疫染色过程中，尤其是在更换缓冲液时，应练习无菌技术，以防止在长时间孵育期间发生污染。

  1. 所有免疫染色步骤均在24孔板中进行，如图2A所示。若使用其他规格的实验装置，请相应调整试剂体积。更换缓冲液时需小心操作，以避免丢失微小的产前及青春期前卵巢组织。
    注意：也可使用其他规格，如48孔或96孔板，但其孔更深、开口更窄，导致在吸除缓冲液时容易丢失或损伤卵巢组织。
  2. 第1天
    1. 在洁净的24孔板中，向所需数量的孔内每孔加入1 mL PBS。将200 µL移液器吸头的尖端剪去一部分，形成较宽的开口，用此吸头将保存于含70%乙醇的1.5 mL离心管中的青春期前卵巢组织轻柔转移至孔中。对于青春期卵巢组织，应使用剪去尖端的1000 µL移液器吸头进行转移。
      注意：较宽的吸头开口可防止组织在转移过程中受损。
    2. 待所有样本均转移至孔中后，使用新的吸头吸除PBS，并更换为每孔0.8 mL新鲜PBS。将样本置于摇床上，室温下以约100–150 rpm振荡孵育过夜。同时开始配制通透化缓冲液（见表1和第1节）。
      ​注意：使用新吸头可防止卵巢组织黏附于吸头；PBS孵育步骤有助于卵巢组织在PBS中达到平衡，并在染色前充分再水化。
  3. 第2天
    1. 完成通透化缓冲液的配制。吸除各孔中的PBS，每孔加入0.8 mL通透化缓冲液。将板放回摇床，室温下孵育4小时。
    2. 孵育4小时后，彻底吸除通透化缓冲液，每孔加入0.5 mL封闭缓冲液（见表1和第1节）。用封口膜密封板以防止蒸发，将板放入带盖的容器中置于摇床上，于室温下轻柔振荡孵育过夜（16–24小时）。
  4. 第3天
    1. 用封闭缓冲液稀释一抗。为显示卵母细胞，可使用卵母细胞标志物，例如：大鼠抗生殖细胞核酸性肽酶（GCNA）/TRA98抗体用于产前和青春期前卵巢，兔抗DEAD-box解旋酶4（DDX4）/小鼠Vasa同源物（MVH）抗体用于青春期前和青春期卵巢。为定量分析产前卵巢中LINE-1 ORF1p的表达，可使用兔抗LINE-1 ORF1p抗体或其他可用抗体。
      注意：GCNA/TRA98信号在青春期卵巢中不可检测。
    2. 吸除样本中的封闭缓冲液，每孔加入0.5 mL稀释后的一抗。用封口膜密封板以防止蒸发。将板放入带盖容器中，防止孵育过程中样本干燥。将容器置于摇床上，室温下孵育3–4天。
  5. 第7天
    1. 轻轻揭去板上的封口膜，吸除一抗混合液。将一抗混合液储存于4 °C（最多可保存一个月或重复使用三次），后续可补充新鲜抗体后再次使用（例如，每5 mL已使用过的混合液中加入2 µL新鲜抗体分装液）。
    2. 每孔加入1 mL洗涤缓冲液（见表1和第1节），轻轻振荡数秒以冲洗残留抗体。小心吸除后，更换为每孔0.8 mL新鲜洗涤缓冲液，并于室温下振荡过夜。
  6. 第8天
    1. 吸除过夜洗涤缓冲液，更换为每孔0.8 mL新鲜洗涤缓冲液，室温下振荡2小时。再用新鲜洗涤缓冲液重复洗涤一次，持续2小时。
    2. 最后一次洗涤后，将洗涤缓冲液更换为0.5 mL用封闭缓冲液稀释的二抗混合液，例如：山羊抗大鼠Alexa Fluor 555和山羊抗兔Alexa Fluor 647，稀释比例为1:1,000。每次免疫染色实验均需新鲜配制二抗混合液。
    3. 用封口膜密封板以防止孵育过程中蒸发。将样本在避光条件下或用铝箔包裹的板中，室温下轻柔振荡孵育3天。
      注意：此步骤及后续所有步骤均需在避光或铝箔包裹条件下进行。
  7. 第11天
    1. 吸除二抗混合液，用1 mL洗涤缓冲液进行初步洗涤。轻轻振荡数秒以去除残留的二抗。
    2. 吸除洗涤缓冲液，更换为每孔0.8 mL新鲜洗涤缓冲液，在避光条件下室温振荡孵育2小时。重复该洗涤步骤两次，共完成三次洗涤。第三次洗涤结束后，进入透明化步骤（第6节）。

6. 免疫染色整体卵巢的透明化处理（图2A）。

注意：所有透明化步骤均需在避光条件下进行，可将培养板用铝箔纸包裹或置于不透明容器中。青春期前和青春期卵巢的透明化步骤有所不同。

  1. 第11天 [产前及青春期前卵巢采用一步法透明化处理]
    1. 最后一次洗涤后，吸除洗涤缓冲液，加入0.8 mL新配制的ScaleS4(0)溶液（见表1和第1节）。用封口膜密封培养板，在室温下避光振荡孵育3至4天，随后进行成像。
    2. 如需要，可每日更换新鲜的ScaleS4(0)溶液；更换溶液时需格外小心，因透明化后的卵巢会变得透明，难以观察。完成透明化后，进入样本准备与成像步骤（第7节）。
      注意：更换溶液并未显著改善图像质量。每日换液会增加丢失微小且高度透明样本的风险。
  2. 第11至15天 [青春期卵巢采用两步法透明化处理]
    1. 完成最后一次免疫染色洗涤后，吸除洗涤缓冲液，加入0.8 mL ScaleCUBIC-1溶液（见表1和第1节）。用封口膜密封培养板，在37 °C条件下避光轻柔振荡孵育3天。每日更换新鲜的ScaleCUBIC-1溶液。
    2. 第15天，在0.8 mL PBS中于室温轻柔振荡洗涤样本3次，每次10分钟。吸除PBS，加入0.8 mL新配制的脱气PBS 20%蔗糖溶液。室温下轻柔振荡1小时。
    3. 将20%蔗糖溶液替换为0.8 mL ScaleCUBIC-2溶液（见表1和第1节），用封口膜密封培养板，并在室温下每日更换新鲜ScaleCUBIC-2溶液，轻柔振荡。继续透明化处理4至5天后进行成像。更换溶液时需格外小心，避免样本丢失，因透明化后的卵巢呈透明状，难以观察。随后进入样本准备与成像步骤（第7节）。

7. 使用多光子显微镜进行样本设置与成像

注意：以下所有步骤均使用配备两台可调谐锁模钛宝石多光子激光器（脉冲持续时间为 120 fs）的 Leica DIVE/4TUNE/FALCON 系统完成，物镜为多介质 16 倍/数值孔径 0.6（浸没液为甘油），最大工作距离为 2.2 mm。图像采集软件的详细信息见材料表。补充表 S1 和补充图 S1 列出了本实验方案所用的设置参数。对于其他成像平台，请咨询显微成像中心或参照仪器制造商的规格说明与建议。

  1. 样本设置
    1. 准备样品安装装置。例如，使用具有粘性和柔性的硅胶垫圈制作一个粘附式小室。将该粘附式小室置于一块 25 mm × 25 mm 的 1.5 号显微盖玻片上，形成用于放置卵巢组织的小室。图2B).
      注意：1 mm 厚度的垫圈可适配所有尺寸的卵巢。推荐使用此装置，因为它可消除成像过程中卵巢的移动，而将卵巢置于玻璃底培养皿的封片剂中时可能会发生移动。
    2. 使用剪去尖端的移液枪头（产前和青春期前样本使用 20 µL），将卵巢连同约 5–10 µL 的 ScaleS4(0) 溶液转移至粘附孔的中央，如图所示。 图2B对于青春期卵巢，使用200 µL移液枪头，将枪头末端剪去足够长度以转移卵巢。向黏附孔中央加入约15–20 µL的ScaleCUBIC-2溶液。
      注意：溶液过多可能导致溢出至显微镜载物台，过少则会导致图像质量下降。由于透明化后的卵巢变得透明而难以观察，应使用解剖显微镜转移样品。
    3. 将卵巢转移至含有少量透明溶液的独立孔中后，轻轻将另一片盖玻片置于黏性孔上，按压以形成密封，使样本固定在两片盖玻片之间少量透明溶液形成的液池中（图2B）。成像时，将盖玻片放置 "三明治" 在3D打印的显微镜适配器载玻片中（例如，43 ).
      注意：在拆解后，粘附性小室可重复使用 "三明治" 并用水洗涤。
  2. 成像（补充表 S1 和 补充图 S1)
    1. 根据显微成像平台或制造商的指南开启显微镜及配套软件。将制备好的样品置于显微镜载物台上，通过目镜观察，使用低倍LED荧光灯照明定位样品。
    2. 找到样本后，打开激光器，并为每个检测器分配特定的Alexa Fluor染料/标记。若使用多个激光器，应依次进行图像采集。在切换激光器之前，先完成整组图像的采集。
      注意：本实验方案中，使用同一台激光器采集555 nm和647 nm两种荧光染料的图像。
    3. 根据显微成像核心设施或制造商的规范设置图像采集参数。如果条件允许，采用双向图像采集以缩短扫描时间并提高效率。调整其他设置，包括 线平均 (1), 帧平均 （1），以及 帧累积 (1).
      ​注意：双向图像采集允许激光在X轴移动时沿两个方向进行扫描。
    4. 通过确定起始位置（样品底部/底部玻璃盖片）和终止位置（样品顶部/顶部玻璃盖片）来设置Z轴层扫。选择一个 Z轴步长 2 µm（青春期前卵巢）和5 µm（青春期卵巢）。
    5. 激活Z补偿功能，并在该功能中激活 激发增益. 通过选择样品底部和顶部的Z补偿来设置Z补偿 激光强度 底部（低强度）和顶部堆栈（高强度）均需如此处理。参见 补充图 S1线性Z补偿，选择激发增益框，并将底部（0）和顶部（347.75）的激光强度分别设置为10和12。
    6. 使用 拼接模式 对于无法在单个视野中捕获的较大样本。激活 图像导航器 并指出 切片数量 需要使用以下方法来完整捕获整个样本 矩形标记工具.
    7. 开始图像采集。对于包含多个图块的图像，以多个图块为单位开始图像采集 导航器 以捕获所有图像区域。图像采集完成后，首先 保存 所有图像，如果采集了多个图块，则运行 镶嵌融合工具 将图块合并为单幅图像。
    8. 将合并后的文件保存到一个独立的项目文件夹中，以便更方便地处理吉字节大小的图像。随后将文件传输至三维图像可视化与分析软件中进行图像处理。 图3 显示使用两种标记物（GCNA 和 DDX4）在不同阶段拍摄的代表性图像。

8. 图像处理

注意：以下所述所有步骤均使用 IMARIS 3D 图像可视化与分析软件开发并执行。

  1. 将图像导入3D图像可视化与分析软件中，并根据需要将文件从原始格式（例如 .lif、.czi、.lsm、.lei、.oib、.oif、.nd2）转换为 .ims 格式。
  2. 如有需要，使用高斯滤波器对图像进行处理以减少像素化现象（图4A）。利用3D视图功能调整图像位置，并取消选中边框选项（以去除边框）。
    注意：还有其他可选滤波器可用于降低像素化程度并减弱背景强度。
  3. 将图像按特定比例放大，并使用快照功能。设置参数如下：选择300 DPI，保存为TIFF图像，以及透明背景。对图像进行截图并保存。图3展示了完整组装后的图像。

9. 卵母细胞定量

注意：可使用斑点特征对整个卵巢进行免疫荧光染色，并结合三维图像可视化与分析，以估算整个卵巢中的卵母细胞数量（图3 和 图4）。在产前及青春期前卵巢中，可利用GCNA信号对卵母细胞进行定量分析，如 图4（P5）所示。在青春期卵巢中，应使用DDX4信号对非生长卵泡中呈"环状"结构（闭合箭头）和生长卵泡中较大结构（开放箭头，图4，P28）的两类卵母细胞群体进行定量分析。

  1. 确定将用于第9.2步中通过Spots功能定量卵母细胞的卵母细胞大小参数。
    1. 打开图像，选择Slice选项以打开Z轴层叠图像。
    2. 在Measure面板中选择Line选项，通过在卵母细胞/标记物最宽处从一侧边缘到另一侧边缘画线，测量其距离，以确定待计数卵母细胞类型/大小的XY直径。在Z轴层叠图像中切换不同层面，获取同类型多个卵母细胞的直径范围，并以最短长度作为卵母细胞计数的尺寸筛选标准。
  2. Spots功能：选择3D View选项，并在Scene面板中激活Add new Spots功能，以打开Algorithm面板。取消选中所有算法设置，因为将使用第9.1步获得的卵母细胞大小作为尺寸筛选条件。
    1. 点击single forward arrow进入Source Channel。选择所需标记对应的Channel，并输入第9.1步中获得的Estimated XY Diameter。例如，对于产前卵母细胞使用7 µm的估计XY直径，对于P5卵母细胞使用11 µm（GCNA = 绿色信号；图3和图4A）。
    2. 对于P5卵巢中生长卵泡内卵母细胞数量的估算，使用30 µm作为DDX4信号的参数（DDX4 = 洋红色信号；图3和图4A）。对于青春期卵巢，使用DDX4信号进行卵母细胞定量。例如，使用15 µm和80 µm的XY直径分别识别非生长卵泡和生长卵泡中的卵母细胞，如图4A所示。
      注：所选尺寸可能因图像采集标准和所用显微镜类型而异。不同遗传品系之间也可能存在差异，卵母细胞数量较多的卵巢需要更小的尺寸选择，以实现更准确的自动检测。
    3. 完成尺寸选择后，启用自动确定的Model PSF-elongation和Background subtraction功能。点击single forward arrow进入Filter Spots面板。添加Quality筛选条件并设定阈值。为确保卵母细胞数量的准确估算，在调整阈值时放大图像，选择一个能够覆盖大多数卵母细胞的阈值。点击double arrow完成自动计数。
    4. 使用Edit标签页手动检查已选中的卵母细胞，选择遗漏的卵母细胞或取消选中被自动阈值错误识别的非卵母细胞颗粒。在Overall标签页下的Statistics标签页中记录数据，用于后续分析。
      注：用于计数斑点的参数可保存并用于其他样本集，但在执行批量分析前建议进行手动核查。
    5. 如需保存参数，点击Creation标签页，然后点击Store Parameters for Batch。
      ​注：核标记物（GCNA+卵母细胞，图4A）可通过斑点功能轻松识别，通常无需大量手动调整。然而，细胞质标记物（DDX4+卵母细胞，图3（P28，闭合箭头）和图4A）需要更多手动调整，以确保正确识别卵母细胞的尺寸/类型。

10. 定量分析卵巢中的蛋白质表达

注意：可以使用Spots功能（第9节和步骤10.1）和Surfaces功能（步骤10.2）来定量卵母细胞中特定标志物的表达。对于具有明确定位模式的蛋白质（如核标志物GCNA），可使用Spots功能；而对于具有非均匀定位模式的蛋白质，则可使用Surfaces功能，如图5A所示，该图展示了在E15.5和E18.5卵巢中测量LINE-1 ORF1p信号强度的示例。为了计算并比较两个样本之间目标蛋白的信号强度（例如不同时间点、处理条件或基因型），应以相同的成像参数采集图像。建议先使用信号较强的样本确定分析参数，然后将这些参数保存并应用于其他样本。

  1. 要使用Spots功能获取蛋白表达结果，首先识别出已被高亮显示的卵母细胞（第9节）。
    1. 然后在Spots功能下，选择Statistics选项卡，接着选择Detailed选项卡。点击下拉箭头，选择Specific Values，这将在其下方打开另一个包含不同测量参数的选项卡。选择用于表面生成的通道的Intensity Mean（或选择其他强度测量参数，例如Intensity Median）。
    2. 为获得合并/平均的统计信息，请选择Average Values标准。完成后，导出并保存数据以供进一步分析。
  2. 要使用Surfaces功能获取蛋白表达结果，打开图像，选择3D View选项，并在Scene面板中激活Add new Surfaces功能，以打开Algorithm面板。如无需使用所有算法设置，则取消选中，并点击单个向前箭头进入Source Channel。
    1. 选择含有抗体信号的Channel用于测量。其他可选属性为用户自定义选项。此处使用LINE-1信号作为标记。将Surfaces Detail和Background Subtraction (Local Contrast)值分别保持默认值1.42和5.33。
    2. 点击向前箭头进入Threshold面板。选择在两个样本中具有可比性的阈值（例如，此处使用E18.5样本中的LINE-1表达水平来确定阈值）。选择Enable，并使用默认的Seed Points Diameter值7.10（该值对本实验图像效果最佳，但可能取决于预期特征的像素尺寸）。
    3. 点击向前箭头进入Filter Surfaces面板。使用Quality滤波器，并根据两个卵巢样本中蛋白表达情况设定滤波值，该值应与Threshold值类似。选定滤波属性后，点击双向前箭头以完成表面的生成。
    4. 为获取强度值，选择Statistics选项卡，接着选择Detailed选项卡。点击下拉箭头，选择Specific Values，这将在其下方打开另一个包含不同测量参数的选项卡。
    5. 选择用于表面生成的通道的Intensity Mean（或选择其他强度测量参数，例如Intensity median）。
    6. 为获得合并/平均的统计信息，请选择Average Values标准。完成后，导出并保存数据以供进一步分析（图5C）。

11. 通过计算校正法估算受损卵巢中的总卵母细胞数量

注意：若在解剖过程中发生轻微的卵巢损伤，可能可通过计算方法估算总卵母细胞数量。建议使用相同品系和发育阶段的完整卵巢进行卵母细胞数量估算，如图6所示。在E15.5阶段卵巢上进行的模拟表明，当损失量≥30%时，校正后的结果将显著偏离实际数值（图6C）。

  1. 使用 IMARIS 打开完整卵巢的图像，并选择 Frame 功能。在帧设置中，勾选 Box、Grid、Tickmarks 和 Axis 标签。在 Position X/Y/Z 选项卡下，选择 200 µm，以在所有 X/Y/Z 位置生成间距为 200 µm 的刻度标记。
    注意：刻度标记可在 X、Y 和 Z 平面中创建网格/标尺，用于识别特定区域内的卵母细胞。
  2. 激活 Spots 功能以识别卵母细胞，如第 9 节所示（图 4）。通过在 Spots 功能的 Points Style/Quality 选项卡下选择 Sphere，对用于模拟的所有完整卵巢中的卵母细胞建立 3D 模型。
    注意：也可在 Points Style/Quality 选项卡下更改 Pixel Width。
  3. 利用步骤 11.1 中生成的框，将完整卵巢的 3D 模型调整为与 图 6A 中所示相同的方向。
  4. 根据 200 µm 的刻度标记（步骤 11.1），选择位于每个卵巢体积 50% 范围内的卵母细胞。点击 Spots 功能并选择 Edit Labels，按颜色对位于 50% 区域内的卵母细胞进行分类，如 图 6A 所示。
    注意：一旦卵母细胞被分类至某一区域，系统将提供每个类别中卵母细胞的数量。
  5. 放大至 50% 区域，并将 tickmarks 从 200 µm 更改为 50 µm，以创建更小的标尺用于卵母细胞识别。保持所有图像中的放大比例一致。以 50 µm 的刻度标记为参考，将 50% 区域均分为五个部分。
    注意：每个部分内的卵母细胞将代表 10% 的体积，如 图 6A 所示，其中完整卵巢的上半部分卵母细胞以五种不同颜色标示，每种颜色代表一个 10% 体积区域内的卵母细胞。
  6. 记录每个 10% 区域内的卵母细胞数量，如 图 6A、B 所示。计算 10%、20%、30%、40% 和 50% 体积增量下的卵母细胞平均数量。
  7. 使用步骤 11.1 至 11.6 中所述方法获取受损部分卵巢中的卵母细胞数量。将受损卵巢置于与完整卵巢相同的方向，并如上所述估算缺失体积/百分比。
  8. 为估算整个卵巢中的总卵母细胞数量，将与部分卵巢体积相当的完整卵巢中计算出的卵母细胞平均数量，与部分卵巢中实际获得的卵母细胞数量相加（图 6B）。

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结果

通过对整个卵巢进行免疫染色和成像，可以使用相同的技术和标记物对不同发育阶段的卵母细胞或卵巢中的蛋白表达进行可视化和定量分析（图3）。本方案最初为一项大规模研究项目开发，该项目需要对多个发育阶段及多种小鼠品系的卵巢进行分析。本文展示了针对C57BL6/J品系获得的数据，该品系是遗传学分析的常用品系。本方法操作简便，可在14–19天内获得结果（图2D），并适用于产前、青春期前以及青春期雌性个体的卵巢分析（图1 和 图2A、B）。

该方法用于研究在卵巢卵母细胞储备形成过程中自然发生的卵母细胞丢失动态。在包括小鼠在内的多种生物中，卵母细胞数量被认为在胎儿期达到峰值，大约在卵母细胞进入减数分裂的时期（~E13.5）。随后，由于胎儿期卵母细胞损耗（FOA）这一尚未完全阐明的过程（从~E15.5到E18.5），卵母细胞数量逐渐...

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讨论

本文介绍了一种针对产前和产后卵巢组织的详细三维免疫染色与成像方案，适用于高通量及比较性研究，可用于生殖细胞定量分析和蛋白质定位。我们开发该方案旨在分析10至16个不同品系小鼠在6个发育时间点（每组N=6-12）卵巢中的卵母细胞数量，通常每次处理2至4块24孔板。该方法可适用于其他器官或细胞标记物的研究。例如，通过选用适当的抗体，本方案可用于标记和可视化卵巢中的体细胞（如颗粒细胞），从而促进对体细胞-生殖细胞相互作用或其他卵巢细胞类型发育的研究。

该方案及抗体组合的一个局限性在于无法明确鉴定不同的卵泡发育阶段。在免疫荧光和二维成像中，通常利用DNA染料通过颗粒细胞核的层数来识别卵泡阶段，但这种方法在三维成像中效果不足。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst染料由于光穿透能力有限且在大块组织内部信号衰减，很少用于全器官染色。碘化丙啶（PI）是一种小分子染料，能够深入组织内部，但由于其光谱与其他荧光信号重叠，在多光子成像系统中难以捕获。通过添加针对颗粒细胞的特异性标记物（如抗苗勒管激素（AMH）或FOXL247...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01 HD093778 资助 E.B-F，T32 HD007065 资助 R.B）的支持。我们感谢 Zachary Boucher 在辐射实验中的协助。我们感谢 Mary Ann Handel 对稿件的审阅。我们衷心感谢 Sonia Erattupuzha 以及杰克逊实验室显微成像核心服务中心在本出版物所述显微成像工作中提供的专业协助，同时感谢杰克逊实验室科学仪器服务中心的 Jarek Trapszo 为设计3D打印适配器载玻片所做的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
台式培养箱Benchmark ScientificH2200-H37 °C 培养箱
牛血清白蛋白（BSA）VWR97061-416
C57BL/6J杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）000664近交系小鼠品系
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD1435危险物质
D-山梨醇Sigma-AldrichS6021
Dumont #5 镊子FST91150-20
FastWells 试剂屏障GraceBio664113具有粘性且柔韧的硅胶垫圈（粘附式微孔）
精细剪刀FST91460-11
甘油Sigma-AldrichG2025
甘氨酸ThermoFisher ScientificBP381-500
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647InvitrogenA-21246稀释比例 1:1000
山羊抗大鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434稀释比例 1:1000
山羊血清Sigma-AldrichG9023
IMARIS 软件Oxford Instruments版本 9.7.0图像可视化与分析软件
Insight X3Spectra-PhysicsInSight X3 可调超快激光器多光子成像用激光器
LASX 软件Leica版本 3.5.6图像采集软件
Leica DIVE/4TUNE/FALCONLeicaLeica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406多光子显微镜
MaiTai HPSpectra-PhysicsMai Tai DeepSee 一体式超快激光器多光子成像用激光器
Masterflex 泵控制器SPW Industrial型号：7553-50灌注用蠕动泵
梅奥剪刀FST14010-175” –7” 钝头/钝头剪刀，用于断头术
方形显微盖玻片，No. 1.5，25×25 mmVWR48366-249
Mini BioMixerBenchmark ScientificB3D1020适用于 37 °C 培养箱的摇床/振荡器
Nikon 人体工学立体显微镜 SMZ1270Leica SMZ1270体视显微镜
16% 多聚甲醛（甲醛水溶液）电子显微技术科学公司（Electron Microscopy Sciences）15710危险物质
PBS 片剂，磷酸盐缓冲液ThermoFisher ScientificBP2944100溶于 Milli-Q 水
青霉素-链霉素，200 倍浓度，双抗溶液ThermoFisher ScientificICN1670249
聚乙烯醇（PVA）Sigma-AldrichP8136
Quadrol（N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺）Sigma-Aldrich122262
兔抗 DDX4/MVH 抗体Abcamab27591稀释比例 1:500
兔抗 LINE-1 ORF1p 抗体Abcamab216324稀释比例 1:500
大鼠抗 TRA98/GCNA 抗体Abcamab82527稀释比例 1:500
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002危险物质
硼氢化钠Sigma-Aldrich452882危险物质
蔗糖ThermoFisher ScientificS0389
Tekmar 轨道摇床BimedisVXR-S10室温用摇床
三乙醇胺Sigma-Aldrich90279
吐温 X-100Sigma-AldrichX100
UNOLOK 灌注套装MYCO Medical7001-23灌注用针头
尿素Amresco97061-920
X-Cite 120LEDExcelitas序列号 XT640-W-0147低功率 LED 荧光灯

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