两种剥离方法，用于分离小鼠视网膜中的光感受器细胞区室以进行蛋白质分析

摘要

该协议提出了两种技术来分离小鼠杆光感受器的亚细胞区室以进行蛋白质分析。第一种方法利用活视网膜和纤维素滤纸来分离杆外段，而第二种方法采用冻干视网膜和胶带剥离杆内段和外段层。

摘要

视杆光感受器是具有不同区室的高度极化感觉神经元。小鼠杆长（~80μm）和薄（~2μm），横向堆积在视网膜的最外层，即光感受器层，导致类似的亚细胞区室对齐。传统上，冷冻的平板视网膜的切向切片已被用于研究不同杆室内蛋白质的运动和定位。然而，杆状小鼠视网膜的高曲率使得切向切片具有挑战性。在对区室间蛋白质转运研究的推动下，我们开发了两种剥离方法，可以可靠地分离出杆外段（ROS）和其他亚细胞区室用于蛋白质印迹。我们相对快速和简单的技术提供富集和亚细胞特异性级分，以定量测量正常视杆中重要光感受器蛋白的分布和再分布。此外，这些分离技术也可以很容易地用于分离和定量研究健康和退化视网膜中其他细胞层的蛋白质组成。

引言

棒状光感受器细胞紧密地聚集在神经视网膜的最外层，是昏暗光视觉的一个组成部分。为了充当忠实的光子计数器，杆利用基于G蛋白的信号通路（称为光转导）来产生对单光子捕获的快速，放大和可重复的响应。这种对光的响应最终会触发质膜电流的变化，并随后向视觉系统的其余部分发出信号¹。顾名思义，每个杆细胞都具有独特的杆状形状，并表现出高度极化的细胞形态，由外段（OS），内段（IS），细胞体（CB）和突触末端（ST）组成。每个亚细胞区室具有特定的蛋白质机制（膜结合和可溶性）、生物分子特征和蛋白质复合物，这些蛋白质复合物起着至关重要的作用，如视觉光转导、一般内务管理和蛋白质合成以及突触传递^2，3。

30多年前，^{首次观察到亚}细胞蛋白的光依赖性相互运动，特别是转导素（远离OS）和停滞素（朝向OS），4^，5，6，7。早期，这种观察到的现象受到怀疑，部分原因是免疫组织化学对表位掩蔽的脆弱性⁸。在2000年代初，通过使用严格而艰苦的物理切片技术证实了刺激依赖性蛋白质易位⁹。对冷冻的平装啮齿动物视网膜进行连续切向切片，然后进行免疫印迹，结果显示，转导素^9，10，^{arrestin11，12}和^recoverin13都响应于光的亚细胞再分布。据信，这些关键信号蛋白的光驱动易位不仅调节光转导级联^{的灵敏度9，14，15}，而且还可能对光损伤具有神经保护作用^16，17，18。由于视杆细胞中的光驱动蛋白转运似乎对视杆细胞生物学和生理学非常重要，因此允许分离不同亚细胞区室以确定蛋白质分布的技术是有价值的研究工具。

目前，有几种旨在分离杆亚细胞区室的方法。然而，这些方法可能很长且难以复制，或者需要相当数量的视网膜分离物。例如，通过密度梯度离心¹⁹制备棒外段（ROS）通常用于将ROS与视网膜匀浆分离。这种方法广泛用于蛋白质印迹，但该过程非常耗时，并且至少需要8-12个小鼠视网膜²⁰。另一方面，冷冻小鼠和大鼠视网膜的连续切向切片已成功用于分离OS，IS，CB和^{ST9，11，13}。然而，这种方法在技术上具有挑战性，因为在切向切片之前，必须完全压平小而高度弯曲的小鼠视网膜以对齐视网膜层。由于有大量的小鼠模型和转基因小鼠概括视觉系统的疾病，因此创建一种可靠，快速且容易地分离单个杆室的技术有望揭示每个专用隔室中发生的生理过程以及健康和疾病中视觉过程背后的机制。

为了促进这些研究，我们描述了两种剥离方法，它们比目前的方案更容易分离杆亚细胞区室。第一种剥离方法改编自一种暴露荧光标记的双极细胞以进行膜片钳记录^的技术21，它采用纤维素滤纸从活的，分离的小鼠视网膜中依次去除ROS（图1）。第二种方法改编自从^{chick22和frog23}视网膜中分离出三个主要视网膜细胞层的程序，利用胶带从冻干视网膜中去除ROS和杆内段（RIS）（图2）。这两个程序都可以在1小时内完成，并且非常人性化。我们通过利用来自C57BL / 6J小鼠的黑暗适应和光暴露的视网膜来证明光诱导的杆转导素（GNAT1）和逮捕素（ARR1）的易位，从而验证了这两种分离方案对蛋白质印迹的有效性。此外，使用胶带剥离方法，我们提供了额外的证据，证明我们的技术可用于检查和解决通过免疫细胞化学（ICC）和蛋白质印迹获得的蛋白质定位数据之间的不一致。具体而言，我们的技术表明:1）蛋白激酶C-α（PKCα）亚型不仅存在于双极细胞中，还存在于小鼠ROS和RIS中，尽管浓度低^24，25和2）视紫红质激酶（GRK1）主要存在于分离的OS样品中。这些数据证明了我们的两种剥离技术在分离和定量特定视网膜蛋白和视网膜蛋白方面的有效性。

方案

所有实验均根据南加州大学（USC）研究动物护理委员会的当地机构指南进行。

1. 活细胞视网膜剥离法

1. 准备艾姆斯的缓冲液、去皮纸和解剖皿
   1. 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将纤维素滤纸（413级）切割成长方形，尺寸约为5 mm x 2.5 mm。储存插条以备将来使用。
   2. 通过混合一瓶Ames'培养基，2.38克HEPES和0.877克NaCl来制备1升Ames的HEPES缓冲液。用蒸馏超纯水将试剂溶解在无菌玻璃瓶中，并将渗透压和pH分别调节至280 mOsm和7.4。过滤灭菌（孔径0.2μm），用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
   3. 将一瓶艾姆斯培养基和 1.9 克 NaHCO3 混合，制备 1 升 Ames 碳酸氢盐缓冲_液。用蒸馏超纯水将试剂溶解在无菌玻璃瓶中，并将渗透压和pH分别调节至280 mOsm和7.4。过滤灭菌（孔径0.2μm），用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
      注意:Ames的HEPES和Ames的碳酸氢盐缓冲液可以提前制备并在4°C下储存1周。
   4. 在 35 x 10 mm 培养皿的底部，使用手术刀（刀片编号 11，40 mm）创建格子或棋盘图案。
      注意:在视网膜解剖期间，培养皿的纹理底部将孤立的，自由漂浮的眼睛固定在适当的位置。
2. 视网膜解剖
   注意:对于此过程，应将缓冲液带到室温（RT）并保持在室温（RT）下。在解剖过程中，每15分钟用新鲜的碳化Ames碳酸氢盐缓冲液刷新Ames的碳酸氢盐缓冲液。这维持了必要的生理pH值。
   1. 在解剖前约15-20分钟，在装有管帽适配器的100 mL实验室或培养基瓶中对Ames的HEPES缓冲液进行氧氧化_{，并在组织}培养箱和装有管帽适配器的100 mL实验室或培养基瓶中，用95%O ₂和5%CO 2对Ames的碳酸氢盐缓冲液进行泡泡。
   2. 通过异氟醚吸入或二氧化碳（CO2）对相同数量的C57BL / 6J小鼠（_2-3个月大）的两种性别实施安乐死，然后进行宫颈脱位。用弯曲的剪刀修饰眼睛，并将眼睛放入充满气泡Ames碳酸氢盐缓冲液的纹理35 x 10毫米培养皿中。
   3. 通过用18 G针刺穿角膜边缘连接处的孔来创建眼罩（图1A）。使用显微解剖虹膜剪刀沿着该交界处的周边切割，以去除每只眼睛的角膜。使用镊子将晶状体和玻璃体房从每只眼睛中分离出来并丢弃。
   4. 通过小心地将视网膜色素上皮（RPE）-巩膜-脉络膜复合物从神经视网膜上剥离出来，将视网膜从眼罩中分离出来。丢弃 RPE-巩膜-脉络膜复合物。通过仅处理边缘，确保视网膜在解剖过程中没有受损。
   5. 使用宽孔转移移液器将孤立的视网膜转移到充满气泡Ames碳酸氢盐缓冲液的60 x 15 mm培养皿的盖子中。
   6. 将半球形视网膜向上凹面（感光器朝下朝向培养皿的底部），并使用虹膜剪刀或手术刀（刀片10号，40毫米）将每个视网膜（通过视神经）一分为二。修剪每个半视网膜的弯曲边缘以形成两个矩形（图1A）。
      注意:最小化每个减半视网膜的曲率可以使视网膜在随后的剥离步骤中更好地变平，并产生杆外段（ROS）层的精确剥离。
   7. 将减半的视网膜储存在组织孵育室中，该室连续用95%的O ₂ 和5%的CO ₂冒泡。
      注意:分离的视网膜可以在碳化Ames的碳酸氢盐缓冲液中保存约24小时。
3. 通过滤纸剥离收集棒外段（ROS）
   注意:在剥离过程中，每15-20分钟刷新一次RT含氧Ames的HEPES缓冲液，以保持必要的生理pH值。
   1. 使用宽孔转移移液器和5 mm x 2.5 mm滤纸将一个视网膜矩形从组织室转移到装有100%_O2气泡的Ames'HEPES缓冲液的35 x 10 mm培养皿中。
   2. 将分区的视网膜向上凹陷，并确保光感受器朝下朝向培养皿的底部。用镊子轻轻抓住切成两半的视网膜的侧面，然后将其移动到滤纸的顶部。一旦视网膜在滤纸上居中，向上移动滤纸，使对半的视网膜接触到滤纸，从而产生ROS到滤纸的粘附（图1B）。
      注:确保光感受器层与滤纸直接接触。
   3. 小心地将带有视网膜的滤纸从Ames的HEPES缓冲液中取出。将滤纸的底部（没有视网膜的一面）放在纸巾上，轻拍2-3次以干燥（图1B）。
   4. 将一滴Ames的HEPES添加到带有视网膜的滤纸的侧面。再次将滤纸放在纸巾上晾干，如前所述。再重复此过程两次。
   5. 将带有视网膜的滤纸放回培养皿中。使用镊子，轻轻地将半视网膜的所有边缘向上推，从所有侧面移开滤纸。
   6. 小心地将视网膜从滤纸上剥离出来。在剥离过程中仅触摸视网膜的极端周边，以保持视网膜的结构完整性。
   7. 从培养皿中取出滤纸，取出纸巾上多余的液体。确保与视网膜接触的一侧不接触纸巾。
   8. 将带有部分ROS层的滤纸放入冰上的标记管中（图1B）。将去皮的视网膜浸没在 Ames 的 HEPES 缓冲液中。
   9. 对这个减半的视网膜重复剥离过程约7-8次，以去除整个ROS层。每次剥离后，将滤纸放入同一管中，该管将包含来自一个半视网膜的分离ROS。
      注意:当将视网膜从滤纸上剥离时，请注意不要撕裂一半的视网膜，因为在此过程中视网膜会变薄。
   10. 将装有所有分离的ROS滤纸剥离的管子放在冰上立即使用，或直接在干冰上冷冻并储存在-80°C。
   11. 使用镊子将剩余的剥离的视网膜（缺乏ROS）转移到适当标记的管中。将管子放在冰上立即使用或用干冰冷冻并储存在-80°C。
   12. 对每个切成两半的视网膜重复剥离过程，并准确标记每个管子。

2. 冻干视网膜剥离法

1. 缓冲液、去皮培养基、解剖皿制备和冻干仪设置
   1. 在1L储存瓶中，通过加入500mL蒸馏超纯水来制备Ringer溶液。溶解试剂以达到130 mM NaCl，3.6 mM KCl，2.4 mM _MgCl2，1.2 mM _CaCl2，10 mM HEPES和0.02 mM EDTA的终浓度。用NaOH将pH值调节至7.4，加入超纯水使最终体积达到1 L，并将渗透压调节至313 mOsm。
   2. 使用前，用无菌过滤器（孔径0.2μm）过滤林格溶液，用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
   3. 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将纤维素滤纸切割成长方形，尺寸约为5 mm x 2.5 mm。用铅笔在滤纸的一面上书写，以创建唯一的标签。
   4. 使用手术刀（刀片编号11，40 mm）在35 x 10 mm培养皿的底部创建格子或棋盘图案。
   5. 根据制造商的规格打开冻干机。
   6. 在杜瓦瓶或类似的绝缘真空瓶中获取液氮。
2. 视网膜夹层
   1. 按照方案第1节所述完成视网膜解剖（图1A）。使用冷林格溶液代替艾姆斯的缓冲液。
   2. 解剖后，将对半的矩形视网膜存放在装满冷林格溶液的35 x 10毫米培养皿中，然后放在冰上。
3. 用于冻干的视网膜样品制备
   1. 放入5 x 2.5 mm滤纸，并将减半的视网膜转移到装有冷Ringer缓冲液的纹理化35 x 10 mm培养皿中。使用宽孔转移移液器在培养皿之间移动每个视网膜。
   2. 使用镊子小心地翻转视网膜，使其朝上凹陷（感光器指向上方），然后将其移动到滤纸的顶部（图2A）。
      注意:确保光感受器不接触滤纸（视网膜神经节细胞层应与滤纸直接接触），并且唯一标签可见。为了轻松快速地识别视网膜分离物，建议将唯一标签放置在滤纸的下侧。
   3. 向上抬起滤纸的边缘，使切成两半的视网膜接触到滤纸，并继续将滤纸从Ringer溶液中提起。
   4. 将滤纸的底部（上面没有视网膜的一面）放在纸巾上，小心地轻拍2-3次以除去多余的液体（图2A）。
   5. 用镊子拿起滤纸，在带有视网膜的滤纸侧面加入一滴冷铃声。再次将滤纸放在纸巾上以除去多余的液体。再重复该过程两次。
      注意:这些交替的润湿和干燥步骤可确保组织牢固地附着在滤纸上。
   6. 将每个粘附的视网膜/滤纸样品存放在装满冷铃声的培养皿中，直到准备好冷冻所有样品。对所有减半的视网膜重复此过程。
   7. 获得一个干净干燥的35 x 10毫米培养皿（仅限底部）和一块铝箔切成3.5 x 3.5英寸见方。
   8. 用镊子将每个样品从冷的Ringer缓冲液中取出。确保镊子仅接触滤纸边缘，避免视网膜减半。
   9. 将每张滤纸的底部（上面没有视网膜的一面）放在纸巾上，然后取出多余的液体。
   10. 将一滴冷的1x PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM _Na2HPO4，2 mM _KH2PO4，pH 7.4）滴到滤纸的侧面，粘附视网膜。将滤纸轻拍在纸巾上以除去多余的液体。
       注意:确保在冷冻前充分去除滤纸中的水分。
   11. 将所有滤纸放入 35 x 10 mm 培养皿中。使用不含绒毛的薄纸吸走滤纸周围的任何多余液体。
       注意:不要用样品过度填充培养皿。如果使用四个以上的鼠眼，请考虑使用较大的培养皿或多个较小的培养皿来容纳视网膜/滤纸样品。
   12. 用铝箔紧紧包裹整个盘子。确保铝箔的边缘固定并顺利地压入培养皿的底部。在铝箔盖上刺穿一些0.1-0.2毫米的孔（图2A）。
   13. 使用金属钳，逐渐将铝箔覆盖的培养皿放入液氮中。将样品保存在液氮中（<10分钟），直到准备好冻干。
4. 冻干
   1. 将铝箔覆盖的培养皿放入冷冻干燥烧瓶中，并按照制造商的协议将其连接到冻干机上。冻干视网膜30分钟。
   2. 根据制造商的说法，将烧瓶从冻干机上拆下并关闭机器。
   3. 取出铝箔，并在同一天处理冻干样品，或将其储存在正确标记的1 mL微量离心管中。将这些管置于装有无水干燥剂的容器（例如50 mL锥形管）中，并将样品储存在-80°C。
5. 棒材外段和内段通过胶带剥离收集。
   1. 切割透明胶带条（1-2厘米），并将胶带条存放在胶带分配器/实验室工作台/等的边缘，以便快速使用。
   2. 将一个视网膜样品移至塑料60 x 15 mm培养皿的盖子上进行剥离。确保只抓住滤纸的最外边缘，避免接触视网膜。
   3. 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将一小块矩形胶带切成组织的近似大小（1.5 x 2.5 mm）。
   4. 小心地在冻干视网膜顶部铺上一小块胶带（图2B），并用镊子施加轻微的压力，以确保它与光感受器层（橙色/粉红色的顶层）粘合。
   5. 慢慢剥离胶带。杆外段（ROS）和杆内段（RIS）都将粘附在胶带上（图2B）。
   6. 确保断裂表面有一层薄薄的白色薄膜。这是 RIS.To 分离RIS，放置另一块磁带并将磁带向下推到断裂的表面上（图2B）。
      注:可能需要多块胶带才能去除整个薄薄的白色层。
   7. 将仅带有橙色/粉红色层的胶带放入标有+ROS的微量离心管中。
   8. 将带有薄白色层的胶带或胶带片放入标有+RIS的微量离心管中。
      注意:用胶带分离冻干的视网膜需要练习。施加在胶带上的压力量将影响冻干样品的分馏方式。如果在样品上的胶带上施加太大的压力，整个冻干的视网膜将从滤纸上剥落并粘在胶带上。如果向胶带上添加的压力太小，橙色/粉红色顶层（+ROS）将不会粘在胶带上。
   9. 通过使用胶带从滤纸上剥离厚厚的白色层，收集位于滤纸上的剩余视网膜组织（没有ROS和RIS层，-OIS）。将隔离物放入标有-OIS的管中。
   10. 对每个减半的视网膜样本重复这些步骤。
   11. 如果在同一天进行蛋白质定量，凝胶电泳和蛋白质免疫印迹，则将冻干视网膜中的分离层储存在室温下，或储存在充满无水干燥剂的容器（例如50mL锥形管）中，以备后用。

3. 用于剥离分离的蛋白质印迹样品制备

1. 制备 RIPA 裂解缓冲液
   1. 在100 mL储存瓶中，加入试剂以获得50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS和1mM EDTA的最终浓度。加入 100 mL 去离子超纯水，充分混合。
      注意:RIPA裂解缓冲液可以在2-8°C下储存2-3周。对于更长时间的储存，等分并储存在-20°C冰箱中。
   2. 在实验当天，将蛋白酶抑制剂混合物（0.1 M PMSF，1:1000抑肽酶和1:1000 Leupeptin）加入RIPA裂解缓冲液中并保持在冰上。
2. 用于蛋白质印迹的滤纸剥离裂解液制备
   1. 确保将含有滤纸剥离和剩余剥离的视网膜的管子保持在冰上（用于当天的实验）或从-80°C冰箱中取出并放置在冰上。
   2. 从含有滤纸剥离的微量离心管底部除去任何多余的液体。在迷你离心机中快速旋转2-4秒，并丢弃任何剩余的液体。
   3. 将45-55μL冷RIPA缓冲液移入含有分离滤纸的管中。
   4. 用干净的高压灭菌杵混合器使每个样品均质1分钟。确保滤纸与杵式搅拌机保持接触。将滤纸放在每个管子的侧面，而不是底部。
   5. 用镊子将滤纸移到每个管子的侧面，然后在迷你离心机中旋转2-4秒。这将从滤纸中取出 RIPA 缓冲液。
   6. 如有必要，取出干燥的滤纸，并对每个管内的所有滤纸重复此操作。
   7. 将匀浆转移到新管中并适当标记。
      注意:这是最耗时的步骤，如果不能正确完成，大部分样品最终将被滤纸吸收。
   8. 将60-80μL冷RIPA缓冲液移入剩余的剥离视网膜的单个管中。
   9. 用干净的高压灭菌杵混合器使每个样品均质1分钟。
3. 用于蛋白质印迹的胶带剥离裂解液制备
   1. 将室温冻干样品或-80°C样品放在冰上。
   2. 将50-70μL冷RIPA缓冲液移入含有+ROS和+RIS胶带剥离的每个管中。
   3. 将60-80μL冷裂解缓冲液移入含有剩余冻干视网膜的-OIS管中，除去ROS和RIS。
   4. 用干净的杵混合器匀浆每个样品1分钟。确保各个管中的胶带与杵混合器和裂解缓冲液保持接触。
   5. 使用无菌镊子，将胶带移动到管的侧面，然后用迷你离心机旋转2-4秒。这将从胶带中除去液体。从试管中取出干燥的胶带。
      注意:此时，您可以将来自同一视网膜的两个半视网膜分离物组合在一起，进行"滤纸剥离"或"胶带剥离"方法，以确保您有足够的体积进行比辛可宁酸测定（BCA）。

结果

本策略的开发是为了提供相对快速和简单的方法来分离和分析特定杆亚细胞区室中的蛋白质，以进行蛋白质印迹分析。我们应用了两种顺序剥离技术（图1 和 图2），然后进行免疫印迹，以证明这些方法可以可靠地用于检测黑暗和光适应动物中杆转导素（GNAT1）和停滞素（ARR1）的已知分布。为了验证我们的两种方案在精确分离杆亚细胞区室而不污染其他细胞层方面的有效性，用细胞色素C（Cyt C），肌动蛋白和Gß5S / ^Gß5L26抗体探针免疫印迹。使用的抗体和稀释液列表如 表1所示。细胞C和肌动蛋白表明ROS纯度，因为它们是近端视网膜中的丰富蛋白质，但在ROS中不存在。Gß5L是^GNAT127的GTP酶激活蛋白（GAP）的一种成分，存在于ROS和RIS中，并作为这些分离的对照。Gß5S是较短的剪接同种型，在ROS或RIS中不存在，但存在于所有其他杆室中，用作非ROS / RIS分离的亚细胞区室的对照。

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讨论

许多视网膜疾病会影响视杆细胞，导致视杆细胞死亡，并最终导致完全视力丧失³⁷。多年来，人类视网膜变性的遗传和机制起源的很大一部分已经在许多小鼠模型中成功概括。在这种情况下，能够轻松和选择性地将单个杆亚细胞区室与小小鼠视网膜分开，这将大大增强我们对视网膜疾病的局部生化和分子基础的理解。此外，神经视网膜的分层性质，结合杆光感受器独特的高度极化排列，允许通过选择性剥离来隔离杆室。本手稿描述了两种方案，用于分离杆细胞的单个亚细胞室的杆光感受器细胞以进行免疫印迹。与现有的切向切片方法相比，这两种方法不仅速度更快，技术挑战性更小⁹，而且与使用密度梯度对ROS进行常见生化分离相比，它们需要的样本量也要小得多¹⁹。这种ROS梯度纯化技术需要8-10个小鼠视网膜才能可靠地恢复充足的ROS，而这里提出的方案适用于单个视网膜。

尽管所提出的技术总体上很简单，但两种方案共同面临的主要挑战之一是将弯曲的视网膜压平到正确分离不同亚细胞区室所需的滤纸上。孤立的视网膜倾向于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mL 实验室或培养基瓶，配备管盖适配器	N/A	N/A
100% O2 罐	N/A	N/A
1000mL 瓶顶过滤器，PES 过滤材料，0.22 μ;m	Genesee Scientific	25-235
4X SDS 样品缓冲液	Millipore Sigma	70607-3
50 mL Falcon 管	Fisher Scientific	14-432-22
95% O2 和 5% CO2 罐	N/A	N/A
Ames'含 L-谷氨酰胺的培养基，不含碳酸氢盐	Sigma-Aldrich	A1420
CaCl2（99%，二水合物）	Sigma	C-3881
Drierite（无水硫酸钙，>98% CaSO4，>2% CoCl2）	WA Hammond Drierite Co LTD	21005
Falcon 易握培养皿（聚苯乙烯，35 x 10 mm）	Falcon-Corning	08-757-100A
Falcon 易握组织培养皿（60 x 15 毫米）	Falcon-Corning	08-772F
羽毛手术刀（10 号，40 毫米）	VWR	100499-578
羽毛手术刀（11 号，40 毫米）	VWT	100499-580
KCl （99%）	Sigma	P-4504
Kimble Kontes 颗粒杵	Sigma	z359971
Labconco 速冻瓶	Labconco	N/A
LN2（液氮）+ 杜瓦瓶或类似真空瓶	N/A
MgCl2	Sigma	M-9272
Milli-Q/去离子水	EMD Millipore	N/A
Na2HPO4（粉末））	J.T. Baker	4062-01
NaCl （晶体）	EMD Millipore	Sx0420-3
NaHCO3	Amresco	0865
OmniPur EDTA	EMD	4005
OmniPur HEPES，游离酸	EMD	5320
封口膜 M	Sigma-Aldrich	P7793
雷诺包装铝箔	Reynolds 品牌	N/A
苏格兰魔术胶带 （12.7 mm x 32.9 m）	Scotch-3M	N/A
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D67501
Spectrafuge 迷你离心机	Labnet International， Inc	C1301
组织培养室（购买或定制）	N/A	N/A
Tris-HCl	J.T.Baker	4103-02
Triton X-100	Signma-Aldrich	T8787
VirTis 台式 2K 冻干机或同等机器	SP Scientific	N/A
VWR 413 级过滤纸（直径 5.5 厘米，孔径 5 μm）	VWR	28310-015
Whatman 1 级定性滤纸（直径 9 cm，孔径 11 &μ;m）	Whatman/GE Healthcare	1001-090
大口径移液管，Global Scientific	VWR	76285-362