本文介绍了一种使用玫瑰红（rose bengal）和激光引导视网膜成像显微镜系统建立视网膜静脉阻塞的优化方案，并提供了提高其在基因修饰品系中可重复性的建议。
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摘要
摘要
视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型常用于眼科研究神经视网膜中的缺氧-缺血性损伤。本报告提供了一种详细的方法，指出了关键步骤，并提出了优化建议，以在不同基因修饰小鼠品系中实现稳定且成功的阻塞率。该RVO小鼠模型主要包括静脉内注射光敏染料，随后使用连接眼科导向激光的视网膜成像显微镜进行激光光凝。研究确定了三个影响阻塞一致性的关键变量。通过调整玫瑰红（rose bengal）注射后的等待时间，并平衡基线与实验激光输出功率，可减少实验间的变异性，提高阻塞成功率。该方法可用于研究以视网膜水肿和缺氧-缺血性损伤为特征的视网膜疾病。此外，由于该模型可诱导血管损伤，也可用于研究神经血管系统、神经元死亡及炎症反应。
引言
视网膜静脉阻塞（RVO）是一种常见的视网膜血管疾病，2015年全球约有2800万人受其影响1。RVO可导致工作年龄成年人及老年人视力下降甚至丧失，是一种持续存在的致盲性疾病，预计在未来十年内发病率将进一步上升。RVO的一些明确病理特征包括缺氧-缺血性损伤、视网膜水肿、炎症反应以及神经元丢失2。目前，该疾病的首选治疗方法是使用血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂。尽管抗VEGF治疗有助于缓解视网膜水肿，但许多患者仍面临视力持续下降的问题3。为了进一步理解该疾病的病理生理机制，并测试潜在的新治疗方案，有必要建立一种适用于不同小鼠品系的功能完善且细节明确的RVO小鼠模型操作流程。
已开发出采用与人类患者相同激光设备的小鼠模型，并结合了适用于小鼠眼尺寸的成像系统。该视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型最早于2007年被报道4，随后由Ebneter等人进一步完善4,5。最终，Fuma等人对该模型进行了优化，以复制RVO的关键临床表现，例如视网膜水肿6。自该模型首次报道以来，许多研究均采用此方法，即先给予光敏染料，随后使用激光对主要视网膜静脉进行光凝。然而，不同研究中所使用的染料种类与剂量、激光功率以及照射时间存在显著差异。这些差异往往导致模型的变异性增加，难以重复。迄今为止，尚无已发表的研究提供有关该模型优化潜力的具体细节。
本报告详细介绍了在C57BL/6J品系小鼠中建立视网膜静脉阻塞（RVO）模型的方法，并介绍了以C57BL/6J为遗传背景的他莫昔芬诱导型内皮细胞caspase-9基因敲除（iEC Casp9KO）小鼠品系，该品系与RVO病理过程相关，可作为基因修饰小鼠的参考品系。既往研究已表明，内皮细胞caspase-9的非凋亡性激活可引发视网膜水肿并促进神经元死亡8。使用该品系的经验有助于明确并深入理解RVO小鼠模型潜在的优化方向，这些改进方法也可适用于其他基因修饰小鼠品系。
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方案
本方案遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿类动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准并接受其监督。
注意：所有实验均使用约20克重的两个月大雄性小鼠。
1. 他莫昔芬的制备及用于诱导型条件性基因敲除的给药
注意：视网膜血管直径可能受动物体重影响。确保实验中使用的所有动物体重相近。
- 将他莫昔芬用玉米油稀释至浓度为 20 mg/mL。
注意：他莫昔芬具有毒性且对光敏感。应避光保存，例如用铝箔包裹。 - 将溶液涡旋振荡数秒钟。
- 置于 55 °C 的烘箱中 15 分钟。
注意：确保他莫昔芬已完全溶解。可能需要再次涡旋振荡。 - 溶液可在 4 °C 下保存最多 1 周。
- 使用配有 26 G 针头的 1 mL 注射器进行他莫昔芬注射。用 70% 乙醇清洁注射部位。 根据特定的可诱导 Cre 品系确定的时间，每天一次经腹腔注射（IP）给予 2 mg 他莫昔芬（100 µL 的 20 mg/mL 溶液）。
- 在开始实验前，让动物休息两天。
2. 激光光凝试剂的制备
- 玫瑰红
注意：玫瑰红对光敏感。请避光保存直至使用，并现配现用以获得最佳效果。- 用无菌生理盐水将玫瑰红稀释至 5 mg/mL，并通过 0.2 µm 注射器滤器过滤。
- 用玫瑰红溶液准备一支配有 26 G 针头的 1 mL 注射器。
- 氯胺酮/赛拉嗪
- 用无菌生理盐水将氯胺酮和赛拉嗪分别稀释至以下浓度：氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）。
- 卡洛芬
- 用无菌生理盐水将卡洛芬稀释至 1 mg/mL。
- 用卡洛芬溶液准备一支配有 26 G 针头的 1 mL 注射器。
- 无菌生理盐水
- 用无菌生理盐水准备一支配有 26 G 针头的 5 mL 注射器。
3. 激光装置设置
- 轻柔地操作光纤电缆，并将其连接至激光控制箱和视网膜成像显微镜的激光适配器。
- 打开视网膜成像显微镜灯箱。
- 打开计算机并启动成像程序。
- 使用一张白纸，将其置于小鼠目镜前方，然后点击以调整白平衡 调节 在成像程序中。
- 打开激光控制箱的钥匙以启动设备，并按照激光控制箱屏幕上的指示进行操作。
注意：本实验中使用的激光器为3B类，可能造成眼部损伤。操作激光器时应佩戴防护护目镜。 - 验证基线激光功率。
- 使用激光功率计。
- 将激光控制箱的屏幕参数调整为：50 mW 和 2,000 ms。
- 打开激光器，将功率计置于目镜前方。
注意： 测试基线激光功率时，请确保显微镜光源已关闭。 - 踩下脚踏开关以激活激光。
- 目标使激光功率读数为13–15 mW。
注意：激光功率读数将决定视网膜静脉阻塞造模的成功率。若激光功率读数过低，可对激光照射的功率和时间进行调整。参见 表1 以获取建议。
- 通过设置调节实验激光功率 激光控制箱的屏幕 对于以下参数：100 mW，1,000 ms。
- 关闭激光器。
注意：出于安全考虑并防止过热，建议在处理不同小鼠之间保持激光关闭。
4. 罗丹明B小鼠尾静脉注射
- 将300 mL水倒入500 mL烧杯中。
- 将烧杯放入微波炉中加热1分钟。
- 将纱布放入烧杯的温水中。
- 将小鼠放入固定器中。
- 轻轻按压小鼠尾部纱布，观察扩张的静脉。消毒注射部位 使用温水扩张后，再用酒精棉片擦拭。
- 将针头插入注射部位并 拉动注射器以确保你处于正确位置 静脉。然后， 通过尾静脉注射小鼠，根据动物体重给予正确剂量（37.5 mg/kg）。注射后对注射部位施加压力，以避免血肿或出血。擦拭注射部位。
- 将小鼠从固定器中释放并放回笼中。
- 在注射麻醉剂前，让玫瑰红素循环8分钟。
注意：玫瑰红注射与激光照射之间将总共间隔10分钟。
5. 主要静脉的阻塞
- 打开加热小鼠平台。
- 在每只眼睛中各滴入一滴去氧肾上腺素和托吡卡胺。
- 腹腔注射150 µL麻醉剂，包括氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）。
注意：在此操作过程中，小鼠需接受两次腹腔注射，因此应交替注射部位。麻醉剂注射于 右下腹象限，生理盐水注射于 左下腹象限。建议在注射前回抽注射器，以确认针头位于腹腔内而非器官内。 - 通过夹捏脚趾评估动物的麻醉深度，并等待至其无反应为止。
- 每只眼睛滴入一滴盐酸丙帕他卡因（镇痛剂）。
- 在双眼表面涂抹凝胶眼膏。
- 在耳间区域皮下注射150 µL卡洛芬。
- 将小鼠安置于平台上。
- 调节平台位置，直至视网膜眼底视野清晰且聚焦良好。
- 计数视网膜静脉，并拍摄眼底图像。
注意：视网膜静脉比动脉颜色更深、管径更宽。静脉与动脉通常交替排列；但有时在视神经附近可能存在分支动脉，从而导致相邻的两条动脉。 - 打开激光，将光束对准距视盘约375 µm处的一条视网膜静脉。
- 踩下脚踏开关照射血管，同时轻微移动激光束，移动范围不超过100 µm。重复此步骤三次，每次脉冲后移动激光束位置，避免在同一位置集中照射。
- 对其他主要血管重复照射，以实现2–3个阻塞点。
6. 确定第0天闭塞的静脉数量
- 照射容器后关闭光源，并等待10分钟。
注意：光照可能导致视网膜损伤和炎症；在等待期间关闭光源以尽量减少暴露7。 - 重新打开光源，统计闭塞的静脉数量。
- 拍摄眼底图像。
7. 术后护理
- 腹腔注射1 mL无菌生理盐水。
注意：腹腔注射的详细步骤见第5节第3步。 - 向双眼滴加润滑性眼药水。
- 向双眼涂抹凝胶眼膏。
- 密切观察小鼠从麻醉中恢复的过程，在其完全恢复前不得将其放回与其他动物共用的笼具中。术后可每日给予卡洛芬（5 mg/kg），最多连续使用2天。 若应用于人类，疼痛并非视网膜静脉阻塞（RVO）的症状。
注意： 在动物完全恢复之前，不得使其无人看管。
8. 通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜水肿
注意：此步骤可根据研究者的兴趣时间点进行。C57BL/6J小鼠视网膜水肿的高峰期为RVO手术后1天。该时间点可能因小鼠品系背景不同而有所变化。
- 打开视网膜成像显微镜光源箱、OCT 仪器以及加热小鼠平台。
- 闭塞后的第二天，按照步骤 5.2 至 5.7 准备动物。
- 启动成像和 OCT 软件程序。
- 在 OCT 程序中，将微调值设为 5。
- 在距离烧灼部位远端 75 µm 处或 4 个点击位置处进行 OCT 扫描。
- 在视网膜的四个象限分别采集 OCT 图像。
- 使用描记软件分析 OCT 图像。
- 比较照射前与 RVO 后 1 天或感兴趣时间点的视网膜厚度。
注意：分析数据时，应考虑被照射的静脉数量，因其可能影响视网膜水肿的发展。随后通过给予麻醉剂并实施灌注性非存活手术处死动物。
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结果
视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型旨在成功实现视网膜静脉的阻塞，从而导致缺氧-缺血性损伤、血-视网膜屏障破坏、神经元死亡以及视网膜水肿8。图1展示了为确保实验可重复性的操作时间线、实验设计示意图，以及可根据具体科学问题进一步优化的关键步骤。其中三个可调整的主要参数为：玫瑰红（rose bengal）给药后的等待时间、基础激光功率和实验激光输出强度。本研究中使用了C57BL/6J小鼠，以及诱导型内皮细胞caspase-9基因敲除小鼠品系（iEC Casp9）的野生型（WT）和基因敲除型（KO）同窝小鼠，以确定不同品系间的最佳实验条件。
玫瑰红注射后至激光照射之间的等待时间可能会影响静脉光凝效果。等待时间过短可能导致静脉内玫瑰红浓度不足，而等待时间过长则可能导致玫瑰红从视网膜循环中被清除。这两种情况均可能导致光凝效果不佳和闭塞失败。在检测激光照射后立即获得的闭塞数量时，比较在注射玫瑰红后10分钟和20分钟进行激光处理的动物，结果显示两者在闭塞数量上无显著差异（
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讨论
小鼠视网膜静脉阻塞（RVO）模型为深入理解RVO的病理机制以及测试潜在治疗方法提供了途径。尽管小鼠RVO模型在该领域被广泛使用，但仍缺乏一份详尽的最新实验方案来应对模型的变异性，并描述其优化过程。本文基于实践经验，提供了一份操作指南，介绍如何调整实验条件以在一组实验动物中获得最一致的结果，并生成可靠的数据。
RVO 小鼠模型的两个最关键要素是激光输出和光敏染料的静脉注射。当激光对准特定静脉以诱导凝固时，必须适当调整激光输出，以产生所需的功率。虽然本方法中建议的技术可实现这一目标，但需考虑各实验室系统设置的差异。光纤电缆的差异及其与设备的连接方式、室温等因素，均可能导致激光输出偏低。建议针对系统设置进行独立调试，以提高激光输出。
然而，若无合适的尾静脉注射技术来递送光敏染料，这一操作将无法实现。尾静脉注射较难完成，且需要一定时间才能掌握。注射操作不当可能导致无法形成阻塞；在此情况下，可采用腹腔注射（IP）给予玫瑰红染料。已有研究通过腹腔注射玫瑰红建立视网膜静脉阻塞（RVO）模型，但需更长的激光照射时间（3秒）和更高的玫瑰红浓度（...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助 DGE – 1644869（授予 CKCO）、国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（授予 AMP）、国家老龄化研究所（NIA）R21AG063012（授予 CMT）以及美国国防部陆军研究办公室大学研究仪器计划（DURIP）（授予 CMT）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卡洛芬 | Rimadyl | NADA #141-199 | 保存于 4 °C |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 光纤补丁电缆 | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| 盐酸氯胺酮 | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| 去氧肾上腺素 | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV 配备 Meridian、 StreamPix 和 OCT 模块 | Phoenix Technology Group | ||
| 盐酸丙帕他莫 | Akorn | NDC: 17478-263-12 | 保存于 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| 玫瑰红染料 | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-5G | 避光 |
| 托吡卡胺 | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| 赛拉嗪 | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
参考文献
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