优化视网膜静脉遮挡小鼠模型以限制变异性

摘要

在这里，我们描述了使用孟加拉玫瑰和激光引导视网膜成像显微镜系统进行视网膜静脉阻塞的优化方案，并建议最大限度地提高其在转基因菌株中的可重复性。

摘要

视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型通常用于眼科研究神经视网膜中的缺氧缺血损伤。在本报告中，提供了一种详细的方法，指出了关键步骤，并提供了优化建议，以在不同转基因小鼠品系中实现一致的成功闭塞率。RVO小鼠模型主要包括静脉内施用光敏剂染料，然后使用连接到眼科引导激光的视网膜成像显微镜进行激光光凝。三个变量被确定为遮挡一致性的决定因素。通过调整孟加拉玫瑰给药后的等待时间并平衡基线和实验激光输出，可以限制实验之间的变异性，并获得更高的遮挡成功率。该方法可用于研究以视网膜水肿和缺氧缺血性损伤为特征的视网膜疾病。此外，由于该模型诱导血管损伤，它也可以应用于研究神经脉管系统、神经元死亡和炎症。

引言

视网膜静脉阻塞 （RVO） 是一种常见的视网膜血管疾病，2015 年影响了全球约 2800 万人¹。RVO导致工作的老年人和老年人视力下降和丧失，这是一种持续的视力威胁疾病，估计在近十年内会增加。RVO 的一些不同病变包括缺氧缺血性损伤、视网膜水肿、炎症和神经元丢失²。目前，这种疾病的一线治疗是通过给予血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂。虽然抗VEGF治疗有助于改善视网膜水肿，但许多患者仍面临视力下降³。为了进一步了解这种疾病的病理生理学并测试潜在的新治疗线，需要为不同的小鼠品系构建功能性和详细的RVO小鼠模型方案。

已经开发了小鼠模型，实现了与人类患者相同的激光设备，并与缩放到鼠标正确尺寸的成像系统配对。这种RVO小鼠模型于2007年首次报道4^，并由Ebneter^等人4^，5进一步建立。最终，Fuma等人对该模型进行了优化，以复制RVO的关键临床表现，例如视网膜水肿⁶。自该模型首次报道以来，许多研究已经使用它，使用光敏染料，然后用激光对视网膜主要静脉进行光凝。然而，在使用这种方法的研究中，施用染料的数量和类型、激光功率和暴露....

方案

该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。

注意:所有实验都使用重约20g的两个月大的雄性小鼠。

1.他莫昔芬用于絮状基因诱导遗传消融的制备和给药

注意:视网膜血管直径可能受动物体重的影响。确保用于实验的所有动物的体重相似。

1. 将他莫昔芬在玉米油中稀释至20mg / mL的浓度。
   注意:他莫昔芬是一种有毒物质，对光敏感。避光，例如用铝箔。
2. 涡旋溶液几秒钟。
3. 在55°C的烤箱中放置15分钟。
   注意:确保他莫昔芬已完全溶解。可能需要额外的涡旋。
4. 将溶液在4°C下储存长达1周。
5. 使用装有 26 G 针头的 1 mL 注射器进行他莫昔芬注射。用70%乙醇清洁注射区域。 根据特定的诱导性Cre线，每天一次腹膜内（IP）给予2mg他莫昔芬（100μL的20mg / mL），在确定的时间内。
6. 在开始实验之前，让动物休息两天。

2. 激光光凝试剂的制备

1. 孟加拉玫瑰
   注意:孟加拉玫瑰对光敏感。在黑暗中存放直至使用，并准备新鲜以获得最佳效果。

结果

RVO小鼠模型旨在成功实现视网膜静脉闭塞，导致缺氧缺血损伤，血液视网膜屏障破裂，神经元死亡和视网膜水肿⁸。 图1 显示了确保可重复性的步骤时间表，实验设计的示意图，并概述了可以根据实验问题进一步优化的步骤。可以修改的三个主要步骤是孟加拉玫瑰给药后的等待时间、基线激光功率和实验激光输出。在本报告中，C57BL / 6J小鼠以及来自诱导性内皮细胞半胱天冬酶-9敲除小鼠系（iEC Casp9）的WT和KO同窝小鼠用于确定不同菌株的最佳设置。

从孟加拉玫瑰注射到激光照射的等待时间可以改变静脉光凝的成功率。等待时间太短可能导致静脉内孟加拉玫瑰浓度低，而等待时间过长会导致孟加拉玫瑰从视网膜循环中清除。这两种情况都可能导致光凝不良和闭塞不成功。当测试激光照射后立即获得的遮挡次数时，比较孟加拉玫瑰给药后10和20分钟激光照射的动物发现，实现的遮挡数量没有差异（图2B）。然而，在与基因型无关的孟加拉玫瑰给药后20分钟激光照射的动物中，.......

讨论

小鼠RVO模型为进一步了解RVO病理学和测试潜在治疗方法提供了途径。虽然鼠标RVO模型在该领域被广泛使用，但需要模型的当前详细协议来解决其可变性并描述模型的优化。在这里，我们提供了一个指南，其中包含经验示例，说明可以改变哪些内容，以便在一组实验动物中获得最一致的结果，并提供可靠的数据。

RVO小鼠模型的两个最重要的元素是光敏染料的激光输出和成功静脉注射。当激光对准特定静脉时，为了产生诱导凝血所需的功率，必须适当调整激光输出。虽然这可以使用方法中建议的技术来实现，但重要的是要考虑每个实验室系统设置的差异。光纤电缆的变化以及它如何适应与设备和室温的关系是可以解释低激光输出的一些变量。建议对系统设置进行独立调整，以增加激光输出。

然而，如果没有适当的尾脉技术来输送光敏染料，这项工作是无法操作的。尾静脉注射可能很难实现，这是一项需要时间培养的技能。注射不良会导致无阻塞;在这种情况下，孟加拉玫瑰可以通过IP进行管理。通过IP给予孟加拉玫瑰已被用于模拟RVO，但激光照射时间更长（3秒）和孟加拉玫瑰浓度更高（40mg / mL）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卡洛芬	Rimadyl	NADA #141-199	保持在 4 度;C
玉米油	Sigma-Aldrich	C8267
光纤跳线	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
氯胺酮盐	Henry Schein	NDC： 11695-0702-1
激光检查	相干	1098293
去氧肾上腺素	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV 与 Meridian 配合使用， StreamPix 和 OCT 模块	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC： 17478-263-12	保持在 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648-5G	光敏
性托吡卡胺	Akorn	NDC：174478-102-12
甲苯噻	嗪 Akorn	NDCL 59399-110-20