本文介绍了一种使用玫瑰红（rose bengal）和激光引导视网膜成像显微镜系统建立视网膜静脉阻塞的优化方案，并提供了提高其在基因修饰品系中可重复性的建议。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型常用于眼科研究神经视网膜中的缺氧-缺血性损伤。本报告提供了一种详细的方法，指出了关键步骤，并提出了优化建议，以在不同基因修饰小鼠品系中实现稳定且成功的阻塞率。该RVO小鼠模型主要包括静脉内注射光敏染料，随后使用连接眼科导向激光的视网膜成像显微镜进行激光光凝。研究确定了三个影响阻塞一致性的关键变量。通过调整玫瑰红（rose bengal）注射后的等待时间，并平衡基线与实验激光输出功率，可减少实验间的变异性，提高阻塞成功率。该方法可用于研究以视网膜水肿和缺氧-缺血性损伤为特征的视网膜疾病。此外，由于该模型可诱导血管损伤，也可用于研究神经血管系统、神经元死亡及炎症反应。
引言
视网膜静脉阻塞（RVO）是一种常见的视网膜血管疾病，2015年全球约有2800万人受其影响1。RVO可导致工作年龄成年人及老年人视力下降甚至丧失，是一种持续存在的致盲性疾病，预计在未来十年内发病率将进一步上升。RVO的一些明确病理特征包括缺氧-缺血性损伤、视网膜水肿、炎症反应以及神经元丢失2。目前，该疾病的首选治疗方法是使用血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂。尽管抗VEGF治疗有助于缓解视网膜水肿，但许多患者仍面临视力持续下降的问题3。为了进一步理解该疾病的病理生理机制，并测试潜在的新治疗方案，有必要建立一种适用于不同小鼠品系的功能完善且细节明确的RVO小鼠模型操作流程。
已开发出采用与人类患者相同激光设备的小鼠模型，并结合了适用于小鼠眼尺寸的成像系统。该视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型最早于2007年被报道4，随后由Ebneter等人进一步完善4,5。最终，Fuma等人对该模型进行了优化，以复制RVO的关键临床表现，例如视网膜水肿6。自该模型首次报道以来，许多研究均采用此方法，即先给予光敏染料，随后使用激光对主要视网膜静脉....
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方案
本方案遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿类动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准并接受其监督。
注意：所有实验均使用约20克重的两个月大雄性小鼠。
1. 他莫昔芬的制备及用于诱导型条件性基因敲除的给药
注意：视网膜血管直径可能受动物体重影响。确保实验中使用的所有动物体重相近。
- 将他莫昔芬用玉米油稀释至浓度为 20 mg/mL。
注意：他莫昔芬具有毒性且对光敏感。应避光保存，例如用铝箔包裹。 - 将溶液涡旋振荡数秒钟。
- 置于 55 °C 的烘箱中 15 分钟。
注意：确保他莫昔芬已完全溶解。可能需要再次涡旋振荡。 - 溶液可在 4 °C 下保存最多 1 周。
- 使用配有 26 G 针头的 1 mL 注射器进行他莫昔芬注射。用 70% 乙醇清洁注射部位。 根据特定的可诱导 Cre 品系确定的时间，每天一次经腹腔注射（IP）给予 2 mg 他莫昔芬（100 µL 的 20 mg/mL 溶液）。
- 在开始实验前，让动物休息两天。
2. 激光光凝试剂的制备
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结果
视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型旨在成功实现视网膜静脉的阻塞，从而导致缺氧-缺血性损伤、血-视网膜屏障破坏、神经元死亡以及视网膜水肿8。图1展示了为确保实验可重复性的操作时间线、实验设计示意图，以及可根据具体科学问题进一步优化的关键步骤。其中三个可调整的主要参数为：玫瑰红（rose bengal）给药后的等待时间、基础激光功率和实验激光输出强度。本研究中使用了C57BL/6J小鼠，以及诱导型内皮细胞caspase-9基因敲除小鼠品系（iEC Casp9）的野生型（WT）和基因敲除型（KO）同窝小鼠，以确定不同品系间的最佳实验条件。
玫瑰红注射后至激光照射之间的等待时间可能会影响静脉光凝效果。等待时间过短可能导致静脉内玫瑰红浓度不足，而等待时间过长则可能导致玫瑰红从视网膜循环中被清除。这两种情况均可能导致光凝效果不佳和闭塞失败。在检测激光照射后立即获得的闭塞数量时，比较在注射玫瑰红后10分钟和20分钟进行激光处理的动物，结果显示两者在闭塞数量上无显著差异（
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讨论
小鼠视网膜静脉阻塞（RVO）模型为深入理解RVO的病理机制以及测试潜在治疗方法提供了途径。尽管小鼠RVO模型在该领域被广泛使用，但仍缺乏一份详尽的最新实验方案来应对模型的变异性，并描述其优化过程。本文基于实践经验，提供了一份操作指南，介绍如何调整实验条件以在一组实验动物中获得最一致的结果，并生成可靠的数据。
RVO 小鼠模型的两个最关键要素是激光输出和光敏染料的静脉注射。当激光对准特定静脉以诱导凝固时，必须适当调整激光输出，以产生所需的功率。虽然本方法中建议的技术可实现这一目标，但需考虑各实验室系统设置的差异。光纤电缆的差异及其与设备的连接方式、室温等因素，均可能导致激光输出偏低。建议针对系统设置进行独立调试，以提高激光输出。
然而，若无合适的尾静脉注射技术来递送光敏染料，这一操作将无法实现。尾静脉注射较难完成，且需要一定时间才能掌握。注射操作不当可能导致无法形成阻塞；在此情况下，可采用腹腔注射（IP）给予玫瑰红染料。已有研究通过腹腔注射玫瑰红建立视网膜静脉阻塞（RVO）模型，但需更长的激光照射时间（3秒）和更高的玫瑰红浓度（.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助 DGE – 1644869（授予 CKCO）、国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（授予 AMP）、国家老龄化研究所（NIA）R21AG063012（授予 CMT）以及美国国防部陆军研究办公室大学研究仪器计划（DURIP）（授予 CMT）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卡洛芬 | Rimadyl | NADA #141-199 | 保存于 4 °C |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 光纤补丁电缆 | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| 盐酸氯胺酮 | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| 去氧肾上腺素 | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV 配备 Meridian、 StreamPix 和 OCT 模块 | Phoenix Technology Group | ||
| 盐酸丙帕他莫 | Akorn | NDC: 17478-263-12 | 保存于 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| 玫瑰红染料 | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-5G | 避光 |
| 托吡卡胺 | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| 赛拉嗪 | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
参考文献
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S.
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重印与许可
