本文描述了一种负压通气的猪模型 离体 肺灌注，包括器官获取、连接及在定制平台上的管理。重点介绍麻醉与外科技术，以及问题排查。
本文内容
摘要
摘要
肺移植（LTx）仍是终末期肺病的标准治疗手段。合适的供体器官短缺，以及因过长的地理运输距离和严格的供体器官接受标准而导致的供体器官质量担忧，限制了当前肺移植的开展。离体肺灌注（ESLP）是一项具有前景的创新技术，有望缓解这些限制。在供体机体的炎症环境之外对肺进行生理性的通气和灌注，使ESLP相较于传统的冷静态保存（CSP）具有多项优势。已有证据表明，负压通气（NPV）ESLP优于正压通气（PPV）ESLP，因为PPV更容易引起更显著的呼吸机相关性肺损伤、促炎性细胞因子产生、肺水肿和肺大疱形成。NPV的优势可能源于胸腔内压力在整个肺表面的均匀分布。一种定制的NPV-ESLP装置的临床安全性和可行性已在一项涉及扩展标准供体（ECD）人肺的临床试验中得到验证。本文描述了该定制装置在幼年猪模型中进行12小时常温NPV-ESLP的应用，特别关注器官管理技术。文中详细说明了术前准备，包括ESLP软件的初始化、ESLP管路的预充和排气，以及抗血栓、抗微生物和抗炎药物的添加。文中描述了中心静脉置管、肺活检、放血、血液采集、心脏切除和肺切除等术中操作技术。此外，特别强调了麻醉相关事项，详细列出了麻醉诱导、维持及动态调整方案。该方案还规定了定制装置的启动、灌注与通气的维持及终止流程。对动态器官管理技术，包括通气和代谢参数的调整以优化器官功能，进行了详尽描述。最后，代表性结果中展示了肺功能的生理学和代谢评估指标。
引言
肺移植（LTx）仍是终末期肺病的标准治疗方案1；然而，肺移植存在诸多局限性，包括供体器官利用率不足2以及高达40%的等待名单死亡率3，后者高于其他任何实体器官移植4,5。由于对器官质量的担忧，供体器官的利用率较低（20–30%）。过长的地理运输距离，加上严格的供体器官接受标准，进一步加剧了对器官质量的顾虑。在长期移植物存活率和患者预后方面，肺移植也落后于其他实体器官移植2。原发性移植物功能障碍（PGD）是最常见的缺血再灌注损伤（IRI）所致并发症，是肺移植术后30天内死亡率和发病率的首要原因，并增加慢性移植物功能障碍的风险6,7。减少缺血再灌注损伤并延长安全运输时间，对于改善患者预后至关重要。
离体肺灌注（ESLP）是一项具有前景的创新技术，可有效缓解上述局限性。ESLP可在肺移植前实现供体肺的保存、评估和功能修复。在扩展标准供体（ECD）肺移植中，该技术已展现出良好的短期和长期效果，有助于增加适用于肺移植（LTx）的供体肺数量，部分中心的器官利用率提高了20%8,9,10。与当前肺移植临床标准——冷静态保存（CSP）相比，ESLP具有多项优势：器官保存时间不再局限于6小时，可在移植前评估器官功能，并且由于实现了器官的持续灌注，可对灌注液进行调整以优化器官功能11。
目前绝大多数用于人类的ESLP设备采用正压通气（PPV）；然而，近期文献表明，该通气策略劣于负压通气（NPV）ESLP，因正压通气更易引发显著的呼吸机相关性肺损伤12,13,14,15在人和猪的肺脏中，与正压通气相比，NPV-ESLP 表现出更优的器官功能 离体 肺灌注（PPV-ESLP）在多种生理学领域中的表现，包括促炎性细胞因子生成、肺水肿及大疱形成15NPV-ESLP中胸内压在整个肺表面的均匀分布被认为是产生这一优势的重要因素15,16除了其在临床前的优势外，NPV-ESLP的临床安全性和可行性已在最近的一项临床试验中得到证实17利用一种新型的NPV-ESLP装置，成功保存、评估并移植了十二例扩展标准供体人肺，术后30天和1年生存率均达到100%。
本文的目的是展示我们实验室的NPV-ESLP设备在常温条件下对幼猪肺脏进行12小时灌注的可行操作方案。文中详细介绍了手术获取过程，以及我们定制软件平台的启动、运行和终止操作。同时，还阐述了组织样本的采集策略及样本管理方法。
方案
本手稿中进行的操作符合加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）的指南以及《实验动物护理与使用指南》的要求。实验动物护理机构委员会（University of Alberta）已批准相关实验方案。实验 exclusively 使用体重在 35–50 kg 之间的雌性幼年约克夏猪。所有参与 ESLP 操作的人员均需接受适当的生物安全培训。整个 NPV-ESLP 实验的示意图见图 1。
1. 术前准备
- 将器官腔室置于ESLP推车上，并将硅胶支撑膜（参见材料表）安装到腔室挂钩上以进行悬吊。
- 组装ESLP管路、脱氧器、动脉过滤器和离心泵。
- 将热交换器的水管连接至脱氧器，并连接吹扫气体管路。
- 将温度传感器探头（参见材料表）插入脱氧器中。
- 将肺动脉（PA）流量传感器（参见材料表）牢固固定在PA管路上。
注：流量传感器利用超声波测量流量，并将信号反馈至离心泵。 - 使用三通旋塞将肺动脉压力传感器连接至PA插管。
- 牢固连接所有管路接头以防止泄漏，在加入灌注液前关闭所有旋塞和鲁尔锁。
- 用1000 mL改良的常见医院成分灌注液（CHIP）预充管路系统。
注：CHIP是一种自制的低成本灌注液，其胶体渗透压为35 mmHg，与商业灌注液相当18。 - 管路系统预充完成后启动软件，以帮助排除泵和管路中的空气。
注：这些步骤与图2和图3相关。
2. ESLP 软件初始化、调整及去气泡回路
- 点击显示器上的程序快捷方式以启动 ESLP 程序。依次选择 扫描、推车 3、连接，然后选择NPV 程序，接着点击启动软件。
- 在主页面上，当管路完成预充后，将流速调至 900 RPM，以排出管路中的空气，并通过稳定的液体流确认肺动脉插管中有灌注液流动。
- 向管路中加入 3.375 g 哌拉西林-他唑巴坦、10,000 单位肝素（10,000 U/1.5L 灌注液 = 6.66 U/L）和 500 mg 甲基泼尼松龙。
- 采集灌注液的动脉血气（ABG）样本以供参考。
- 在 主 页面上，将 CPAP 调至 20 cm H2O（最大值），并开启以检查其功能。确认运行正常后关闭。
- 在 主 页面上，将 EIP 设为 -5 cm H2O，并开启以检查其功能。确认操作无误后关闭。
- 在 设置 页面上，开启加热器（点击 启动加热器）并确认其功能。在监视器上更改温度设定值，并确认推车上的加热器监视器显示相应变化。确认运行正常后关闭。
注意：此处使用的 ESLP 装置配备有定制软件程序（图 4）。该软件可控制泵速和通气参数，以达到并维持所需的肺动脉流量（PA Flow）、持续气道正压（CPAP）、呼气末压力（EEP）、吸气末压力（EIP）、呼吸频率（RR）以及吸气:呼气（I:E）比值。软件可计算功能参数并生成压力-容积环。表 1 列出了该软件提供的所有监测参数。
3. 麻醉前准备
- 在手术室中，作为供体猪的术前用药，给予氯胺酮（20 mg/kg）和阿托品（0.05 mg/kg）（肌肉注射）。
- 将猪仰卧位置于加热的手术台上，维持正常体温，并进行面罩诱导麻醉。
- 根据动物体重滴定氧流量，通常为 20–40 mL/kg。
- 初始异氟烷浓度设为 4–5%，1–2 分钟后降至 3%。
- 每 5 分钟评估一次麻醉深度，确保猪对有害刺激无退缩反射。
- 确认达到合适麻醉深度后，对猪进行气管插管。
- 将脉搏血氧仪探头置于舌面（优先选择）或耳部，目标是维持血氧饱和度高于 90%。
- 调整氧流量（20–40 mL/kg）和吸入麻醉气体浓度（1–3%），以维持适当的麻醉水平。
- 呼吸机参数设置为目标潮气量 6–10 mL/kg，呼吸频率 12–30 次/分钟，呼气末正压（PEEP）5 cm H2O，峰压 20 cm H2O。
- 使用碘液对切口部位进行剃毛和清洗，完成术前准备。
4. 肺活检、放血和血液采集
- 插入中心静脉导管用于输液和肝素给药。
- 使用电刀在气管正上方做一条5-8 cm的中线切口，从胸骨切迹开始向头侧延伸。
- 使用电刀切开皮肤和皮下脂肪组织。
- 为识别位于气管外侧的左侧或右侧颈动脉血管束，需切开胸骨舌骨肌之间的中线平面，并分离结缔组织层。
- 使用2-0丝线作为血管环，实现对颈外静脉远端和近端的控制。
- 为控制血流，结扎头侧环绕的丝线，并向上牵拉近端丝线。
- 为置入7 Fr中心静脉导管，使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）在静脉上做一小切口（约为血管周长的1/3）。
- 在松开近端血管环张力的同时进行静脉插管。结扎丝线以固定导管，使其在静脉内深度达10 cm。
- 用肝素（1单位/mL）冲洗导管后连接至0.9%生理盐水静脉输液通路。若猪因脱水导致血管内容量不足，则给予补液治疗。未使用的导管端口用肝素封管。
- 行胸骨正中切开术
- 以胸骨切迹和剑突作为切口定位标志。
- 使用电刀沿胸骨全长做一条中线切口（约40-50 cm），连接胸骨切迹处的原有切口至剑突。
- 切开胸大肌纤维间的皮下组织和筋膜。电凝止血任何出血的血管，以维持止血状态。
- 使用电刀在胸骨骨面上标记中线。用粗剪刀剪除剑突，并用手指钝性分离心包与胸骨后板，形成可触及的空间以便容纳胸骨锯。
- 在胸骨两侧第4肋水平、肋软骨连接处外侧各放置一把巾钳。钳夹覆盖的组织及筋膜层，并在胸骨切开过程中垂直提起胸骨，使其远离心脏。
- 使用电动或气动锯（锯齿朝上）从剑突向胸骨切迹方向进行胸骨切开。为避免损伤下方结构（如心包、头臂静脉和无名动脉），应缓慢推进锯片，并利用巾钳垂直牵拉组织。
注：胸骨切迹处胸骨向后深陷，锯片必须向后倾斜，才能在该水平完成胸骨切开。 - 使用电刀对出血的胸骨断面进行止血。
注：也可使用骨蜡实现止血。 - 静脉给予1,000 U/kg肝素。在肝素给药后5分钟采集体内（in vivo）血样。
- 用手指钝性分离胸膜与胸骨内面，为胸骨牵开器创造操作空间。
- 插入胸骨牵开器，手柄朝向腹部，逐步牵开以充分暴露纵隔。
- 结合手指钝性分离与电刀技术，将胸腺从心包上完整剥离。
注：最好将胸腺作为一个整体大块移除，而非分小块切除。 - 取右肺上叶组织活检用于组织学分析：打开右侧胸膜以暴露右肺上叶。用0号丝线环绕约1 cm3的肺组织区域，结扎后使用梅岑鲍姆剪刀将其切除。
- 将活检组织均分为三等份，分别置于最佳切割温度（OCT）包埋胶、福尔马林溶液和液氮（速冻）中。
- OCT包埋样本和速冻样本储存于-80 °C冰箱，福尔马林固定的样本则置于4 °C冰箱中，使用密封良好的容器保存。
注：活检样本采用苏木精-伊红染色法进行染色，以评估肺损伤的组织病理学特征，包括间质性水肿、肺泡及间质炎症、间质和血管周围中性粒细胞浸润以及出血15。
- 打开心包。用镊子提起心包膜，使用梅岑鲍姆剪刀在心包中线处做一切口。
- 将切口向头侧延伸至主动脉根部，再向两侧延伸以暴露上腔静脉（SVC）。从尾侧完成心包切开术，并在心尖水平向左右两侧横向延伸切口，形成“T”形切口。
- 通过放血法处死实验猪。切开上腔静脉（SVC），将Poole吸引头（见材料表）插入管腔，并将吸引头推进至下腔静脉（IVC）。
注：为加快放血速度，可在左心房（LA）前壁做一切口。- 抬起心尖，使用梅岑鲍姆剪刀在冠状窦下方1 cm处切开左心房（LA）。在放血过程中，将吸入气体从100% O2切换为室内空气。
- 采集全血：将Poole吸引头连接至细胞回收装置，收集1200 mL全血，经离心后获得500 mL浓缩红细胞（pRBC）。
注：细胞回收仪操作参数设置如下：填充流速：300 mL/min，洗涤流速：100 mL/min，排空流速：150 mL/min，回输流速：150 mL/min，洗涤体积：300 mL，浓缩流速：200 mL/min。整个过程约需5分钟。
5. 心脏切除术
- 进行心脏切除术：将心尖向上方提起，并沿之前左心房的切口向侧方延伸，横断冠状窦，直至其与左侧半奇静脉汇合处。
- 通过在肺动脉分叉前表面做向内侧的切口，分离左心房。
- 在膈肌上方1 cm处横断下腔静脉。将此切口向内侧延伸，与左心房切口相连。
- 沿右肺动脉顶部向肺动脉分叉方向切开，完成左心房的分离。
注：此步骤将右上肺静脉从左心房后壁排除。 - 将下腔静脉向上方提起，切断右上肺静脉。分离主肺动脉与右心房/上腔静脉之间融合的胸膜反折组织。
- 将心脏放低，横断上腔静脉。从后方将上腔静脉与结缔组织层分离，随后横断奇静脉。
- 将心脏向上方提起，在肺动脉瓣水平切断肺动脉。使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum剪刀）将主动脉部分从肺动脉分离，然后横断升主动脉。
注：至此完成心脏切除术。
6. 肺切除术
- 进行肺切除术：检查呼气潮气量（TVe）是否约为10 mL/kg。调整为2:1的吸气:呼气比以达到该目标值。如果潮气量仍持续 < 6 mL/kg，增加峰压和/或呼气末正压（PEEP）以达到8–10 mL/kg的目标，实现肺泡最大程度的复张。
- 打开猪左侧的胸膜。使用梅岑鲍姆剪刀沿胸骨后缘做一水平切口。在纵隔的上下边界处，沿胸膜向下做两个垂直切口，直至膈神经。
- 沿膈神经切开并切除胸膜。在右侧重复此步骤。以左心房后袖口作为下界，参照膈神经的处理方式，同样切开并移除膈肌胸膜。
- 从膈肌向左下肺叶分离胸膜粘连。使用Deaver拉钩（参见 材料表将膈肌向上牵拉。在左侧切断下肺韧带，并继续向上分离至肺门。
- 尝试 "非接触技术" 就肺组织本身而言。
注意：应尽量减少对肺部的手动操作，以防止造成创伤。 - 在右侧，分离下腔静脉和胸膜与膈肌的连接处。使用Deaver拉钩将膈肌向上牵开。分离右侧下肺韧带，并继续向上至肺门区域。
- 分离无名静脉和弓部血管以暴露气管。
- 钝性分离气管周围组织。在呼气潮气量（TVe）约为10 mL/kg时，在最大吸气末使用管夹夹闭气管。
- 横断气管，并将夹住的部分向上提起，以供后续步骤的手术牵引。
- 使用粗齿Metzenbaum剪刀和徒手钝性分离法，将气管后部从食管上解剖下来。离断任何残留的胸膜附着物，在左支气管上下方横断主动脉，并连同一段降主动脉将肺脏从胸腔中取出。
- 用夹子夹住肺组织称重，然后迅速置于装满冰的冷藏容器中。在ESLP实验过程中肺组织重量的增加是肺水肿形成的指标。
注意：至此完成肺切除术。
7. 将肺组织放置到ESLP装置上
- 将500 mL pRBC加入灌注回路中（此前已用1L CHIP预充，见步骤1.8），使灌注液总体积达到1.5 L。
注意：血红蛋白浓度目标值约为50 g/L，或红细胞压积为15%。 - 拍摄肺部照片以留存数据记录。
- 取右肺中叶进行活检。用0号丝线围绕约1 cm3的肺组织区域，结扎后使用剪刀剪下该部分肺组织，用于组织学分析（方法同前，见步骤4.4）。
- 将3/8英寸、½英寸的管路接头固定至主肺动脉（mPA）。使用夹扣夹住mPA相对两侧，将接头的½英寸端插入mPA，并保持其位置稳定，由助手使用0号丝线结扎固定接头。
注意：接头应位于肺动脉分叉上方2–3 cm处（若肺动脉长度不足，可将供体猪的降主动脉一段以端对端方式缝合至mPA以延长长度）。 - 将肺置于硅胶支撑膜上，呈仰卧位，并连接至ESLP装置。
- 在气管靠近气管支气管的位置放置第二个管夹。移除更远端的管夹，然后插入气管插管（ETT）。
- 使用两条扎带固定气管插管位置。用管夹夹闭通气管路，并松开气管上的近端管夹。
注意：若操作正确且无漏气，肺将保持充气状态。
- 使用两条扎带固定气管插管位置。用管夹夹闭通气管路，并松开气管上的近端管夹。
- 将肺动脉接头连接至肺动脉管路，并排出mPA中的气体。启动灌注计时。
注意：各步骤的图示参见 图5。
8. 启动灌注和通气
- 在设置页面，点击启动加热器，并将温度设置为 38 °C。同时输入猪的体重，以计算心输出量（流量）。
- 在主页面，将 CPAP 设置为 20 cm H2O，并点击启动 CPAP。当通气开始后，松开通气管路的夹子。
- 对动脉压传感器进行调零。使用管夹在压力传感器上方夹闭肺动脉（PA）管路。将传感器与空气相通，点击设置页面上的ZERO PAP和Zero Bld Flow，然后在主页面确认读数已归零。
- 关闭压力传感器的三通阀以读取管路压力，将管路与肺动脉插管连通，在主页面选择10% 心输出量，点击Return to PA Manual（按钮变为绿色），然后松开肺动脉管路的夹子。
注意：此时管路已完成正确调零，泵的流量为计算心输出量的 10%。
- 关闭压力传感器的三通阀以读取管路压力，将管路与肺动脉插管连通，在主页面选择10% 心输出量，点击Return to PA Manual（按钮变为绿色），然后松开肺动脉管路的夹子。
- 抽取 10 mL 灌注液用于离心分析，并采集时间零点（T0）的动脉血气（ABG）。
- 当肺脏灌注 10 分钟后，将流量增加至心输出量的 20%。
- 当灌注液温度达到 32 °C 时，使用夹子将腔室盖固定到位，形成气密密封。在放置盖子前应优化肺的位置。使用 BV-1 针上的 6-0 Prolene 缝线修复任何漏气部位。
- 盖子固定后，夹闭通气管路并关闭 CPAP。在设置页面，点击Zero ITP, Zero Paw, Zero Air Flow，然后在主页面确认读数已归零。
- 在 20 cm H2O 下点击启动 CPAP，并松开通气管路的夹子。随后，将呼气末压（EEP）目标设为 0 cm H2O，吸气峰压（EIP）设为 1 cm H2O，呼吸频率（RR）设为 10，吸呼比（I:E）设为 1:1，点击Press to Start Vent以启动负压通气。
- 聆听呼吸机功能切换的声音，然后将侧端口通气管路连接至腔室。
注意：呼吸机的呼吸周期从呼气开始。若在呼气期间连接侧端口，肺会轻微压缩。建议等待并聆听吸气开始的声音，再连接侧端口，以实现最大程度的肺泡募集。
- 在接下来的几次呼吸中，将 CPAP 逐步降低至 12 cm H2O，同时将 EIP 逐步增加至 -9 cm H2O。维持这些通气参数一小时，随后根据肺泡募集情况将 CPAP 降至 8–10 cm H2O，并将 EIP 增加至 -12 至 -13 cm H2O。
- 将峰压设置为 20–21 cm H2O。
注意：若在肺切除术时需要更高的压力，则该压力即为设定的目标峰压。 - 当灌注液温度达到 35 °C 时，将流量增加至心输出量的 30%。
注意：这些为器官保存阶段的设置（表 2）。 - 在保存阶段的第 3、5、7、9、11 小时，以心输出量 50% 的流量进行评估，并向去氧器中加入混合扫气（89% N2、8% CO2、3% O2），流速为 0.125 L/min，以模拟全身氧消耗（表 3）。
- 在保存模式下的每个奇数小时，抽取 10 mL 灌注液样本用于后续分析。每小时抽取 1 mL 的去氧器前动脉血气样本。
- 评估模式运行 5 分钟后，从去氧器前后端口采集动脉血气（ABG）（表 4）。
注意：至此已完成肺在 ESLP 上的安置以及灌注与通气的启动。启动方案详见表 2。表 3详细列出了所采用的两种 NPV-ESLP 模式。
9. 肺的代谢支持
- 通过动脉血气分析每小时检测一次灌注液的葡萄糖水平。目标葡萄糖浓度为 3–6 mmol/L，根据消耗速率使用标准输液泵持续输注葡萄糖，并在需要时给予推注剂量进行滴定调节。
注意：另一台输液泵以 2 U/h 的速度持续输注胰岛素。CHIP 以及其他大多数器官灌注液一样，含有葡萄糖作为主要能量底物。
10. 肝素、抗微生物和抗炎剂
- 在灌注开始时、加入pRBC之前，向灌注液中加入10,000单位肝素。
- 在灌注开始时、加入pRBC之前，向灌注液中加入3.375 g哌拉西林-他唑巴坦。
- 在灌注开始时、加入pRBC之前，向灌注液中加入500 mg甲基泼尼松龙。
11. 肺功能评估
- 在ESLP运行期间采用两种不同的通气和灌注模式：保存模式与评估模式。
注意：请参阅保存与评估（表3）。保存模式：心输出量30%，PEEP 8-12，EEP 0，EIP -10至-12，峰压20-22 cm H₂O2O，RR 6-10，吸呼比（I:E）1:1-1.5。ESLP 运行通常持续 12 小时，但可延长至 24 小时。 - 将峰压调整至与肺叶切除术的峰压一致，并达到10 mL/kg的目标潮气量。
注意：尽管目标是达到10 mL/kg的潮气量，但通常仅能达到6–8 mL/kg。 - 保存期间每30分钟进行一次肺复张，每次持续30分钟或更短时间。
注意：招募的持续时间和程度取决于达到的呼气末潮气量（TVe）。如果TVe为8-10 mL/kg，则无需进一步进行招募。 - 为促进肺复张，将呼气末正压（PEEP）增加至10–12 cm H₂O2O，将呼吸频率降至6次/分钟，将峰压提高2–4 cm H₂O20，不超过30 cm H₂O2O（我们很少超过25 cm H2O），并将吸呼比调整为1:0.5。
注意：通常每个30分钟间隔仅进行一项或两项上述调整，其中增加呼气末正压（PEEP）和峰压的效果最为显著。 - 在3、5、7、9、11小时评估器官功能。
注意：主要关注的参数是PF比值；然而，也会密切监测动态顺应性和肺动脉压图6). - 评估期间，将心输出量增加至50%，同时使用混合扫气（89% N2，8% CO₂2，3% O₂2以 0.125 L/min 的流速向回路中加入 通过 脱氧器
注意：此操作可复制全身性缺氧状态，持续时间为5分钟。在此期间，将呼气末正压（PEEP）降至5 cm H₂O。2在维持峰压的同时，相应增加呼气末压（EIP）。将呼吸频率（RR）保持在10次/分钟，并根据肺部是否存在气体陷闭现象，将吸气与呼气时间比（I:E）设定为1或1.5。 - 进行肺血管阻力、每分通气量、动态顺应性和P/F比值的功能计算。
注意：肺血管阻力可通过以下公式计算：[(PAP - LAP)/CO] × 80，其中由于采用开放式左心房引流系统设计，左心房压（LAP）为 0 mmHg。
每分通气量的计算公式为：TVexpiratory × RR
动态顺应性通过以下公式计算：TVexpiratory/EIP
P/F 比值通过以下公式计算：PaO₂/FiO₂，其中 FiO₂ 为 21%。
ESLP 软件可自动连续计算并记录通气和功能指数。
12. 代谢评估的 离体 灌注肺
- 每小时评估一次灌注液的代谢状态 通过 动脉血气（ABGs），可作为肺部状态的替代指标。从脱氧器前取样口收集10 mL灌注液，以备后续分析。
注意：血气分析还可用于监测灌注液的气体和离子状态。 - 使用PaO2作为肺部整体功能的指标。
注意：在评估阶段，向回路中添加混合扫气以模拟全身性脱氧时，此点尤为关键。通过比较脱氧器前与脱氧器后的气体，可评估肺部的氧合提升效果。 - 靶向正常pH值（7.35–7.45），通过静脉推注三羟甲基氨基甲烷（THAM）缓冲液纠正酸中毒（见 材料表).
注意：碱中毒通常无需纠正，且 pH 值一般不超过 7.55。CO2 若碱中毒超过此阈值，可向电路中添加校正措施以恢复正常。 - 处理 PaCO₂2 允许范围通常为10–20 mmHg。
注意：这些数值被解读为通气状况良好的指征。在体外脊髓灌注（ESLP）期间不调整电解质，但会作为标准动脉血气（ABG）分析的一部分进行监测。随着ESLP持续时间的延长，乳酸和钾离子水平均会上升。钠离子水平保持稳定（135–145 mmol/L），钙离子水平通常偏低。 表4 包含在常温及30%心输出量条件下，使用细胞灌注液（血液 + CHIP）进行12小时NPV-ESLP运行期间ABG灌注液分析的代表性样本结果。
13. 终止灌注、通气及将肺脏与ESLP设备断开
- 在设置页面，点击关闭服务器。
- 打开腔室盖子。将PA适配器从PA套管中分离。
- 拔除气管插管。为评估水肿形成量，称量肺组织重量。
- 取副叶约1 cm3的组织活检样本，并如前所述将其分为三份。
- 进行最终气体分析，离心灌注液样本，并按此前所述方法（步骤4.4）保存组织活检样本。
注意：离心条件为：转速112 × g；加速度9；减速度9；温度4 °C，离心时间15分钟。 - 关闭程序；所有记录的数据将被自动保存。
- 根据所在机构的规定，妥善处理剩余的组织、血液及生物活性材料。
- 使用表面消毒清洁剂（例如70%乙醇）清洁ESLP推车，并将所有可重复使用的组件置于-20 °C冰箱中，以抑制细菌生长。
结果
在肺灌注和通气初期（保存模式），随着灌注液逐渐升温至正常体温，肺动脉压力通常较低（< 10 mmHg），动态顺应性也较低（< 10 mL/mmHg）。体重为35–50 kg的约克夏猪，其肺脏重量通常为350–500 g。在NPV-ESLP的最初1小时内，测得的呼气潮气量（TVe）为0–2 mL/kg，吸气潮气量（TVi）为100–200 mL。TVe通常在3–6小时内达到4–6 mL/kg，并可能继续增加，但最终自然稳定在6–8 mL/kg范围内。TVi始终比TVe高出100–200 mL。同样，动态顺应性在最初1小时内为0–10 mL/mmHg，有时可能更高；在3–6小时期间，动态顺应性为10–20 mL/mmHg，并与TVe一同趋于稳定，这两个参数相互关联。随着肺动脉血流逐渐增加至心输出量的10%–30%，肺动脉压力（PAP）将逐步升高。在最初1小时内，PAP通常为10±2 mmHg，并在12小时运行期间轻微上升，最终达到12±2 mmHg的范围。在以心输出量50%的血流进行评估时，PAP可能显著升高，达到15–20 mmHg。肺血管阻力（PVR）在整个ESLP过程中将逐渐上升。图6展示了在12小时灌注和通气过程中PAP、动态顺应性和PVR的变化趋势。所有这些参数均可能受到所采用的具体ESLP实验方案的影响。
在 ESLP 的评估阶段（在 12 小时运行期间的 3、5、7、9、11 小时进行），LA PaO 呈上升趋势2 被观察到（表 4）。评估模式持续5分钟，包括将呼气末正压（PEEP）降至5 cm H₂O。2O的同时通过增加EIP进行补偿以维持峰值压力。将血流量增加至心输出量的50%，并加入混合气体作为吹扫气 通过 以0.125 L/min的流速通过脱氧装置模拟全身氧耗。通常，PaO₂2 来自肺动脉的血压范围为 50-60 mmHg，以及左房 PaO2 可介于 60–120 mmHg 之间，具体取决于肺脏对保存和再灌注处理的响应情况。PaO₂ 的绝对上升值2 肺去氧前后的氧合能力差值是评估肺部氧合功能乃至肺功能的更佳指标；然而，按照惯例，PF比值仍是预测移植成功与否的常用参数。PF比值是指肺去氧前（LA）的动脉血氧分压（PaO2/FiO2 并且应当 > 300，这是人类移植的临界值。FiO₂2 为21%（室内空气）；因此，最低肺泡氧分压（LA PaO₂）2 ESLP期间所需的压力为63 mmHg。 图6 展示了NPV-ESLP过程中在5小时和11小时评估时间点PF比值的典型变化趋势。
两种ESLP模式均可从多种代谢评估中获益，包括频繁的血气分析、重复采集灌注液成分样本以及组织活检。灌注液可作为反映肺整体状态的替代指标；因此，对灌注液进行血气分析可提供关于肺代谢状态的大量信息。表 4每次评估前，取10 mL灌流液样品，离心后进行分析 通过 用于检测多种炎症生物标志物的ELISA，包括TNF-α、IL-6和IL-8。这些指标可反映肺部的炎症状态以及实验干预措施的影响；然而，需结合ESLP为无灌注液更换/交换的封闭回路这一背景进行解读。因此，这些生物标志物的水平无法获得肝脏或肾脏等天然代谢器官和生理清除机制的支持作用。正因如此，在ESLP过程中，这些标志物随时间呈现持续上升趋势。组织活检同样有助于生物标志物的标记与可视化，以及对组织完整性的组织学评估。水肿形成是与内皮通透性相关的另一重要炎症指标。 图6 在NPV-ESLP进行12小时结束时，表现出典型的体重增加30%。最近， 体外 NPV-ESLP上肺功能评估已通过确证性检测得到补充 体内 将左肺移植到35-50公斤的约克夏猪体内。 体内 移植肺评估在安乐死前持续进行4小时 通过 放血处死。所采用的移植方案为 体内 使用该定制 NPV-ESLP 设备进行评估的详情可参见本参考文献19.
P:F 比值是评估离体肺灌注（ESLP）及人类肺移植功能的主要指标。该无通气离体肺灌注（NPV-ESLP）技术已在临床试验中成功应用，受者术后30天和1年生存率均为100%17。12例扩展标准供体肺在ESLP系统上成功完成了保存与修复，并顺利实施了移植。术后未发生3级原发性移植物功能衰竭（PGD），且无早期死亡病例。长期随访仍在进行中。尽管P:F比值是肺移植和ESLP的金标准功能评估参数，NPV-ESLP还可同步测量肺动脉压（PAP）、肺血管阻力、肺水肿形成及肺顺应性等额外功能指标，以辅助指导肺器官的保存与修复过程。NPV-ESLP可对供体肺提供全面的代谢与功能评估。该技术在扩展标准供体肺的应用中已证实具有明确的临床益处。相关软件设计简洁，所需人工调节极少，且操作者间与操作者内变异度均极低。
图1：NPV-ESLP方案。 肺获取及12小时NPV-ESLP运行的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：悬置于硬壳式 ESLP 储液器中的肺用硅胶支撑膜。 图中所示为带有气管插管（中央）和肺动脉插管（左侧）的支撑膜。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：NPV-ESLP 灌注回路。（A）灌注回路的示意图及对应的图例（左）。（B）NPV-ESLP 灌注回路的照片（右）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：NPV-ESLP 软件程序的截图。（A）“主界面”屏幕。（B）“流量环路”屏幕。（C）“设置”屏幕。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：肺连接至 NPV-ESLP 回路。 （A）ESLP 前的供体肺前视图。（B）ESLP 后的供体肺后视图。（C, D）右肺中叶组织活检。（E）肺连接至 ESLP 回路。（F）肺在硅胶支撑物上的位置示意图。（G）ESLP 装置前视图，显示起始液位及肺的位置。（H）肺连接至装置，显示左心房引流开放。（I, J, K）装置腔室的盖子已固定。（L）装置与肺已完全连接，并处于 NPV 模式下运行。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 6：NPV-ESLP 12 小时评估期间的功能参数。（A）P:F 比值，即 PaO2:FiO2 比值。（B）顺应性。（C）PAP，肺动脉压。（D）PVR，肺血管阻力。（E）体重增加。请点击此处查看该图的高清版本。
表1：记录的监测图表参数。 请点击此处下载该文件。
表2：12小时负压通气-离体肺灌注（NPV-ESLP）方案的启动。 CO，心输出量；PA，肺动脉；PPV，正压通气；NPV，负压通气。关于保存模式下的通气参数，请参见表3。自T3时间点开始，每2小时连续进行一次评估，每次持续5分钟，期间将肺动脉血流设定为心输出量的50%，医用气体成分为89% N2、8% CO2、3% O2，保存参数依据表3中提供的参数设置。请点击此处下载该文件。
表3：NPV-ESLP的模式：保护与评估。 CO，心输出量；FiO2，吸入氧浓度；LAP，左心房压；NPV，负压通气；PAP，平均肺动脉压；PAWP，气道峰压；PEEP，呼气末正压；PCO2，肺动脉循环中二氧化碳的分压。请点击此处下载此文件。
表4：ESLP期间12小时内的血气分析。 Ca+，钙离子；Cl-，氯离子；Hb，血红蛋白；HCO3-，碳酸氢根离子；K+，钾离子；Na+，钠离子；Osm，渗透压；paCO2，动脉血二氧化碳分压；paO2，动脉血氧分压；sO2，氧饱和度；P/F比值，PaO2/FiO2比值。请点击此处下载该文件。
讨论
成功的ESLP实验运行需要若干关键的手术步骤以及相应的故障排除措施。与成人人类肺脏相比，幼猪肺脏极为脆弱，因此在处理猪肺时，获取器官的外科医生必须格外谨慎。必须尽力尝试 "非接触式" 避免在分离肺组织时造成创伤和肺不张的技术。 "非接触式" 意味着在获取肺脏过程中尽量减少对肺部的手动操作。在手术期间使用呼吸机时，肺复张操作在猪肺中的效果远不如在人肺中有效。与常用于人肺的操作不同，手动重新定向肺泡内的气流会对幼龄猪肺造成不可逆的损伤，因此不建议进行此类操作。在夹闭气管时，应使潮气量与诱导潮气量相匹配，这对于提高NPV-ESLP成功运行的概率至关重要。在获取过程中任何顺应性的丧失，在猪肺的NPV-ESLP过程中都难以恢复；相比之下，使用NPV-ESLP的人肺在此方面更具耐受性。理想情况下，应在无需增加峰值压力的情况下于诱导潮气量水平夹闭肺脏；然而，温暖缺血开始后不久顺应性即开始下降，有时需要更高的压力以维持肺泡复张。在心脏切除术后，切换至吸呼比（I:E）为2:1有助于维持甚至轻微增加肺泡复张，尤其是在启动肺切除术前使呼出潮气量（TVe）保持在10 ml/kg以上。在分离后侧胸膜与食管的附着时，切勿像在人肺获取中常见的那样将肺向内翻转。后侧胸膜附着必须采用盲法进行钝性分离，在用手自由操作逐步分离组织的同时，从已夹闭的气管处向上提起以提供反向牵引力。若在夹闭气管时幼龄猪肺已显著丧失顺应性，则其在ESLP过程中将难以恢复。若在NPV-ESLP初始阶段肺脏动态顺应性为0，并且在运行第一小时内软件监测未显示任何动态顺应性改善，则这些肺脏恢复功能的可能性极低。这几乎可以确定是外科移植技术存在问题。若获取的肺动脉（PA）长度不足，可利用降主动脉延长肺动脉 通过 端-端吻合术
在操作 NPV-ESLP 装置以实现成功灌注的过程中，需要执行若干关键步骤并采取相应的故障排除方法。获取供体肺、将其安装到 NPV-ESLP 装置上以及启动灌注/通气的整个过程不应超过 20–30 分钟。缺血时间过长会降低成功运行的可能性。肺脏必须放置在硅胶支撑膜上，确保肺动脉插管和气管导管在通气过程中不会妨碍上叶的运动。必须利用硅胶支撑膜将肺脏抬离硬壳腔室；但抬升高度不宜过高，否则左心房血液开放引流时可能因下落冲击硬壳储液器而导致溶血。任何肺实质撕裂均需被识别，并使用 6-0 Prolene 缝线缝合，以防漏气。可利用残留的胸膜或心包组织进行补片修复。同样，被血液浸透的纱布也可用于堵塞无法手术修复的裂口。相比修复肺实质损伤，更应避免造成损伤，因为缝合肺组织时极易造成进一步损害。启动通气时必须保持肺脏处于充气状态，因此在松开气管或通气管路夹子之前，必须先将持续气道正压（CPAP）设置为 20 cm H2O。若肺脏塌陷，则后续通气将变得困难。在 NPV-ESLP 过程中，通气前若丧失肺泡复张，将难以恢复，导致恢复速度变慢。启动灌注时，必须正确归零压力传感器。应缓慢移除肺动脉夹，以避免因压力和流量过高而导致肺循环过度。主肺动脉的位置不得扭曲 ，否则将导致压力读数虚假升高。肺动脉转接头也不得抵住肺动脉分叉处，原因相同。上述两种情况均可能干扰肺组织的灌注。通气最初一小时内必须维持呼气末正压（PEEP）高于 12，除评估需要外，PEEP 不得低于 8，而在评估时理想的 PEEP 为 5。峰压应与获取时所用值保持一致，因其可反映肺顺应性的状态。例如，若获取时需 25 cm H2O 的峰压才能达到 10 mL/kg 的潮气量（TVe），则在机器运行期间，若峰压低于 25 cm H2O，将难以维持同等程度的肺泡复张。
该方法存在一些值得考虑的局限性。如前所述，ESLP 文献中的惯例是在计算 P:F 比值时仅报告 PaO28,9,10,11,15,17,18；然而，PA 的 PaO2 具有信息价值，因为它能够阐明由于肺部氧合而产生的氧含量升高情况。这一指标比单独使用 P:F 比值更具描述性。当扫气气体未运行时，机器实质上起到一个大的分流作用，使血液在肺中反复循环以进行多次氧合。因此，在这种情况下，保存模式下的动脉血气（ABG）对于评估肺部氧合能力并不特别有意义，但对于代谢状况的分析却非常有价值。这正是为何在评估过程中使用混合气体扫气至关重要，以及为何必须证实去氧器后灌注液发生去氧化的原因。另一个局限性在于，准确评估 ESLP 后肺功能需要依赖in vivo模型。in vivo移植手术相比器官获取操作更具挑战性，存在多种可能的并发症，可能导致移植肺的丢失。因此，无论是 ESLP 还是后续的移植手术，都是资源消耗较大的操作，且具有较高的学习难度。
与目前可用的模型相比，这种NPV-ESLP技术具有多项优势。将NPV-ESLP与PPV-ESLP进行比较的临床前研究显示，NPV是一种更优越的ESLP通气方式15。这很可能是因为NPV是一种更符合生理机制的ESLP方法。NPV通过在胸腔内产生负压环境，使力量均匀分布于胸膜表面，从而诱导肺扩张。而PPV则通过较高的气道压力强行打开肺部，因此更容易造成更大的气压伤。这种NPV-ESLP设备的另一项重要优势在于其完全便携的设计。便携性使得该设备可随移植团队前往供体获取中心，从而几乎完全消除热缺血时间。缺血时间与肺缺血再灌注损伤（LIRI）的程度以及随后发生的原发性移植物功能障碍（PGD）直接相关，而PGD是肺移植术后死亡和并发症的主要原因。因此，任何减少缺血的努力都应转化为更好的移植后预后。缩短缺血时间还使得可以从更远的地理区域获取肺脏，因为运输时间对LIRI和PGD发生的影响将减小，从而提高原本可能被废弃的供体器官的可用性。
该设备及其所述方法具有重要的临床和科研应用价值。如前所述，该设备的原型已成功用于一项针对扩展标准供体肺移植的临床试验，术后30天和1年生存率均达到100%，且无任何原发性移植物失功（PGD）3级事件发生17。下一步将开展多中心临床试验，以推动该设备向商业化发展。在科研应用方面，已有临床前证据表明，负压通气式离体肺灌注（NPV-ESLP）优于正压通气式离体肺灌注（PPV-ESLP）15。NPV-ESLP有望成为该技术领域的典范设备，进一步推动基于该技术的深入研究。在实验室环境中应用ESLP技术，具有可连续监测器官功能、在引入新型治疗手段时获得即时反馈、将肺脏从其他器官系统中分离以独立测试治疗效果，以及为以往缺乏有效给药途径的供体 肺提供治疗递送平台等优势。从这一角度来看，其在肺移植转化研究中的应用价值无可比拟。该特定设备配备自动化ESLP软件程序，操作简便，功能参数的个体间和个体内变异极小，且设计上几乎无需手动调节。
披露
DHF 持有以下专利 离体 器官灌注技术与方法。DHF 和 JN 是 Tevosol 公司的创始人及主要股东。
致谢
本研究由医院研究基金会代表资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0 号 ETHIBOND 绿色 1 x 36" 内科环线 0 | ETHICON | D8573 | |
| 2-0 丝线 黑色 12" x 18" 股线 | ETHICON | SA77G | |
| ABL 800 FLEX 血气分析仪 | Radiometer | 989-963 | |
| 成人-儿童静电过滤 HME - 小号 | Covidien | 352/5877 | |
| 动脉过滤器 | SORIN GROUP | 01706/03 | |
| Backhaus 毛巾钳 | Pilling | 454300 | |
| Biomedicus 泵 | Maquet | BPX-80 | |
| 扎带 – 白色 12” | HUASU International | HS4830001 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | C69-500G | |
| Cooley 胸骨牵开器 | Pilling | 341162 | |
| CUSHING Gutsch 换药钳 | Pilling | 466200 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767-500G | |
| 深部 Deaver 牵开器 | Pilling | 481826 | |
| Debakey 直血管组织钳 | Pilling | 351808 | |
| Debakey-Metzenbaum 解剖剪 | Pilling | 342202 | |
| 剪刀 | Pilling | 342202 | |
| 气管插管 9.0 mm CUFD | Mallinckrodt | 9590E | 为 ESLP 装置移除气囊 |
| 流量换能器 | BIO-PROBE | TX 40 | |
| 人血清白蛋白 | Grifols Therapeutics | 2223708 | |
| 输液泵 | Baxter | AS50 | |
| Inspire 7 M 中空纤维膜氧合器 | SORIN GROUP | K190690 | |
| Intercept 管路 1/4" x 1/16" x 8' | Medtronic | 3108 | |
| Intercept 管路 3/8" x 3/32" x 6' | Medtronic | 3506 | |
| Intercept 管路连接头 3/8" x 1/2" | Medtronic | 6013 | |
| MAYO 解剖剪 | Pilling | 460420 | |
| 医用二氧化碳气瓶 | Praxair | 5823115 | |
| 医用氮气瓶 | Praxair | NI M-K | |
| 医用氧气瓶 | Praxair | 2014408 | |
| 器官浴槽 | Tevosol | ||
| PlasmaLyte A | Baxter | TB2544 | |
| Poole 吸引管 | Pilling | 162212 | |
| 磷酸钾 | Fischer Scientific | P285-500G | |
| 电子秤 | TANITA | KD4063611 | |
| 硅胶支撑膜 | Tevosol | ||
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 792519-1KG | |
| 0.9% 氯化钠 | Baxter | JB1324 | |
| Sorin XTRA 血液回收机 | SORIN GROUP | 75221 | |
| 胸骨锯 | Stryker | 6207 | |
| 外科电凝设备 | Kls Martin | ME411 | |
| 温度传感器探头 | Omniacell Tertia Srl | 1777288F | |
| THAM 缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 15504020 | 由 UltraPureTM Tris 配制 |
| TruWave 压力换能器 | Edwards | VSYPX272 | |
| 双腔中心静脉导管 7fr | Arrowg+ard | CS-12702-E | |
| Vorse 管夹 | Pilling | 351377 | |
| Willauer-Deaver 牵开器 | Pilling | 341720 | |
| Yankauer 吸引管 | Pilling | 162300 |
参考文献
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