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一种用于嗅觉环路组装延时成像研究的组织块培养系统 果蝇

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DOI：

10.3791/62983

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2021年10月13日

 , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, Department of Biology, Stanford University

本文内容

摘要

本方案描述了用于研究嗅觉环路组装的触角-脑离体系统的解剖步骤、培养条件以及活体成像方法。

摘要

神经元以精确的方式相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的神经回路。Drosophila 嗅觉系统是研究这一过程的优良模型，因为来自触角和下颚须的50种嗅觉感受神经元（ORNs）会将其轴突投射到触角叶中50个可识别的肾小球，并与50种二级投射神经元（PNs）的树突形成突触连接。以往的研究主要集中在利用固定组织鉴定调控嗅觉回路精确投射的关键分子。本文描述了一种触角-脑离体培养系统，可在体外重现嗅觉回路组装的关键发育阶段。通过解剖外部角质层并清除覆盖在发育中蛹脑上的不透明脂肪体，可利用双光子显微镜从活体脑组织中获取高质量的单个神经元图像。该方法实现了对活体组织中单个ORN轴突靶向过程的延时成像。这一技术将有助于揭示先前鉴定的重要基因在细胞生物学层面的关键作用和功能，并阐明神经回路动态组装过程背后的机制。

引言

神经元以精确的方式相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的神经环路。一百多年来，神经科学家一直致力于理解神经突如何以极高的精确度向中间和最终靶点延伸。由此，他们鉴定出了一些重要的基因，这些基因编码指导发育中神经元突起生长的导向信号分子1。Drosophila 嗅觉系统是研究这一过程的理想模型，因为嗅觉受体神经元（ORNs，即初级感觉神经元）会投射到50个可识别的肾小球，这些肾小球具有典型且一致的大小、形状和相对位置，并在其中与50种二级投射神经元（PNs）的树突形成突触连接，而每种PN仅将其树突投射至一个特定的肾小球2（图1A）。因此，在果蝇嗅觉系统中，相对容易在突触（肾小球）水平上识别突变体的表型。这促使研究人员发现了多个调控嗅觉环路组装的重要基因3。

果蝇嗅觉环路的组装依赖于在时间和空间上协调的发育过程3。嗅觉受体神经元（ORNs）和投射神经元（PNs）获得不同的细胞命运，从而确立了它们连接特异性的程序。随后，PN树突预先构建成触角叶的模式（图1B）。接着，ORN的轴突环绕同侧触角叶，并穿过脑中线到达对侧触角叶。随后，ORN轴突侵入同侧和对侧触角叶，并在特定的小球结构中与对应PN的树突形成突触连接。这一关于嗅觉环路组装的粗略模型是基于发育过程中多个中间时间点的固定样本分析所提出的。然而，固定组织样本的时间分辨率较低，且无法连续追踪同一神经元结构在整个发育过程中的动态变化，这限制了对环路组装机制的深入理解。

对嗅觉受体神经元和投射神经元的轴突进行活体成像在技术上具有挑战性 体内 由于神经连接过程发生在蛹期的前半阶段，此时触角叶被蛹壳内不透明的脂肪体所包围，因此无法直接对完整蛹体内的发育中嗅觉神经环路进行成像。对解剖后组织进行培养 离体 可克服组织不透明性，并已成功用于研究神经发育4,5,6使用类似方法的挑战 离体 在蛹期大脑神经元连接研究中，外植体培养策略能否在培养条件下重现精确的神经元投射，是需要验证的关键问题。根据先前报道的 离体 果蝇眼脑复合体的培养条件7一种包含完整蛹脑、触角及相连的触角神经的外植体 recently developed，该外植体可保持嗅觉环路的精确投射，并可用于基于双光子显微镜的活体成像，成像时间可达24小时，成像频率为每20分钟一次8在此详细描述了外植体培养与成像的实验方案。该外植体系统为研究嗅觉环路以及中枢脑内其他潜在环路的组装提供了强有力的方法。

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方案

1. 试剂的准备

注意：除非另有说明，本方案中的所有步骤均在室温（20–25 °C）下进行。

  1. 为准备用于延时成像过程中固定外植体的培养皿，将0.5 cm厚的Sylgard（使用前按10:1比例充分混合两种液体组分）铺于60 mm × 15 mm的培养皿底部表面，并在室温下静置固化48 h图2A，下文中简称为Sylgard板）。
  2. 为准备用于在此培养板上固定外植体的微型针，使用一对镊子将多根微型针粘贴在胶带上，使针尖朝向同一侧对齐图2B）。使用剪刀将微针的尖端剪去约 2 mm图2B'）。使用镊子夹住切割好的微型针，并插入预先制备的Sylgard板的Sylgard层中（图2C使用两根微针固定一个外植体。
  3. 使用毛刷收集白色蛹，这些蛹在1小时内形成蛹壳。 hsFLP，pebbled-GAL4/+；UAS-FRT100-stop-FRT100-mCD8-GFP8 基因型并转移至新的离心管中。在37 °C水浴中热激40分钟，以诱导产生稀疏的随机类型嗅觉受体神经元克隆。热激后，将离心管置于25 °C环境中培养30小时，获得蛹化后30小时（APF）的蛹。
  4. 为外植体培养基的制备，向500 mL Schneider's培养基中加入5 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）。 黑腹果蝇 培养基。将培养基过滤后，分装至50 mL锥形管中，每管45 mL。培养基可在4 °C保存1-2个月。
  5. 成像当天，取一支含有45 mL Schneider's培养基的试管 果蝇 培养基中加入5 mL胎牛血清（终浓度10% v/v）、125 µL 4 mg/mL人胰岛素储备液（终浓度10 µg/mL）和50 µL溶于乙醇的1 mg/mL 20-羟基蜕皮酮储备液（终浓度1 µg/mL）。充分混匀后，将15 mL完全培养基转移至新的50 mL锥形管中。剩余的完全培养基可在4 °C保存一周。胎牛血清、人胰岛素储备液和20-羟基蜕皮酮储备液应分装后于-20 °C保存。
  6. 从氧气瓶中通过无菌5 mL移液枪头在液面下以每秒一个气泡的速度通入氧气，对15 mL完全培养基氧合20–30分钟。此过程中用石蜡膜封住管口。
  7. 用70%乙醇对解剖皿表面及Sylgard板（已在步骤A1和A2中于Sylgard层上插入微电极针）进行消毒，待其干燥后再使用。

2. 组织块解剖

  1. 使用毛刷将30小时龄的蛹（puparium形成后30小时）转移至纸巾上，并将蛹的外表晾干5分钟。
  2. 在载玻片上贴一小段双面胶。小心地将干燥的蛹背面向上贴附在双面胶的粘性表面。用毛刷轻轻按压蛹体，使其腹面牢固贴附于胶带表面（图3A）。注意不要损伤蛹体。
  3. 使用镊子去除覆盖在头部背侧的棕色蛹壳（图3A，B）。从蛹壳侧面将镊子的一个尖端插入棕色蛹壳与蛹体之间，沿一条线小心地向蛹体后端撬开蛹壳（图3B，C）。打开棕色蛹壳后，用镊子轻轻夹住蛹体，将其转移至含有1 mL充氧完全培养基的解剖孔中。若蛹体漂浮于培养基表面，可轻轻将其压入液面下，促使其沉降至孔底（图3D）。
    注意：镊子尖端不可插入棕色蛹壳过深，以免损伤蛹体。
  4. 为从蛹体中解剖出触角-脑组织外植体，一手用镊子轻轻夹持蛹体，另一手使用显微剪从蛹体后侧剪开一个小孔（图3E）。此小孔可释放蛹体内部的高压。
  5. 从该小孔开始，沿蛹体腹侧中线用显微剪剪开至颈部（连接头部与胸部的狭窄结构）（图3F）。随后，环绕颈部剪断一圈，使头部与蛹体分离（图3G）。将分离的躯体移除并置于另一解剖孔中。
    注意：避免直接从蛹体背侧或腹侧剪断颈部，以免挤压脑组织。
  6. 剪开覆盖在脑组织背侧的透明角质层（图3H），以暴露脑上方的脂肪体。保留部分角质层，以便视网膜和触角附着。对脑组织腹侧重复相同操作。
    注意：剪刀刀片不可在角质层下插入过深，以免切断连接触角与脑的触角神经（图3H'）。
  7. 使用P10移液器，将培养基轻轻吹向头部背侧和腹侧的开口区域，以温和冲洗覆盖在脑和触角上的脂肪体（图3I）。
    注意：吹加培养基时动作务必轻柔，以防脑组织从角质层脱落。确保在此步骤中彻底清除所有脂肪体。若脂肪体未充分清除，可能导致嗅觉受体神经元（ORN）轴突发育停滞，可能与培养基供氧不足有关。
  8. 若需研究双侧ORN轴突之间的相互作用或ORN轴突对投射神经元（PN）树突靶向的影响，可在本阶段使用显微剪切断一条或两条触角神经8（图3J）。小心将剪刀刀片置于角质层与脑组织之间，切断目标触角神经。
  9. 为将解剖所得外植体转移至Sylgard包被的培养板，先在Sylgard表面滴加一滴充氧完全培养基（约200 µL）。取一个200 µL宽口移液枪头，通过反复吸取步骤1.6中获得的脂肪体，使其内壁涂覆一层脂肪体，此举可防止外植体在转移过程中粘附于枪头。随后，使用该宽口枪头将外植体从解剖孔转移至培养板上的培养基液滴中（图3K）。
  10. 使用镊子将外植体固定在Sylgard层的两个视叶位置（图3L）。小心将Sylgard培养板放置于成像平台上，并用胶带固定。使用P1000移液器缓慢向Sylgard培养板中加入10 mL充氧完全培养基。
    ​注意：添加培养基时应避免扰动外植体。

3. 基于双光子显微镜的活体成像

  1. 进行延时成像时，使用双光子显微镜、钛宝石激光器、20倍水浸物镜（1.0 数值孔径）以及成像软件。使用920 nm的激发波长对GFP蛋白进行成像。将像素驻留时间调整为10 µs。
  2. 调整成像台位置，使外植体大致位于物镜下方。成像前用70%乙醇对物镜进行消毒。缓慢将物镜降至培养基液面下并靠近外植体。检查物镜表面是否有气泡。
    1. 如有气泡，将物镜抬升至液面以上，并重复操作直至气泡消失。通过目镜找到外植体，并将其中一个外植体置于视野中央。
  3. 为确保用于延时成像的外植体中仅有少量嗅觉感觉神经元（ORN）被稀疏标记，每次解剖约10个外植体，并将其沿培养板的y轴方向排列。沿y轴移动物镜逐一筛查所有外植体，选择一个仅有少数单个ORN轴突刚刚到达触角叶的外植体进行成像（图4A）。
    1. 通过其椭圆形结构以及开始环绕该结构的ORN轴突来识别触角叶。在xy平面成像约150 µm × 150 µm的区域（使用20倍物镜进行3倍放大）。估算两个触角叶的边界，并将其置于成像区域中央。
  4. 通过定义扫描的底部和顶部范围，在z轴上选定初始成像区域。设置z轴方向的成像范围。将含有ORN轴突信号的最深层设为首次成像层面，将上方100 µm处（更表层）设为最终成像层面（图4B）。
    注意：此设置可在ORN轴突上方保留部分区域（表层），避免因脑组织在培养过程中生长而导致ORN轴突向上移位超出成像范围。
    1. 以2 µm的间隔进行成像。使用成像软件设置每20分钟自动扫描一次的成像程序。
  5. 在首次成像4小时后，将成像区域沿z轴向上移动20 µm；在16小时成像后，再次沿z轴向上移动20 µm。可通过在成像软件中设置脚本和不同的z层堆栈实现该操作。
  6. 成像结束后继续培养外植体一段时间（最多24 h ex vivo），然后进行固定，并用神经毡标记物N-钙黏蛋白进行染色，以通过每个单个ORN所投射的目标小球来确定其遗传身份。

4. 图像处理

  1. 使用 Fiji 软件处理每个时间点采集的连续切片 z 轴堆栈图像时，打开图像切片序列，点击 图像 | 堆栈 | Z 轴投影 [/]。
  2. 为校正培养过程中样品的横向漂移，请在 Fiji 中安装 TurboReg 插件。
    1. 打开一个 z 轴堆栈图像序列以及该序列中的单个 z 轴堆栈图像，然后打开 插件 | 配准 | TurboReg。
    2. 在 源 中选择 z 轴堆栈图像序列，在 目标 | 平移 中选择单个 z 轴堆栈图像，点击 批处理 按钮，以对打开的 z 轴堆栈图像序列中的所有图像进行配准。
  3. 为最大化利用成像样品，可在完成三维图像切片后，从 z 轴堆栈图像中分离出彼此邻近但稀疏标记的单根轴突。
    1. 若需从同一图像中的少数几根轴突中提取单根嗅觉神经元（ORN）轴突，请打开图像切片序列，点击 插件 | 分割 | 分割编辑器 [/]。在分割编辑器工作窗口中选择画笔工具，并使用 选择"+" 或 "-" 按钮，在每张图像切片上标记感兴趣的 ORN 轴突。
    2. 点击 处理 | 图像计算器 [/]。在 图像 1 中选择 "图像 X"，在 操作 中选择 "乘法"，在 图像 2, [/] 中选择 "图像 X. 标签"。此操作将生成仅包含感兴趣轴突的新图像序列文件。执行步骤 4.1 以处理该 z 轴堆栈图像。对所有时间点重复此步骤，以生成时间序列图像文件。
  4. 若需对同一图像中不同轴突进行伪彩着色，请首先执行步骤 4.3，分别生成每根轴突的时间序列图像文件。从同一原始数据图像中打开不同单根轴突的时间序列图像文件，点击 图像 | 颜色 | 合并通道。在不同颜色通道中选择不同的时间序列图像文件，然后点击 确定。

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结果

嗅觉受体神经元（ORN）的轴突在羽化后18小时至36小时之间到达触角叶。随后，它们在触角叶内导航，穿过中线，并支配各个小球结构。视频1为一段代表性视频，展示了多个可单独识别的轴突在整个过程中的动态变化，拍摄频率为每20分钟一次，持续24小时。在使用TurboReg进行图像配准之前，由于大脑发育，轴突表现出一定程度的横向漂移（视频前半部分）。经过配准后，漂移现象被校正（视频后半部分）。

为了从同一外植体中分离出少数几条嗅觉神经元（ORN）轴突，一个示例如图5所示。按照步骤4.3中的操作流程，将图5A所示外植体中的VA1d和VA1v轴突提取出来，生成仅包含这两条轴突的新z轴层叠图像（图5B）。类似地，也分别提取了VM2和VM3轴突（图5B'）以及DL2轴突（

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讨论

该 果蝇 触角-脑离体培养物中嗅觉环路的正常投射得以保留。我们确实注意到其发育速度慢了2倍。 离体 与……相比 体内值得注意的是，该外植体系统不保留上颌须，而上颌须含有六种类型的嗅觉感受神经元。为确保正常发育过程得以重现 离体，解剖分离神经节时需避免拉伸触角神经。在 离体 细菌培养过程中的生长通常会导致嗅觉环路发育停滞。因此，在成像前对培养皿和针具进行彻底灭菌，并保持成像室清洁与隔离，至关重要。

该外植体支持基于双光子显微镜的长时间延时成像。结合新开发的用于稀疏标记单个嗅觉受体神经元（ORN）的报告系统，该外植体系统可实现对单根轴突末端的高分辨率成像。该系统可用于研究嗅觉环路组装动态过程中所依赖的细胞生物学机制8。尽管本文以嗅觉环路发育为例进行展示，但该系统有望拓展应用于发育中的中枢脑部其他环路或其他发育过程的研究。

外植体在培养中可维持正常发育至少24小时，足以捕捉嗅觉受体神经元（ORN）...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 N. Özel 和 R. Hiesinger 在组织块培养方面的建议；M. Wagner 在双光子显微镜技术上的帮助；D.J. Luginbuhl 在转基因果蝇构建方面的贡献；D. Friedmann 对 Fiji 软件分析的建议；Y. Ge 在果蝇实验方面的协助；C. McLaughlin 和 K.K.L. Wong 对手稿的评论。L.L. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本研究由美国国立卫生研究院基金 1K99DC01883001（资助 T.L.）和 R01-DC005982（资助 L.L.）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20-羟基蜕皮酮SigmaH5142
变色龙钛宝石激光器CoherentCoherent MRU X1
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10082147
人胰岛素Thermo Fisher Scientific12585014
成像软件Prairie
显微剪刀World Precision Instruments501778
显微固定针Fine Science Tools26002-10
氧气瓶PraxairOX M-E
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
Schneider’s Drosophila MediumThermo Fisher Scientific21720024
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体Thermo Fisher ScientificNC0162601
双光子显微镜Bruker
水浸物镜（20X）Zeiss421452-9800-000

参考文献

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