本方案描述了用于研究嗅觉环路组装的触角-脑离体系统的解剖步骤、培养条件以及活体成像方法。
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本文内容
摘要
摘要
神经元以精确的方式相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的神经回路。Drosophila 嗅觉系统是研究这一过程的优良模型，因为来自触角和下颚须的50种嗅觉感受神经元（ORNs）会将其轴突投射到触角叶中50个可识别的肾小球，并与50种二级投射神经元（PNs）的树突形成突触连接。以往的研究主要集中在利用固定组织鉴定调控嗅觉回路精确投射的关键分子。本文描述了一种触角-脑离体培养系统，可在体外重现嗅觉回路组装的关键发育阶段。通过解剖外部角质层并清除覆盖在发育中蛹脑上的不透明脂肪体，可利用双光子显微镜从活体脑组织中获取高质量的单个神经元图像。该方法实现了对活体组织中单个ORN轴突靶向过程的延时成像。这一技术将有助于揭示先前鉴定的重要基因在细胞生物学层面的关键作用和功能，并阐明神经回路动态组装过程背后的机制。
引言
神经元以精确的方式相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的神经环路。一百多年来，神经科学家一直致力于理解神经突如何以极高的精确度向中间和最终靶点延伸。由此，他们鉴定出了一些重要的基因，这些基因编码指导发育中神经元突起生长的导向信号分子1。Drosophila 嗅觉系统是研究这一过程的理想模型，因为嗅觉受体神经元（ORNs，即初级感觉神经元）会投射到50个可识别的肾小球，这些肾小球具有典型且一致的大小、形状和相对位置，并在其中与50种二级投射神经元（PNs）的树突形成突触连接，而每种PN仅将其树突投射至一个特定的肾小球2（图1A）。因此，在果蝇嗅觉系统中，相对容易在突触（肾小球）水平上识别突变体的表型。这促使研究人员发现了多个调控嗅觉环路组装的重要基因3。
果蝇嗅觉环路的组装依赖于在时间和空间上协调的发育过程3。嗅觉受体神经元（ORNs）和投射神经元（PNs）获得不同的细胞命运，从而确立了它们连接特异性的程序。随后，PN树突预先构建成触角叶的模式（图1B）。接着，ORN的轴突环绕同侧触角叶，并穿过脑中线到达对侧触角叶。随后，ORN轴突侵入同侧和对侧触角叶，....
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方案
1. 试剂的准备
注意：除非另有说明，本方案中的所有步骤均在室温（20–25 °C）下进行。
- 为准备用于延时成像过程中固定外植体的培养皿，将0.5 cm厚的Sylgard（使用前按10:1比例充分混合两种液体组分）铺于60 mm × 15 mm的培养皿底部表面，并在室温下静置固化48 h图2A，下文中简称为Sylgard板）。
- 为准备用于在此培养板上固定外植体的微型针，使用一对镊子将多根微型针粘贴在胶带上，使针尖朝向同一侧对齐图2B）。使用剪刀将微针的尖端剪去约 2 mm图2B'）。使用镊子夹住切割好的微型针，并插入预先制备的Sylgard板的Sylgard层中（图2C使用两根微针固定一个外植体。
- 使用毛刷收集白色蛹，这些蛹在1小时内形成蛹壳。 hsFLP，pebbled-GAL4/+；UAS-FRT100-stop-FRT100-mCD8-GFP8 基因型并转移至新的离心管中。在37 °C水浴中热激4....
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结果
嗅觉受体神经元（ORN）的轴突在羽化后18小时至36小时之间到达触角叶。随后，这些轴突在触角叶内导航，穿过中线，并支配各个肾小球。视频1是一个代表性视频，展示了多个可单独识别的轴突在24小时内每20分钟拍摄一次的完整过程。在使用TurboReg进行图像配准之前，随着大脑的发育，轴突表现出一定程度的侧向漂移（视频的前半部分）。经过配准后，漂移现象被校正（视频的后半部分）。
为了从同一个外植体中分离出几根ORN轴突，一个示例如图5所示。按照步骤4.3中的操作流程，将图5A所示外植体中的VA1d和VA1v轴突提取出来，生成仅包含这两根轴突的新z轴层叠图像（图5B）。类似地，提取了VM2和VM3轴突（图5B'）以及DL2轴突（图5B
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讨论
该 果蝇 触角-脑离体培养物中嗅觉环路的正常投射得以保留。我们确实注意到其发育速度慢了2倍。 离体 与……相比 体内值得注意的是，该外植体系统不保留上颌须，而上颌须含有六种类型的嗅觉感受神经元。为确保正常发育过程得以重现 离体，解剖分离神经节时需避免拉伸触角神经。在 离体 细菌培养过程中的生长通常会导致嗅觉环路发育停滞。因此，在成像前对培养皿和针具进行彻底灭菌，并保持成像室清洁与隔离，至关重要。
该外植体支持基于双光子显微镜的长时间延时成像。结合新开发的用于稀疏标记单个嗅觉受体神经元（ORN）的报告系统，该外植体系统可实现对单根轴突末端的高分辨率成像。该系统可用于研究嗅觉环路组装动态过程中所依赖的细胞生物学机制8。尽管本文以嗅觉环路发育为例进行展示，但该系统有望拓展应用于发育中的中枢脑部其他环路或其他发育过程的研究。
外植体在培养中可维持正常发育至少24小时，足以捕捉嗅觉受体神经元（ORN）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 N. Özel 和 R. Hiesinger 在组织块培养方面的建议；M. Wagner 在双光子显微镜技术上的帮助；D.J. Luginbuhl 在转基因果蝇构建方面的贡献；D. Friedmann 对 Fiji 软件分析的建议；Y. Ge 在果蝇实验方面的协助；C. McLaughlin 和 K.K.L. Wong 对手稿的评论。L.L. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。本研究由美国国立卫生研究院基金 1K99DC01883001（资助 T.L.）和 R01-DC005982（资助 L.L.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20-羟基蜕皮酮 | Sigma | H5142 | |
| 变色龙钛宝石激光器 | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| 人胰岛素 | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| 成像软件 | Prairie | ||
| 显微剪刀 | World Precision Instruments | 501778 | |
| 显微固定针 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 氧气瓶 | Praxair | OX M-E | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 硅橡胶弹性体 | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| 双光子显微镜 | Bruker | ||
| 水浸物镜（20X） | Zeiss | 421452-9800-000 |
参考文献
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
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重印与许可
