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微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

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DOI：

10.3791/62992

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2021年9月13日

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1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。

摘要

全细胞冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是一种强大的技术，可用于在细胞环境中以纳米级分辨率解析大分子的结构，并将其保持在接近天然的冷冻水合状态。然而，在将细胞培养或贴附到透射电镜（TEM）载网上时，如何在适合断层扫描成像的同时维持细胞的生理状态，仍存在诸多挑战。本文提供了一种利用微图形化技术引导并促进真核细胞在TEM载网上生长的详细分步操作方案。在微图形化过程中，通过在TEM载网的支撑膜上特定位置和图案区域沉积细胞外基质（ECM）蛋白，从而引导细胞生长，而其他区域则保留抗污染涂层。由于表面涂层和图案设计具有高度灵活性，微图形化技术可广泛适用于多种细胞类型。该技术不仅适用于单个细胞内结构的研究，也适用于更复杂的实验体系，如宿主-病原体相互作用或分化的多细胞群落。此外，微图形化还可整合到多种下游全细胞cryo-ET工作流程中，包括冷冻关联光镜与电镜（cryo-CLEM）以及聚焦离子束切削（cryo-FIB）。

引言

随着冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的发展、拓展和多样化，研究人员能够在接近天然的状态下，以从大分子尺度（约1 nm）到高分辨率（约2 Å）的范围，观察多种生物样品。单颗粒冷冻电镜技术与电子衍射技术分别最适合用于溶液中或晶体状态下的纯化大分子1,2。而冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）则特别适用于对细菌、多形性病毒和真核细胞等大型异质性结构进行接近天然状态的结构与超微结构研究3。在冷冻电子断层扫描中，通过在显微镜载物台上物理倾斜样品，并从不同角度获取穿过样品的一系列图像，从而获得三维（3D）信息。这些图像，即倾转系列图像，通常以每步1至3度的增量，覆盖+60/-60度的范围。随后，可通过计算方法将倾转系列图像重构为一个三维体数据，也称为断层图（tomogram）4。

所有冷冻电镜技术都需要将样品包埋在一层薄的非晶态、非结晶性的玻璃态冰中。最常用的冷冻固定技术之一是浸入式冷冻，即将样品施加到电镜载网上，吸去多余液体后迅速浸入液态乙烷或液态乙烷与丙烷的混合物中。该技术足以实现厚度从<100 nm至约10 µm的样品的玻璃化，包括培养的人源细胞（如HeLa细胞）5,6。厚度达200 µm的较厚样品，例如微型类器官或组织活检样本，可通过高压冷冻实现玻璃化7。然而，由于较厚样品会增加电子散射，因此在300 kV透射电子显微镜中，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）所允许的样品和冰层厚度被限制在约0.5 - 1 µm范围内。因此，若无额外的样品制备步骤（如冷冻切片8或聚焦离子束铣削9,10,11），多数真核细胞的全细胞冷冻电子断层扫描仅限于细胞周边区域或细胞突起部分。

许多全细胞冷冻电子断层扫描成像实验的一个局限性是数据采集通量较低12。与单颗粒冷冻电镜技术不同，在后者中，通常可以从单个透射电镜（TEM）网格方格内采集数千个独立颗粒的图像，而细胞体积较大、分布分散，且必须以足够低的密度生长，以便将细胞包埋在一层薄的玻璃态冰中得以保存。通常，感兴趣区域仅限于细胞的特定结构或亚区域。此外，细胞倾向于在不适合TEM成像的区域生长，例如在TEM网格条上或其附近，这进一步限制了通量。由于在TEM网格上进行细胞培养存在诸多不可预测的因素，因此需要技术上的改进，以提高样品的可及性和数据采集的通量。

利用黏附性细胞外基质（ECM）蛋白进行基底微图形化是一种成熟的活细胞光学显微技术，可引导细胞在刚性、耐用且光学透明的表面（如玻璃及其他组织培养基底）上定向生长13,14。微图形化技术也已应用于柔软和/或三维（3D）表面。此类技术不仅实现了细胞的精确定位，还促进了多细胞网络的构建，例如具有特定图案的神经细胞回路15。将微图形化技术引入冷冻电子断层扫描（cryo-ET），不仅能提高通量，还有望开启对复杂且动态的细胞微环境进行全新研究的大门。

近期，多个研究团队已开始通过多种方法在透射电子显微镜（TEM）载网上应用微图形化技术16,17。本文描述了一种使用Alvéole PRIMO微图形化系统对TEM载网进行无掩模光图形化的方法，该系统具有高分辨率和非接触式图形化的特点。利用该微图形化系统，首先在基底表面涂覆一层抗污染层，随后施加光催化剂，并通过紫外激光在用户自定义的图案区域中去除抗污染层。之后可将细胞外基质（ECM）蛋白添加至这些图案区域，以进行相应的细胞培养。该方法已被多个研究团队用于视网膜色素上皮细胞-1（RPE1）、Madin-Darby犬肾细胞-II（MDCKII）、人包皮成纤维细胞（HFF）以及内皮细胞系的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究16,17,18。该微图形化系统兼容多种抗污染层基底，以及液态或凝胶态的光催化剂试剂。用户可根据特定细胞系的需求，灵活选择并适配多种ECM蛋白，从而具备良好的实验灵活性。

微图案化技术已成功应用于实验室内的多个研究项目19。本文介绍了一种微图案化实验方案，包括针对培养的HeLa细胞、呼吸道合胞病毒（RSV）感染的BEAS-2B细胞以及原代幼虫期Drosophila melanogaster神经元研究的具体优化步骤20。

方案

本文所述方案汇编了威斯康星大学麦迪逊分校Wright实验室与冷冻电镜研究中心所使用的细胞培养、微图形化及成像方法。工作流程见图1。更多培训与教学资料可访问以下网站：https://cryoem.wisc.edu 或 https://wrightlab.wisc.edu

1. 图案化网格的制备

  1. 将透射电镜载网转移至洁净的玻璃载片上，碳膜面朝上（碳膜的标准厚度为 12 nm）。使用碳镀膜仪（ACE600）在载网上再镀 5–8 nm 的碳层，以增强整体碳膜的耐用性。
    注意：此步骤对 SiO2 载网非必需。此步骤也可提前完成；将镀膜后的载网储存于低湿度环境中，例如真空干燥器中。
  2. 将载网转移至载网预处理 holder 中，碳膜面朝上进行辉光放电。使用辉光放电系统，在 10 mA 电流、80 mm 工作距离和 1.0 × 10-3 mbar 真空压力条件下对载网放电 60 秒。该步骤应在下一步前 15–30 分钟内完成。
    注意：载网预处理 holder 可商业购买，也可用小型培养皿上放置一片滤纸自制。

2. 防污层的应用

注意：处理载网时应使用正确的无菌技术，所有溶液均应为无菌或经过滤除菌。

  1. 将载网（碳膜面朝上）转移至洁净的玻璃载片或盖玻片上，各载网之间至少间隔 1 cm。向每个载网上滴加 10 µL 的 0.05% 多聚-L-赖氨酸（PLL）。将载网置于湿润室（例如内含湿润纸巾的密闭塑料盒）中孵育至少 30 分钟。
    注意：此步骤可延长至过夜。确保湿润室内的湿度足够，防止载网干燥。
  2. 用 15 µL 的 0.1 M HEPES（pH 8.5）对每个载网清洗三次。每次清洗时，用移液器吸除大部分液体，注意避免载网干燥；然后加入 15 µL 新鲜缓冲液，孵育至少 30 秒后重复操作。最后一次清洗后，使每个载网保持在 15 µL 的 0.1 M HEPES 中。
    注意：在此步骤及后续步骤中，保持载网湿润至关重要，同时应避免移液器与载网接触。
  3. 为每个载网配制 10 µL 的 100 mg/mL 聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯（PEG-SVA）溶液，溶于 0.1 M HEPES（pH 8.5）。轻轻混匀后，PEG-SVA 会迅速溶解，形成澄清溶液。
    注意：请勿提前配制 PEG-SVA 溶液。PEG-SVA 在 pH 8.5 条件下半衰期为 10 分钟。避免 PEG-SVA 原液接触过多湿气，应将其储存于干燥器或干燥环境中，并于 -20 °C 保存；使用前需恢复至室温再打开。
  4. 配制好 PEG-SVA 溶液后，立即从每个载网上移除 15 µL 的 HEPES（pH 8.5）液滴（注意避免载网干燥），并加入 10 µL 的 PEG-SVA 溶液。将载网置于湿润室中孵育至少 1 小时。
    注意：此步骤可延长至过夜。确保湿润室内的湿度足够，防止载网干燥。
  5. 用 15 µL 无菌水对每个载网清洗三次。每次清洗时，用移液器吸除大部分液体，注意避免载网干燥；然后加入 15 µL 新鲜无菌水，孵育至少 30 秒后重复操作。最后一次清洗后，使每个载网保持在 15 µL 无菌水中。

3. 应用PLPP凝胶

  1. 为每个载网准备一块干净的显微镜盖玻片。每次处理一个载网，依次完成以下步骤，以尽量减少载网干燥的可能性。
  2. 在盖玻片中央滴加 1.0 µL 水，以帮助放置载网并保持载网湿润。小心地将载网从 15 µL 水滴 转移至盖玻片上的 1.0 µL 水滴中。确保将载网碳膜面朝上放置。
  3. 小心地将聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩膜覆盖在载网上，注意保持载网居中，并尽量减少掩膜与载网碳膜的接触。
  4. 向载网上加入 1.0 µL 的 4-苯甲酰基苄基三甲基氯化铵（PLPP）凝胶。轻轻吹打混合（切勿让移液器吸头接触载网）。
  5. 将带有载网的盖玻片移至避光处干燥。凝胶将在约 15–30 分钟内干燥。

4. 微图案的校准与设计

  1. 用荧光笔将玻璃盖玻片的一面涂上颜色。再用细头永久性记号笔添加黑色线条，以便更易于聚焦。将盖玻片放置在显微镜载物台上，使着色面朝向物镜。使用明场模式，对准荧光笔标记进行聚焦。
  2. 确保显微镜和微图形化系统已开启，并设置正确的光路。在显微镜计算机上打开 Micromanager 和 Leonardo 软件（插件 > Leonardo）。
  3. 选择“校准”并按照屏幕提示操作。调节显微镜焦距，使投射到载玻片上的图像清晰对焦。可能需要降低曝光时间。校准完成后，选择 立即图形化（Pattern Now）。
  4. 记录程序左上窗口校准数据中报告的微米/像素（µm/px）比值（图2，区域1）。使用该比值确定设计图形时每微米所需的像素数。
  5. 校准后，确保软件已打开并显示显微镜的实时明场图像。将已制备的网格盖玻片（第3节）加载到载物台上，使网格面朝向物镜。移动载物台并调节焦距，使网格在软件窗口中清晰可见。
  6. 以微米为单位测量网格方格和网格条的尺寸。软件包含一个标尺工具，可通过左下角附近的按钮激活以测量网格（图2，区域2）。例如，本实验中使用的200目网格对应的方格尺寸约为87 × 87 µm，网格条宽度约为36 µm。
    注：软件支持在运行过程中灵活调整图形尺寸，因此测量中的轻微误差可以接受。
  7. 根据上述测量结果和比值，使用任意图像创建软件设计图形。使用20×物镜时，最小特征尺寸为1.2 µm。图形应保存为未压缩的8位.tiff文件。
    1. 确保保存图像时软件不会将其重新缩放为不同的像素尺寸。图形应适配于800 × 800像素的范围内，足以覆盖四个网格方格。
      ​注：像素值为255（白色）的区域将以最高强度进行图形化（激光总剂量），像素值为0（黑色）的区域则不会被图形化。任何中间灰度值的像素将以约(X/255)*总剂量的强度进行图形化。在图3A中，灰度图形使用了255和129的像素值。图形设计完成后，可保存并重复使用，无需修改。

5. 微型图案化

  1. 校准后，确保软件已打开，并显示显微镜的实时明场图像。将已制备的网格盖玻片（第3节）放置在载物台上，使网格面朝向物镜。调整载物台位置并调焦，使网格在软件中清晰可见。
  2. 首次运行时，需设计一个新的模板。在软件中选择 添加感兴趣区域（Add ROI）（未显示，位于 图2 区域3的位置），并选择一个直径为3,000 µm的圆形。以屏幕上的明场图像为参考，将圆形感兴趣区域（ROI）定位在网格上方。按下锁定按钮以固定该ROI。
  3. 锁定ROI后，选择 添加图案（Add Pattern）（未显示，位于 图2 区域3）。选择第4节中设计的图案。将网格划分为六个区域，以便对每个区域独立对焦和定位，以补偿网格表面不平整的情况。在网格的每个角落设置一个8 × 8的网格方格区域，在中心两侧各设置一个2 × 8的网格方格区域，中心四个网格方格不进行图案化处理（图2，中间图像）。
  4. 使用复制选项（图2，区域4）生成初始图案的多个副本，以达到所需总数。如有必要，调整各副本之间的间距，使其与网格方格之间的间距一致。
  5. 设置图案的总剂量（Total Dose）。30 mJ/mm2 是一个合适的起始值。更多细节请参见讨论部分。
  6. 在 专家选项（Expert Options）（图2，区域4）中，调整区域角度以匹配网格方格的方向。可通过鼠标重新定位区域。也可调整图案的比例（大小）。反复调整角度、位置、间距和比例，直到图案与网格方格精确对齐。移动显微镜载物台，以改变实时明场图像中显示的网格区域。
  7. 按下 锁定（Lock） 以保存对区域所做的修改。
  8. 如需复制某一区域，点击该区域名称旁的 复制（Duplicate） 按钮（图2，区域5，两个纸张图标），该按钮位于左侧的 操作面板（Actions panel） 中。如需重新定位、重命名或编辑副本，点击 操作面板 中其名称进行操作。
  9. 根据需要重复步骤5.4–5.9，以填充所有目标区域。
  10. 当完整模板设计并定位完成后，在软件中 保存（Save） 模板文件（图2，区域6，顶部工具栏中带向上箭头的图标）。
  11. 加载先前保存的模板（带向下箭头的图标）时，将ROI居中对准网格，然后按下 锁定（Lock）。点击 操作面板 中每个区域的名称，可更改其角度、位置、剂量和/或图案文件。
  12. 当模板和图案定位完成后，在软件的 操作面板 中，仅保留一个区域被选中，其余区域取消勾选。
  13. 使用显微镜载物台移动至该区域，并对碳膜进行对焦。点击 操作面板 中的 眼睛（Eyeball） 图标（图2，区域5），可切换图案叠加层的显示或隐藏。
  14. 当网格清晰对焦后，关闭明场快门，然后点击软件右下角的 播放（Play） 图标，开始图案化过程，该过程可实时监控。
  15. 在操作面板中选择下一个区域的复选框。打开明场快门，使网格可见，并使用显微镜载物台将该区域居中。对 操作面板 中的每个区域重复执行步骤5.13–5.14。
  16. 从显微镜上取下带有网格的盖玻片，并立即用移液器加入10 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）至网格上。
  17. 10分钟后，用镊子移除模板，然后用15 µL PBS清洗网格3次。最后一次清洗后，将每个网格置于15 µL PBS中，并将网格转移至避光处。

6. 细胞外基质蛋白的沉积

  1. 对于培养细胞，请执行步骤 6.2-6.5；对于原代 Drosophila 神经元，请执行步骤 6.6-6.10。
  2. 每张载网至少准备 15 µL 的细胞外基质（ECM）。对于 BEAS-2B 细胞，在无菌 PBS 中配制终浓度为 0.01 mg/mL 的牛纤维连接蛋白和 0.01 mg/mL 的荧光标记纤维蛋白原。对于 HeLa 细胞，在无菌 PBS 中配制 0.01 mg/mL 的牛胶原蛋白 I 和 0.1 mg/mL 的荧光标记纤维蛋白原。
  3. 从每张载网中移除大部分 PBS，并加入 15 µL ECM 溶液。将载网置于室温下的湿盒中孵育至少 1 小时。
    注意：此步骤也可在 4 °C 下延长至过夜孵育。
  4. ECM 孵育后，用无菌 PBS 对每张载网洗涤 5 次。每次洗涤时，用移液器移除大部分液体，避免载网干燥，加入 15 µL 新鲜 PBS，孵育至少 30 秒，重复此过程。最后一次洗涤后将载网保留在 PBS 中。
    注意：载网可在 4 °C 的 PBS 中保存长达一周，未观察到质量下降。
  5. 使用荧光显微镜检测 ECM 中的荧光标记物，以确认图案形成以及碳膜是否保持完整。少量破损方格通常可接受。
  6. 对于原代 Drosophila 神经元，将已图案化的载网转移至含有无菌 PBS 的 30 mm 玻底培养皿中。
  7. 吸除培养皿中的 PBS，并加入 2 mL 含 0.5 mg/mL 荧光标记刀豆蛋白 A 的溶液。在无菌环境中于 25 °C 下过夜孵育。
  8. 从培养皿中移除刀豆蛋白 A 溶液（避免载网干燥），并用 PBS 洗涤载网 3 次。每次洗涤时，向培养皿中加入和移除 2 mL PBS。
  9. 使用荧光显微镜检测 ECM 中的荧光标记物，以确认图案形成以及碳膜是否保持完整。少量破损方格通常可接受。
  10. 最后一次洗涤后，从玻底培养皿中移除 PBS，并加入 2 mL 新鲜配制、经无菌过滤的补充型 Schneider's Drosophila 培养基21，其中包含 20% 热灭活胎牛血清（FBS）、5 µg/mL 胰岛素、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 10 µg/mL 四环素。在无菌环境中于 25 °C 下孵育，直至神经元可用于接种。

7. 原代细胞的制备 果蝇 接种前的细胞

  1. 用70%乙醇对55 mm解剖皿进行灭菌，然后向皿中加入 2-3 mL 无菌过滤的1×解剖盐溶液（9.9 mM HEPES pH 7.5, 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.17 mM NaH₂PO₄, 0.81 mM MgSO₄, 1.8 mM CaCl₂）2PO4，0.22 mM KH2PO4，3.3 mM 葡萄糖，43.8 mM 蔗糖）21.
  2. 挑选30-40个3rd 用镊子轻轻将龄期幼虫从食物中取出。
  3. 将幼虫放入含有1× PBS的离心管中，然后转移至另一管含有1× PBS的离心管中以洗涤幼虫。
  4. 将幼虫转移至含有70% EtOH的离心管中，以洗去PBS，随后将幼虫转入第二个含有70% EtOH的离心管中。让幼虫在第二个离心管中停留2-3分钟，以实现幼虫的消毒。
  5. 将幼虫转移至含有1×解剖用生理盐水的离心管中，随后立即转移至另一含有1×解剖用生理盐水的离心管中。
  6. 将单个幼虫转移至含有1×解剖盐水的解剖皿中。使用镊子和解剖显微镜，迅速撕裂每只幼虫以取出脑组织，并将其转移至第三个含有1×解剖盐水的离心管中。重复此步骤，直至所有脑组织均被提取完毕。
  7. 将含有脑组织的试管在300 x g条件下离心 g 1 分钟。
  8. 弃去上清液，加入1 mL 1×解剖盐溶液洗涤，300 × g离心1分钟。重复此步骤一次。
  9. 弃去上清液，保留管中200–250 µL，加入20 µL含1x解剖盐溶液的2.5 mg/mL Liberase。
  10. 将离心管置于旋转仪上，室温孵育1 h；在此期间，每隔10 min用移液器吹打溶液25–30次。孵育结束时，溶液应略显浑浊。
  11. 以 300 × g 离心细胞 g 5 分钟。
  12. 弃去上清液，然后加入1 mL添加补充物的Schneider培养基。用移液器吹打溶液30次以混匀。
  13. 将细胞在 300 × g 5 分钟。
  14. 弃去上清液，加入1 mL添加补充物的Schneider培养基洗涤细胞沉淀。用移液器吹打溶液30次以充分混匀。
  15. 以 300 × g 离心细胞 g 5 分钟。
  16. 弃去上清液，然后用300 µL添加补充物的Schneider培养基重悬细胞沉淀。用移液器吹打30–40次以混匀。

8. BEAS-2B 和 HeLa 细胞的培养及 RSV 感染

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将HeLa细胞和BEAS-2B细胞培养于T75培养瓶中。当细胞融合度达到约80%时，每3-4天传代一次。HeLa细胞使用DMEM + 10% FBS + 1×抗生素-抗真菌剂培养；BEAS-2B细胞使用RPMI + 10% FBS + 1×抗生素-抗真菌剂培养6,22,23。
  2. 如需接种未感染细胞，请跳至第9节。BEAS-2B细胞和HeLa细胞均易受呼吸道合胞病毒（RSV）感染；本研究中所有涉及RSV的实验均使用BEAS-2B细胞。
    注意：所有生物安全二级（BSL-2）操作必须遵守机构规程，在适当的生物安全柜（BSC）中进行，并穿戴个人防护装备（PPE）。
  3. 在进行RSV感染前，将5 × 104个细胞接种至6孔板（表面积约9.6 cm2）每孔中，加入2 mL生长培养基，过夜培养。
  4. 用胰蛋白酶消化并计数其中一孔的细胞。消化时，吸除一孔中的培养基，用2 mL无Mg2+和Ca2+的无菌PBS洗涤以去除残留培养基。加入500 µL 0.25%胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育5-10分钟。定期观察细胞是否从培养表面脱落。一旦细胞脱落，加入1.5 mL培养基终止消化。
  5. 取100 µL胰蛋白酶消化后的细胞悬液与100 µL台盼蓝混合。用移液器吸取10 µL稀释后的细胞混合液加入血细胞计数板。计数细胞并计算每孔细胞数量。使用该数值计算后续的感染复数（MOI）。
  6. 用生长培养基配制RSV-A2mK+24的稀释液，使每孔750 µL培养基中的MOI为10。RSV-A2mK+的MOI可根据病毒原液的荧光灶单位（FFU）滴度计算（例如：若每孔接种1.0 × 105个细胞，RSV原液滴度为1.0 × 108 FFU/mL，则将病毒原液按1:75稀释至1 × 106 FFU/750 µL，即1.33 × 106 FFU/mL）。
  7. 吸除6孔板中各孔的培养基，每孔加入750 µL上述病毒溶液。
  8. 室温下轻轻摇动培养板1小时。
  9. 1小时后，每孔补加预热至37 °C的生长培养基，使总体积达到2 mL，然后将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续孵育6小时。
  10. 用胰蛋白酶消化细胞使其脱落，按以下方法进行接种。接种后继续培养网格18小时，再进行冷冻固定（自感染起总计24小时）。

9. 将细胞接种到微图形化网格上

  1. 对于培养的细胞，请执行步骤 9.2-9.8；对于原代 Drosophila 神经元，请执行步骤 9.9-9.11。
  2. 用胰蛋白酶消化细胞以使其脱离（参见上文第 8 节中的步骤 4）。为减少细胞聚集，应在细胞融合度为 60% 或更低时进行胰蛋白酶消化。
  3. 将 100 µL 胰蛋白酶消化后的细胞与 100 µL 台盼蓝混合。用移液器将 10 µL 稀释后的细胞混合液加入血细胞计数板，进行细胞计数。
  4. 用培养基将细胞稀释至 2 × 104 个细胞/mL。
  5. 在 30 mm 玻璃底培养皿中央加入 1 µL 培养基，以帮助放置网格并防止其干燥。将覆盖有 PBS 的盖玻片上的网格转移至玻璃底培养皿中央，然后向网格上加入 10 µL 细胞悬液。
  6. 使用明场显微镜，观察细胞在 5 分钟后对网格的黏附情况。若大多数图案区域仍为空白，可额外添加 10 µL 细胞悬液。在孵育过程中，保持网格和细胞悬液处于 37 °C。
  7. 重复步骤 9.6，直至大多数图案区域被占据，或多个已占据的图案区域开始出现多个细胞。将网格在培养箱中孵育 2 小时（37 °C，5% CO2）。
  8. 向培养皿中加入 2 mL 预热的培养基，充分浸没网格，并过夜孵育（37 °C，5% CO2）。
  9. 对于原代 Drosophila 神经元，从含有网格的培养皿中移除培养基，并将细胞接种到培养皿上。
  10. 等待 30–60 分钟使细胞贴壁，然后加入 2 mL 添加补充物的 Schneider 培养基。
  11. 在 25 °C 培养箱中培养神经元至少 2–3 天，之后进行骤冷冷冻。

10. 图案化载网的成像与玻璃化

  1. 将含有图案化网格和培养细胞的玻璃底培养皿放置在荧光显微镜上。
  2. 使用明场以及适当的荧光通道获取网格图像，以检测网格图案及细胞中的任何其他标记。确保细胞密度和位置适合后续成像与分析。
    注意：明场和荧光图像在FIJI软件包25中进行处理。
  3. 准备一台冷冻固定仪；冷冻装置的类型取决于可用性、成本以及最适合样品的特性。
    注意：初级 Drosophila 神经元使用全自动冷冻固定仪制备，而BEAS-2B细胞则使用半自动冷冻固定仪制备。
  4. 在样品上施加金标记物，以便正确对齐倾转系列图像。用滤纸吸取去除多余培养基，然后将样品迅速浸入由液氮冷却的液态乙烷等冷冻剂中进行冷冻固定。对于初级 Drosophila 神经元，从背面 blot 4 秒；对于HeLa和BEAS-2B细胞，从两面各 blot 4–6 秒。冷冻后的载网可保存在液氮中，待后续使用。
  5. 在300 kV下使用配备直接电子探测器相机的冷冻电镜对玻璃化细胞进行成像。使用如SerialEM26等软件设置每个感兴趣区域的倾转系列数据采集，用于冷冻电镜/冷冻电子断层成像（cryo-EM/cryo-ET）数据采集。
    注意：初级 Drosophila 神经元的倾转系列在直接电子探测器上以-8 µm欠焦条件下，从-60°到60°双向采集，倾转增量为2°，像素尺寸为4.628 Å，总剂量为70–75 e-/Å2。RSV感染的BEAS-2B细胞的倾转系列在配备能量过滤器（狭缝宽度20 eV）的直接电子探测器上采集，欠焦量为-5 µm，像素尺寸为4.603 Å，总剂量约为80 e-/Å2。
  6. 处理倾转系列图像以重建断层图（tomograms）。
    注意：本文展示的断层图使用IMOD软件包27重建；低通滤波使用EMAN2软件包28完成。

结果

该实验流程用于制备全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）实验用的电镜载网。本研究中展示的完整工作流程，包括初始细胞培养准备、微图案化（图1）以及成像，总共需要3至7天。采用两步法构建抗污涂层：首先将聚赖氨酸（PLL）涂覆于载网上，随后通过添加活性PEG-SVA将聚乙二醇（PEG）共价连接。抗污涂层也可通过单步法实现，即在一次孵育中直接使用PLL-g-PEG。PLPP凝胶是紫外微图案化过程中的催化剂，该催化剂亦有较低浓度的液态形式可供使用。与液态形式相比，凝胶形式可在显著降低辐照剂量的情况下实现图案化，从而大幅缩短图案化时间。使用该系统，完成一张完整透射电镜（TEM）载网的实际图案化时间约为2分钟。微图案化工作流程本身通常持续5至6小时，可使操作者完成八张用于标准细胞培养的TEM载网的图案化制备。

微图案化过程中的多个步骤需要较长的孵育时间（见步骤 2.1、2.3、6.4）。为方便起见，其中一些步骤（如 PLL 钝化（2.1）或 PEG-SVA 钝化（2.3））可延长至过夜孵育。此外，网格可预先制备并储存在细胞外基质蛋白溶液或 PBS 中，以备后续使用。在我们的研究中，这些选项在细胞准备和接种时间至关重要的情况下非常有价值，例如原代 Drosophila 神经元以及 BEAS-2B 细胞的 RSV 感染实验。

载网在通用生物安全二级（BSL-2）实验室环境中制备，使用洁净工具和无菌溶液，并在培养基中添加抗生素和抗真菌剂6,22,29,30。对于特别容易受到微生物污染的样品，防污层和细胞外基质（ECM）可在组织培养超净台或其他无菌环境中进行涂覆。此外，在图案化处理与ECM涂覆之间，可使用乙醇清洗载网。若涉及传染性物质的操作，必须调整实验流程以符合相应的生物安全规范。

该工作流程及所展示的操作步骤（图1）使得HeLa细胞（图4）、RSV感染的BEAS-2B细胞（图3、图5）以及原代Drosophila幼虫神经元（图6、图7）能够接种于图案化电镜载网上，以实现最优的冷冻电子断层扫描数据采集。

通过钙黄绿素-AM和碘化丙啶同源二聚体-1染色的细胞活力检测确定，接种在微图案化透射电镜载网上的HeLa细胞仍保持活性（图4A，B）。使用胶原蛋白和纤维蛋白原混合的细胞外基质时，HeLa细胞能够牢固地黏附于载网上的微图案区域（图4A，C）。沿图案扩展的细胞整体形态与在无图案载网上培养的细胞相似（图4C，D）。对于HeLa细胞而言，细胞总厚度保持在约< 10 µm，而在细胞周边区域则明显更薄，厚度约为< 1 µm（图4E，F）。

在呼吸道合胞病毒（RSV）研究中，我们采用梯度模式覆盖整个网格区域，边缘为低剂量暴露，中心区域则呈现较高剂量的分布模式（图3A）。在检测细胞周边释放的病毒时，梯度模式获得了更理想的结果。在这些模式下，细胞倾向于优先黏附于细胞外基质（ECM）浓度较高的区域，但也能在ECM浓度较低的区域黏附并生长。当使用需要多种剂量的模式时，不同区域之间的相对剂量需进行优化。如果各剂量之间，即ECM浓度之间差异过小或过大，使用多剂量的效果将会丧失。

在图3中，对透射电镜（TEM）载网进行图案化处理后，接种了呼吸道合胞病毒（RSV）感染的BEAS-2B细胞，并用于冷冻电镜（cryo-EM）数据采集。图4A为采用梯度图案在TEM载网上形成的细胞外基质（ECM）的荧光图像。接种18小时后，细胞在图案中央区域的黏附与生长情况可见于图3B的明场图像中。在图3C中，RSV-A2mK+复制产生的荧光信号（红色）与ECM信号叠加显示，大多数感染细胞位于梯度图案中密度较高的中央区域。冷冻固定后对载网进行的低倍透射电镜成像显示，多个细胞（包括RSV感染的细胞）位于载网方格中心附近的碳膜上。如先前在标准TEM载网上培养的细胞中所报道22，在微图案化载网上培养的感染BEAS-2B细胞边缘附近，可定位并采集到RSV病毒颗粒的倾斜系列图像（图5A、B）。在断层图像中可识别出多种RSV结构蛋白，包括核衣壳蛋白（N）和病毒融合蛋白（F）（图5C中分别以蓝色和红色箭头标示）。

在进行原代 Drosophila 神经元研究时发现，接近软件分辨率极限的窄图案（图案厚度为 2 µm）可在每个网格方格内分离出一个至少数个细胞（图6）。神经元胞体能够在该图案内持续数天延伸其神经突。与未图案化网格上培养的神经元相比，这使得神经突更易于识别并进行倾斜系列成像（图7）。此外还发现，荧光标记的刀豆球蛋白A（concanavalin A）——一种已被用于体外 Drosophila 神经元培养的细胞外基质凝集素20,21——适用于图案化制备。

果蝇 根据先前发表的方案分离了三龄幼虫的神经元20,21,31神经元样本被接种到微图案化的冷冻电镜载网上，载网上的微图案区域已沉积刀豆蛋白A（concanavalin A），以调控细胞的定位、铺展和排列。神经元在图案化或非图案化载网上孵育至少48–72小时后，将载网进行快速冷冻。一幅具有代表性的微图案化电镜载网图像显示了多个 果蝇 图案化区域中分布的神经元如图所示 图6A这些神经元来源于一种转基因果蝇品系，该品系具有膜定位的泛神经元GFP表达，因此不仅可通过其荧光标记，还可借助其在微图案中的位置，利用光学显微镜轻松追踪。尽管在无图案网格上培养的神经元也可通过光学显微镜观察其GFP信号进行追踪（图7A，黄色圆圈），由于存在细胞碎片以及培养基中的污染物，通过冷冻电镜定位它们变得困难得多图7B，黄色圆圈）。在图案化网格上的神经元中，此类现象有所减少，可能是由于非图案化区域的防污层中含有聚乙二醇（PEG），可排斥细胞碎片附着所致。由于神经元胞体的尺寸以及延伸的神经突（图6A，B，黄色圆圈），沿细胞较薄区域采集了冷冻电子断层扫描倾转系列图像（cryo-ET tilt series）图6C，D，红色圆圈）。在高倍率图像拼接图及三维断层图像的切片中，神经元细胞膜、线粒体（青色）、微管（紫色）、肌动蛋白丝（蓝色）、囊泡结构（橙色和绿色）以及核糖体（红色）等大分子物质均得到了清晰分辨。图6E）。尽管在无图案化神经元的三维断层图像中也能观察到类似的亚细胞结构特征（图7E），定位可用于数据采集的活性细胞目标的难度显著降低了通量。

在图8中，汇集了一些存在上述问题的载网的代表性图像，以帮助识别和排查这些问题。一旦确定了最佳条件，微图案化便是一种可靠且可重复的用于在冷冻透射电镜载网上定位细胞的方法。

微图案化工作流程示意图；网格准备、细胞外基质接种、冷冻制样与显微镜观察。
图1：用于冷冻电镜的微图案化通用工作流程。该工作流程大致可分为四个部分：网格准备、微图案化、细胞外基质（ECM）与细胞接种，以及冷冻制样与数据采集。各部分的主要步骤列在标题下方，完成每个部分所需的大概时间显示在左侧。请点击此处查看此图的放大版本。

用于光刻中精确定位的纳米图案化软件界面；配置示意图。
图 2：软件界面截图，显示图案在网格上的定位。区域 1 包含用于图案设计的 µm/pix 比例。区域 2 是用于测量网格的标尺。区域 3 用于添加或修改图案和感兴趣区域（ROIs）。区域 4 包含图案定位和剂量的所有相关信息。区域 5 包含图案的选项，包括切换叠加层、复制或删除图案，以及选择用于微图案化的图案。区域 6 用于保存和加载模板。下方展示了区域 4 和区域 5 的放大视图，以便更清晰地查看。请点击此处查看此图的放大版本。

显示蛋白质分析的微阵列荧光显微镜图像；实验结果中的网格图案。
图3：接种于图案化冷冻透射电镜载网上的RSV感染BEAS-2B细胞。（A）添加荧光标记的细胞外基质（ECM）后图案化载网的荧光图像。输入图案显示在左下角。（B）在A图载网上培养的BEAS-2B细胞的明场图像。（C）A图（青色）与B图（灰色）图像的叠加，以及在浸入冷冻前立即拍摄的RSV感染细胞的荧光图像（红色）；感染细胞表达mKate-2。比例尺为500 µm。（D）B图载网在浸入冷冻后的低倍率冷冻透射电镜图谱。荧光图像为伪彩着色。比例尺为500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

微图案化对比；荧光显微镜；细胞生长；三维成像；网格图案分析。
图4：图案化与非图案化培养条件下细胞的活/死染色结果。（A）在具有图案化网格的基底上培养的HeLa细胞，经钙黄绿素-AM（活细胞染料，绿色）和溴化乙啶同源二聚体-1（死细胞染料，红色）染色后的荧光图像。（B）在无图案化网格的基底上培养的HeLa细胞，染色方式同A。（C）在经图案化处理的Quantifoil R2/2网格（涂覆0.01 mg/mL胶原蛋白和fibrinogen 647细胞外基质，红色）上培养的HeLa细胞，其共聚焦z轴层扫图像的投影图。细胞经钙黄绿素-AM（绿色）和Hoechst-33342（蓝色）染色。（D）在未图案化网格上培养的HeLa细胞，孵育于含0.01 mg/mL胶原蛋白和fibrinogen 647细胞外基质的环境中，并用钙黄绿素-AM和Hoechst-33342染色。荧光图像与透射光图像（灰度）合并显示。（E）C图的X,Z轴投影。（F）D图的X,Z轴投影。图像为伪彩色显示。（A）和（B）中的比例尺为500 µm；（C）至（F）中的比例尺为10 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

具有纳米结构的材料表面电子显微镜图像，突出显示用于研究的特定区域。
图 5：感染呼吸道合胞病毒（RSV）的 BEAS-2B 细胞在图案化冷冻电镜载网上的冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）图像。 （A）感染 RSV 的 BEAS-2B 细胞的冷冻电镜载网方格图。虚线绿色轮廓线大致标示出细胞边界。（B）A 图中红色方框区域的高分辨率图像。虚线绿色线大致标示出细胞边界。在细胞周边区域可见 RSV 病毒颗粒（白色箭头和黄色方框）。（C）从 B 图黄色方框区域内采集的断层图像中提取的单个 z 切片。红色箭头指向 RSV F 融合蛋白，蓝色箭头指向核糖核蛋白（RNP）复合物。A–C 图中的比例尺已嵌入图像中。请点击此处查看该图的放大版本。

Microscopy images: nanostructures, cellular details, cryo-electron tomography analysis, 50 µm to 250 nm.
图6：从3个大脑中提取的原代神经元rd 龄期 黑腹果蝇 图案化冷冻透射电镜载网上孵育的幼虫。 (A) 活细胞荧光显微镜网格拼接叠加图像 黑腹果蝇 表达膜定位型GFP的神经元位于经0.5 mg/mL荧光刀豆蛋白A标记的图案化网格方格上。绿色： 果蝇 神经元。蓝色：光刻图案。 (B) 冷冻电镜图像拼接图，显示A中网格经冷冻保存后的状态。黄色圆圈标注的网格方格与A中相同。C) (A) 和 (B) 中黄色圆圈标示区域的冷冻电镜图像拼接图。D（C）中红色圆圈区域的高倍放大图像，该区域的细胞突起上采集了倾斜系列图像。 E. 从 (C) 中红色圆圈区域获取的倾转系列重建的断层图像中截取的 25 nm 厚切片。该断层图像中可见多种细胞器，如线粒体（青色）、微管（紫色）、致密核心囊泡（橙色）、轻质囊泡（绿色）、内质网（黄色）和肌动蛋白（蓝色）。在右上角还可观察到核糖体（红色）等大分子复合物。荧光图像为伪彩色。图 (A)–(E) 中的比例尺嵌入于图像中。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Cryo-electron microscopy diagram detailing cellular structures with labeled regions for analysis.
图7：从3个大脑中提取的原代神经元rd 龄期 黑腹果蝇 未图案化网格上的幼虫。 (A活细胞荧光显微镜网格拼接图像 果蝇 表达膜定位型GFP的神经元位于含0.5 mg/mL刀豆球蛋白A的网格方格上。绿色： 果蝇 神经元。B) 同一载网在浸入冷冻后的冷冻电镜载网拼接图，该载网如 (A) 所示。黄色圆圈标示的网格方格与 (A) 中相同。注意可见细胞碎片和培养基污染，与图案化载网相比，这使得目标物的识别更加困难。C) 冷冻电镜图像拼接图，显示 (A) 和 (B) 图中黄色圆圈标示的方形区域。D) 图C中红色圆圈区域的高倍放大图像，该区域的细胞神经突已采集了倾转系列图像。E) 来自 (C) 和 (D) 倾斜系列数据重建的断层图像的 25 nm 厚切片。该断层图像中可见多种细胞器，如微管（紫色）、肌动蛋白（蓝色）、内质网（黄色）以及致密核囊泡（橙色）。也可观察到核糖体（红色）等大分子复合物。荧光图像为伪彩着色。(A)-(E) 中的比例尺嵌入于图像中。 请点击此处以查看此图的放大版本。

光子晶体图案的显微镜图像；光谱实验的光学分析装置。
图8：图案化过程中可能出现的问题示例。 在微图案化网格上沉积的标记ECM的荧光图像。(A) 由于PLPP凝胶分布不均，导致网格上的图案化不均匀。(B) 在图案化过程中，ECM无法黏附到被PDMS掩模覆盖的区域。(C) 网格上因总剂量过高而出现饱和梯度图案（右侧）或倒置图案（左侧）。(D) 由于图案化过程中紫外激光的反射，ECM不仅黏附在图案化区域，也黏附在网格条上。图像为伪彩色；输入图案显示在左下角；比例尺为100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

问题可能原因故障排除
微图案化
无法看到 PRIMO 激光的照明光• 光路未正确设置• 检查显微镜光路是否正确设置
• PRIMO 激光未开启或激光处于联锁状态
大量网格方格断裂• 操作过程中镊子或移液器接触了网格膜• 小心操作网格
• 网格在孵育或洗涤过程中干燥• 在洗涤和孵育过程中避免网格干燥
大面积无图案区域• 凝胶覆盖不充分• 添加凝胶时确保其均匀覆盖网格
• 图案化过程中网格膜失焦• 额外添加一微升凝胶
• 被掩模遮挡的区域• 每次图案化前检查焦点
• 小心将网格居中置于掩模内
图案过饱和或反转• 剂量不正确• 尝试不同总剂量进行图案化
• 凝胶覆盖不充分• 确保网格被凝胶均匀覆盖
• 尝试不同的灰度图案数值
图案模糊• 图案化过程中对焦不佳• 在与样品相同高度处重复 PRIMO 校准
• 校准不正确• 图案化前对网格膜进行对焦
• 将图案划分为更多区域进行图案化
细胞外基质（ECM）在图案外区域附着• 凝胶或灰尘产生的反射• 确保图案化前凝胶已干燥
• 确保盖玻片和物镜清洁
图案化后无法观察到细胞外基质（ECM）• 光漂白• 成像前尽量减少对 ECM 的光照暴露
• 图案化过程中剂量不正确• 尝试不同总剂量值进行图案化
• ECM 孵育时间不足• 延长 ECM 的孵育时间
细胞接种
细胞成团• 消化过度• 使用较低浓度的胰蛋白酶或缩短贴壁细胞的消化时间
• 细胞密度过高• 在较低汇合度下传代和/或消化细胞
• 细胞释放过程中避免剧烈震荡
• 轻柔吹打细胞悬液或使用细胞滤网
细胞未在图案化区域附着• 细胞外基质（ECM）不适合该细胞类型• 尝试不同浓度和组成的 ECM
• 接种前细胞活力下降• 确保细胞培养和细胞释放条件不会损伤细胞
细胞附着后未扩展• 细胞外基质（ECM）或图案不适合该细胞类型• 尝试不同图案和 ECM
• 在某些情况下，更连续的膜（R1.2/20 对比 R2/1）可能促进细胞扩展

表1：微图形化过程中可能出现的问题。 本表描述了用户在进行微图形化或细胞接种过程中可能遇到的一些问题，并针对每个问题提供了可能的原因及解决方案。部分问题的代表性图像见图8。

讨论

现代先进的电子显微镜和软件包现已支持高效的自动化冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集，可在数天内对数百至数千个位点进行靶向成像32,33,34,35。全细胞 cryo-ET 工作流程的一个主要限制因素是每张载网可采集的目标数量不足。近期，多个研究团队已开发出用于 cryo-EM 的载网微图案化技术方案，其中一项优势是提高了数据采集效率16,17,18。本文介绍了一种利用商业化微图案化系统对用于原代 Drosophila 神经元及培养的人源细胞系（未感染或呼吸道合胞病毒 RSV 感染）cryo-ET 研究的透射电镜（TEM）载网进行微图案化的方案。该微图案化系统具有高度灵活性，许多步骤可根据特定实验目标进行优化和调整。具备透射电镜和荧光显微镜操作经验的用户可快速掌握载网制备与微图案化技术。通过仔细练习，经过数次尝试后即可获得理想结果。下文将讨论用于 cryo-EM 的微图案化技术所具备的若干可选方案、用户需考虑的因素、潜在优势以及未来应用前景。

全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的一个重要考虑因素是电镜载网的选择。电镜载网由两部分组成：网架（或称结构支撑）和膜层（或称薄膜），后者是细胞生长的连续或带孔薄膜表面。铜网载网通常用于蛋白质及分离复合物的冷冻电镜分析，但由于铜具有细胞毒性，因此不适用于全细胞 cryo-ET。取而代之的是，细胞断层成像中通常使用金网载网。其他可选材料包括镍或钛，这些材料相比金可能具有更高的刚性16。电镜载网提供多种网孔尺寸，以适应不同应用需求。较大的网孔尺寸可在网格条之间为细胞生长提供更大空间，并增加适合倾转系列采集的区域，但代价是整体样品的机械强度降低。最常用的膜层是穿孔型或带孔的非晶碳膜，例如 Quantifoil 或 C-flat 载网。生物样品既可通过碳膜上的孔洞成像，也可通过电子可穿透的碳膜区域成像。像 R 2/1 或 R 2/2 这类载网，其孔径分别为 2 µm，孔间距分别为 1 和 2 µm，可提供大量孔洞，从而为数据采集提供较多潜在区域。然而，某些细胞可能在更均匀的表面上生长和扩展得更好，例如 R 1.2/20 载网或连续碳膜。对于后续采用聚焦离子束铣削（cryo-FIB）处理的样品，膜层将通过铣削去除，因此无需担忧底层薄膜的持续存在。与网架类似，其他材料制成的膜层也可获得，本文所述的图案化方案同样适用于 SiO2 载网。常用于全细胞 cryo-ET 的载网包括金质 Quantifoil 载网、连续碳膜载网以及 SiO2 膜 200 目载网（网格条间距约为 90 µm）。

在设计图案时需要考虑多个因素。其中大多数决策由细胞类型和实验目的决定。一个良好的起点是选择一种接近培养细胞形状和尺寸的图案。许多研究已证明，图案形状对细胞生长和细胞骨架排列具有显著影响13,36,37。如果图案设计可能改变研究目标，则需特别谨慎。针对每种细胞类型测试了多种图案，以确定哪些图案能够促进细胞黏附和生长。微图案系统的灵活性允许在同一个网格上测试多种图案，并在单个实验中为不同网格更换图案。较大的图案（约50–90 µm），例如本文所用的图案，可提高多个细胞黏附至图案单一区域的可能性，并允许细胞在黏附后充分展开和伸展。而在某些实验中，若细胞隔离比细胞扩展更为重要（例如聚焦离子束切割（cryo-FIB）实验），则更受限制的小型图案（20–30 µm）可能更为合适。对于断层成像应用，还需考虑倾转轴的影响。如果图案设计导致所有细胞沿单一方向平行生长，则当样品加载到显微镜载物台上时，所有细胞可能恰好垂直于倾转轴，从而导致数据质量下降。

在无图案的载网上，细胞通常优先黏附于载网条上，而这些区域无法通过透射电子显微镜（TEM）成像。即使在具有图案的载网上，也常观察到细胞位于载网方格的角落，部分覆盖在图案化碳膜上，部分覆盖在载网条上。最近，已有研究利用微图案技术有意将细胞的一部分定位在载网条上方18。对于无需整个细胞周边都位于碳膜上的实验，这种方法可以被考虑采用。对于某些可生长至超过单个载网方格大小的细胞（例如培养多天的原代神经元），这一点尤为重要。

有许多工具可用于设计图案。此处将图案限制在任一维度均小于800像素，以确保该图案可旋转至任意角度后，仍能完全位于该微图案系统单次投影所能覆盖的最大面积范围内。这使得用户能够将图案旋转至与载物台网格正确对齐的方向，而无需考虑显微镜下网格的实际朝向。本示例中，网格被划分为六个独立的图案区域。主要目的是在网格的不同区域之间进行焦距调整。特别是金质网格，其材质较软，可能无法完全平整地贴合在玻璃表面。精确的焦距对于获得清晰、精细的图案至关重要。通过使用分段式图案，即使在图案化过程中网格发生轻微位移，也仅需对图案位置进行微小调整即可；不过，在使用PLPP凝胶与PDMS掩模时，此类位移通常不会发生。最后，网格中央的四个方格保持未图案化状态。这有助于用户清晰识别网格中心位置，在进行关联成像实验时尤为有用。

该微图形化系统的图形设计软件 Leonardo 还具备更高级的功能，例如拼接以及导入 PDF 格式图形，但这些功能超出了本实验方案的范围。该软件还包括微结构检测和自动图形定位功能，可用于透射电子显微镜（TEM）载网。当载网非常平整，且无需在不同区域之间调整焦距即可进行图形化时，此功能最为适用。

选择一种细胞外基质（ECM）蛋白可能对细胞黏附和扩增产生显著影响。已知某些细胞在特定基质上培养时会发生生理变化38。对于任何新的细胞类型，应根据文献中已报道的前期研究，测试多种ECM蛋白及其浓度。层粘连蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和胶原蛋白在细胞培养中被广泛使用，若缺乏其他数据，可将其作为起始选择。然而，若常用ECM蛋白无法为细胞提供适当的黏附特性，则还必须考虑其他ECM蛋白。这一点对于原代果蝇（Drosophila）神经元尤为明显，因其需要高浓度的植物凝集素刀豆蛋白A才能实现良好的细胞黏附。可通过在玻璃培养皿或载玻片上进行图案化处理，来检测细胞黏附与生长对ECM的兼容性，然后再过渡到透射电镜（TEM）载网。如果需要检测大量组合，这种预筛选方法在时间和成本上均具有优势。加入荧光标记的ECM蛋白有助于评估图案化是否成功及其质量。

细胞接种是全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中最为关键的步骤之一，无论是否采用微图案化技术6,16,39. 用于初级 黑腹果蝇 或其它神经元，这些细胞脆弱、在悬浮状态下不稳定，且数量可能有限，因此相较于受监控的连续细胞接种，更倾向于采用单次接种方法。按照本方案所述，在优化的细胞密度下进行单次接种步骤， 果蝇 神经元，对于大多数细胞类型而言是一种可行的选择。然而，也可以在较低的初始浓度下将细胞接种至基质，并按照本文及其他文献所述的方法，以受控方式逐步添加更多细胞18这种顺序接种在某些情况下可提供更一致的结果。与常规细胞培养类似，在分离过程中应始终注意维持细胞活力，并尽量减少细胞聚团。

初次进行微图形化实验时，存在一些可能严重影响最终结果的潜在问题。成功的最关键因素包括：小心操作载网、采用无菌技术、确保PLPP凝胶均匀分布、图案化过程中使用适当的剂量和正确的聚焦，以及在接种前维持细胞活力。以下列出了一些潜在问题及其解决方案： 表1.

微图案化网格可用于帮助定位细胞，以在网格上建立一致的细胞密度，并将感兴趣区域置于适合倾转系列图像采集的位置16,18。细胞的排列和定位可作为冷冻光电关联显微镜（cryo-CLEM）实验中的标志点，从而减少对易损的定位网格和荧光标志点的依赖。然而，需要注意的是，此类标志点在亚微米精度的关联定位中可能仍然具有重要作用29,40。此外，孤立细胞的均匀分布对于聚焦离子束切割（cryo-FIB）实验也极为有利，可最大化可切取薄片（lamella）的细胞数量16。

将微图案技术引入冷冻电镜工作流程将显著提高数据通量，并可能实现新的实验。随着该技术的进一步推广和发展，微图案技术将拓展出更高级的应用，包括细胞外基质梯度、多种细胞外基质沉积以及微结构组装，从而进一步增强冷冻电子断层扫描技术在完整细胞环境中研究生物靶标和生物过程的能力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系的Jill Wildonger博士、Sihui Z. Yang博士和Josephine W. Mitchell女士慷慨提供elav-Gal4、UAS-CD8::GFP果蝇品系（布卢明顿果蝇中心，#5146）。我们还要感谢Alvéole公司的Aurélien Duboin博士、Laurent Siquier先生和Marie-Charlotte Manus女士，以及Nanoscale Labs的Serge Kaddoura先生在本项目期间提供的大力支持。本研究部分由威斯康星大学麦迪逊分校、该校生物化学系以及美国国立卫生研究院（NIH）向E.R.W.资助的公共卫生服务基金R01 GM114561、R01 GM104540、R01 GM104540-03W1和U24 GM139168，以及向P.W.S.资助的R01 AI150475支持。本研究的部分工作由NIH基金U24 GM129547资助，并在俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的PNCC进行，通过EMSL（grid.436923.9）完成，EMSL是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。我们还感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系冷冻电镜研究中心提供的设施与仪器支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸SigmaP8920-100ML
0.22 µm 注射器滤器，PVDF 膜Genesee25-240
22x60-1 玻璃盖玻片Fisher12545F
5/15 镊子EMS (Dumont)0203-5/15-PO
抗生素-抗真菌素（100X）ThermoFisher (Gibco)15240096
BEAS-2B 细胞ATCCCRL-9609
牛胶原蛋白 I 型ThermoFisher (Gibco)A1064401
刀豆蛋白 A，Alexa Fluor 350 标记物ThermoFisher (Invitrogen)C11254
DMEMFisher (Lonza)BW12-604F
EtOHFisher (Decon Labs)22-032-600
胎牛血清ATCC30-2020
人血浆纤维蛋白原，Alexa Fluor 647 标记物ThermoFisher (Invitrogen)F35200
牛血浆纤连蛋白蛋白ThermoFisher (Gibco)33010018
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-20-C
葡萄糖VWR0643-1KG
载网制备夹具EMS71175-01
HeLa 细胞ATCCCCL-2
血细胞计数板Fisher (SKC, Inc.)22600100
HEPESFisher (ACROS Organics)AC172572500
Hoechst 33342ThermoFisher (Invitrogen)H3570
胰岛素Fisher (Sigma Aldrich)NC0520015
KClMP Bio194844
KH2PO4Fisher (ACROS Organics)AC212595000
Leica-DMi8Leica Microsystems可根据需要配备相机、载物台和物镜附件
LeonardoAlvéolehttps://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase 研究级酶Fisher (Supply Solutions)50-100-3280
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒ThermoFisher (Invitrogen)L3224
显微镜相机HammamatsuC13440-20CU
电动载物台Märzhäuser Wetzlar00-24-599-0000
NaClFisher (Fisher BioReagents)BP358-1
NaH2PO4Fisher (ACROS Organics)AC207802500
NaOHFisher (Alfa Aesar)AAA1603736
PBSCorning21-040-CV
PDMS 模板nanoscaleLABSPDMS_STENCILS_EMhttps://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVAnanoscaleLABSPEG-SVA-1GRmPEG-琥珀酰亚胺戊酸酯，分子量 5,000
青霉素Fisher (Research Products International Corp)50-213-641
pH 试纸Fisher (Millipore Sigma)M1095350001也可使用 pH 探针
PLPP 凝胶nanoscaleLABSPLPP-GEL-300ULhttps://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMOAlvéolehttps://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F（含 RSV A2-mK+ 抗基因组 cDNA 的 BAC）BEI ResourcesNR-36460https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil 载网EMS (Quantifoil)Q2100AR12 µm 孔，间距 1 µm，其他尺寸也可提供
RPMIFisher (Lonza)BW12-702F
RSV A2-mK+参见 pSynkRSV-19F 条目-见 Hotard 等人 [22]。可由 pSynkRSV-ll9F 构建获得
Schneider 培养基ThermoFisher (Gibco)21720-024
SerialEMSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
直头镊子EMS (Dumont)72812-D
链霉素Fisher (Fisher BioReagents)BP910-50
蔗糖Avantor4097-04
四环素SigmaT8032-10MG
Titan Krios 电子显微镜ThermoFisher300 kV，配备直接电子探测器相机和能量过滤器
胰蛋白酶ThermoFisher (Gibco)15090046
试管旋转仪/混匀仪Fisher (Thermo Scientific)11676341
UAS:mcD8:GFP 果蝇品系Bloomington 果蝇品系中心5146http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html

参考文献

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