微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

随着冷冻电子显微镜（cryo-EM）的发展，扩展和多功能性，研究人员已经检查了从大分子（〜1nm）到高（〜2 Å）分辨率的近乎天然状态的各种生物样品。单颗粒冷冻电镜和电子衍射技术分别应用于溶液或结晶状态下的纯化大分子^1，2。而冷冻电子断层扫描 （cryo-ET） 特别适用于大型异源物体（如细菌、多态病毒和真核细胞）的近天然结构和超微结构研究³。在冷冻电子断层扫描中，通过物理倾斜显微镜载物台上的样品并以不同角度通过样品获取一系列图像来获得三维（3D）信息。这些图像或倾斜系列通常以 1 到 3 度的增量覆盖 +60/-60 度的范围。然后，倾斜序列可以通过计算重建为3D体积，也称为断层扫描^图4。

所有冷冻电镜技术都要求将样品嵌入一层薄薄的无定形、非结晶玻璃体冰中。最常用的冷冻固定技术之一是浸入式冷冻，其中将样品施加到EM网格上，转印并迅速浸入液体乙烷或液体乙烷和丙烷的混合物中。该技术足以对厚度为<100nm至~10μm的样品进行玻璃化，包括培养的人细胞，如HeLa细胞^5，6。厚度达 200 μm 的较厚样品，如微型类器官或组织活检，可通过高压冷冻进行玻璃化⁷。然而，由于较厚样品的电子散射增加，在300 kV透射电子显微镜中，冷冻ET的样品和冰厚度限制为~0.5 - 1μm。因此，许多真核细胞的全细胞冷冻ET仅限于细胞的外围或细胞的延伸，除非使用额外的样品制备步骤，例如冷冻切片⁸ 或聚焦离子束研磨^9，10，11。

许多全细胞冷冻 ET 成像实验的局限性是数据收集通量¹²。与单颗粒冷冻电镜不同，在单颗粒冷冻电镜中，通常可以从单个TEM网格正方形成像数千个孤立的颗粒，细胞很大，分散，并且必须以足够低的密度生长，以使细胞保存在薄薄的玻璃体冰层中。通常，感兴趣的区域仅限于单元的特定特征或子区域。进一步限制通量的是细胞倾向于生长在不适合TEM成像的区域，例如TEM网格条上或附近。由于TEM网格上的细胞培养具有不可预测性，因此需要技术发展来改善样品的可访问性和数据采集的通量。

使用贴壁细胞外基质（ECM）蛋白进行底物微图案化是一种成熟的活细胞光学显微镜技术，用于指导细胞在刚性，耐用和光学透明的表面上的生长，例如玻璃和其他组织培养底物^13，14。在柔软和/或三维（3D）表面上也进行了微图案化。这种技术不仅允许细胞的精确定位;他们还支持多细胞网络的创建，例如模式化神经细胞回路¹⁵。将微图案引入冷冻ET不仅可以提高通量，还可以为探索复杂和动态的细胞微环境开辟新的研究。

最近，一些小组已经开始通过多种方法在TEM网格上使用微图案化技术^16，17。在这里，使用Alvéole PRIMO微图案系统描述了TEM网格的无掩模光图案技术的使用，该系统具有高分辨率和非接触式图案化。使用这种微图案系统，在基板顶部施加防污层，然后应用光催化剂并用紫外激光在用户定义的图案中烧蚀防污层。然后可以将ECM蛋白添加到模式中以进行适当的细胞培养。该方法已被几个小组用于视网膜色素上皮-1（RPE1），Madin-Darby犬肾-II（MDCKII），人包皮成纤维细胞（HFF）和内皮细胞系的冷冻ET研究^16，17，18。该微图案系统与多种防污层基板以及液体或凝胶光催化剂试剂兼容。可以从细胞系的特异性中选择并适应各种ECM蛋白，从而为用户提供多功能性。

微图案化已成功应用于实验室内的多个项目¹⁹。本文提出了一种微模式方案，包括研究培养的HeLa细胞，呼吸道合胞病毒（RSV）感染的BEAS-2B细胞和原代幼虫 果蝇黑色素加星 神经元的特定适应性²⁰。

这里描述的方案是Wright实验室和威斯康星大学麦迪逊分校Cryo-EM研究中心使用的细胞培养，微图案和成像方法的汇编。工作流如图 1 所示。以下站点提供其他培训和教学材料:https://cryoem.wisc.edu 或 https://wrightlab.wisc.edu

1. 准备用于图案化的网格

1. 将TEM网格转移到干净的载玻片上，碳面朝上（碳箔的标准厚度为12nm）。使用碳蒸发器 ACE600，将 5-8 nm 的额外碳蒸发到网格上，以提高整体碳膜的耐用性。
   注意:对于 _SiO2 网格，此步骤不是必需的。此步骤也可以提前完成;将涂层网格存放在低湿度环境中，如真空干燥器。
2. 将网格转移到网格准备支架上，并将网格碳面朝上释放辉光。使用辉光放电系统，在10 mA下辉光放电网格60秒，工作距离为80 mm，真空压力为1.0 x ^10-3 mbar。在下一步后的15-30分钟内完成此操作。
   注意:网格准备支架可以商业购买或自制，并在小培养皿上使用一张滤纸自制。

2.防污层的应用

注意:处理网格时应使用适当的无菌技术，并且所有溶液都应无菌和/或过滤器灭菌。

1. 将网格（碳面朝上）转移到干净的载玻片或盖玻片上，网格之间至少有1厘米的距离。将10μL0.05%聚-L-赖氨酸（PLL）移液到每个网格上。将网格在潮湿的室内孵育至少30分钟，例如带有湿纸巾的封闭塑料盒。
   注意:此步骤可以延长到一夜之间。确保腔室中的湿度水平足以防止网格变干。
2. 用15μL 0.1 M HEPES pH 8.5洗涤每个网格三次。每次洗涤时，用移液器从网格中除去大部分液体，不要让网格干燥。加入15μL新鲜缓冲液，孵育至少30秒并重复。在最后一次洗涤后，将每个网格留在15μL0.1 M HEPES中。
   注意:在本步骤和后续步骤中，保持网格湿润并避免移液器与网格之间的接触非常重要。
3. 为每个网格制备10μL100mg / mL聚乙二醇琥珀酰戊酸（PEG-SVA）在0.1 M HEPES pH 8.5中。PEG-SVA通过温和混合会迅速溶解，从而产生透明的溶液。
   注意:不要提前准备PEG-SVA溶液。PEG-SVA在pH 8.5下的半衰期为10分钟。避免将PEG-SVA储备物暴露在过多的水分中，将其储存在-20°C的干燥器或干燥环境中，并在开封前升温至室温。
4. 制备PEG-SVA溶液后，立即从每个网格中取出15μLHEPES pH 8.5滴（注意不要干燥网格），并加入10μLPE-SVA溶液滴。将网格在潮湿的室内孵育至少1小时。
   注意:此步骤可以延长到一夜之间。确保腔室中的湿度足以防止网格变干。
5. 用15μL无菌水洗涤每个网格三次。对于每次洗涤，用移液器从网格中除去大部分液体而不让网格干燥，加入15μL淡水，孵育至少30秒并重复。最后洗涤后，将每个网格留在15μL水中。

3. 涂抹PLPP凝胶

1. 为每个网格准备一个干净的显微镜盖玻片。对每个网格完成以下步骤，一次一个网格，以最大程度地减少网格干涸的可能性。
2. 在盖玻片的中心放置一滴1.0μL水，以帮助将网格放在盖玻片上并保持网格湿润。小心地将网格从15 μL水滴转移到盖玻片上的1.0 μL水滴。确保将网格碳侧朝上放置。
3. 小心地将聚二甲基硅氧烷（PDMS）钢网放置在网格上，注意保持网格居中，并尽量减少钢网与网格碳箔的接触。
4. 将1.0μL4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵（PLPP）凝胶加入网格中。轻轻移液器混合（不要用移液器吸头触摸网格）。
5. 将带有网格的盖玻片移动到黑暗位置以干燥。凝胶将在大约15-30分钟内干燥。

4. 微模式的校准和设计

1. 用荧光笔为玻璃盖玻片的一面着色。从细尖永久标记中添加黑线，使对焦更容易。将盖玻片放在显微镜上，使彩色面朝向物镜。使用明场模式，将焦点放在荧光笔上。
2. 确保显微镜和微图案系统已通电，并设置了正确的光路。在显微镜计算机上打开微观管理器和莱昂纳多软件（插件>莱昂纳多）。
3. 选择校准，然后按照屏幕上的说明操作。调整显微镜焦点，使投影到载玻片上的图像对焦。暴露时间可能需要缩短。校准后，选择" 立即图案"。
4. 记录程序左上角窗口中校准数据下报告的千分尺/像素（μm/px）比率（图2，区域1）。使用此比率可确定在设计图案时每微米要使用的像素数。
5. 校准后，确保软件现在已打开，从显微镜获得实时明场视图。将盖玻片（第3部分）上准备好的网格加载到舞台上，网格朝向物镜。放置载物台并调整焦点，使网格在软件窗口中可见。
6. 以微米为单位测量网格正方形和网格条的大小。该软件包括一个由左下角附近的按钮激活的标尺，用于测量网格（图2，区域2）。例如，此处用于 200 目网格的模式对应于 ~87 × 87 μm 网格正方形和 ~36 μm 网格条。
   注:该软件可以灵活地动态调整模式的大小，因此可以容忍测量中的轻微不准确。
7. 根据上述测量和比率，使用任何图像创建软件创建图案。20×物镜的最小特征尺寸为1.2 μm。模式应另存为未压缩的 8 位.tiff文件。
   1. 确保软件在保存时不会将图像重新缩放到不同的像素大小。图案应适合 800 × 800 像素的框内，足以覆盖四个网格正方形。
      注意:值为 255（白色）的像素将以最高强度（激光的总剂量）进行图案化，值为零（黑色）的像素将不进行图案化。任何具有中间值的像素都将以大约（X/ 255）*总剂量的剂量进行图案化。在 图3A中，灰度图案使用像素值255和129。一旦设计了模式，就可以保存并重复使用，而无需修改。

5. 微图案化

1. 校准后，确保软件现在已打开，从显微镜获得实时明场视图。将盖玻片（第3部分）上准备好的网格加载到舞台上，网格朝向物镜。定位舞台并调整焦点以查看软件中的网格。
2. 对于初始运行，请设计一个新模板。在软件中，选择 "添加 ROI "（未显示，在 图 2 区域 3 的位置），然后选择一个 3，000 μm 的圆圈。使用屏幕上的明场图像作为指导，将圆圈ROI放置在网格上。按锁定以确保投资回报率。
3. 将 ROI 锁定到位后，选择" 添加模式" （未显示，位于 图 2 区域 3 的位置）。选择第 4 节中设计的图案。将网格划分为六个区域，以允许在每个区域中独立聚焦和定位，以考虑不均匀的网格。一个 8 ×网格的每个角有 8 个网格正方形区域，中心每侧有一个 2 × 8 个网格方块区域，使中心四个网格正方形保持无图案（图 2，中心图）。
4. 使用复制选项（图 2，区域 4）生成初始模式的副本，以达到所需的模式总副本数。如有必要，调整副本之间的间距以匹配网格正方形之间的间距。
5. 设置 图案的总剂量 。30 mJ/^mm2 是一个很好的起点。有关更多详细信息，请参阅讨论部分。
6. 在 "专家选项" （图 2，区域 4）下，调整区域的角度以匹配网格正方形的角度。可以使用鼠标重新定位区域。图案的比例（大小）也可以调整。通过调整图案的角度、位置、间距和比例进行迭代，直到图案与网格正方形对齐。移动显微镜载物台以更改实时明场显示器中的网格区域。
7. 按 "锁定" 保存对区域所做的更改。
8. 要复制某个区域，请在左侧的"动作"面板中单击其名称旁边的"复制"按钮（图 2，区域 5，两张纸图标）。要重新定位、重命名或编辑副本，请在"动作"面板中单击其名称。
9. 根据需要重复步骤 5.4-5.9 以填充所有所需区域。
10. 设计和定位完整的模板后，将模板文件 保存 在软件中（图 2，区域 6，顶部工具栏中带有向上箭头图标的栏）。
11. 加载以前保存的模板（带有向下箭头图标的条形）时，将 ROI 居中放在网格上，然后按 Lock。单击 "操作面板" 中的每个区域以更改角度、位置、剂量和/或图案文件。
12. 定位模板和模式后，在软件的 "操作面板" 中取消选中除一个区域之外的所有区域。
13. 使用显微镜载物台导航到该区域并聚焦在碳箔上。单击"动作"面板中的"眼球"图标（图 2，区域 5）将打开或关闭图案叠加的显示。
14. 网格对焦后，关闭明场快门，然后按软件右下角的 "播放 "图标开始图案化过程，可以实时监控。
15. 在操作面板中，选中下一个区域的框。打开明场快门，使网格可见，并使用显微镜载物台将该区域居中。对 操作面板中的每个区域重复步骤 5.13-5.14。
16. 从显微镜中取出带有网格的盖玻片，并立即将10μL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）移液到网格上。
17. 10分钟后，用镊子取出模板，然后用15μLPBS洗涤网格3次。最终洗涤后，将每个网格置于15μLPBS中，并将网格移动到黑暗位置。

6. ECM蛋白的沉积

1. 对于培养的细胞，请遵循步骤6.2-6.5;对于原发 性果蝇 神经元，请遵循步骤 6.6-6.10。
2. 为每个网格准备至少15μL的ECM。对于BEAS-2B细胞，在无菌PBS中制备终浓度为0.01mg / mL牛纤连蛋白和0.01mg / mL荧光团偶联纤维蛋白原。对于HeLa细胞，在无菌PBS中制备0.01mg / mL牛胶原I和0.1mg / mL荧光团结合纤维蛋白原。
3. 从每个网格中取出大部分PBS，并应用15μL的ECM。将电网在室温下的潮湿室中孵育至少1小时。
   注意:该步骤可以在4°C下延长至过夜。
4. 在 ECM 中孵育后，用无菌 PBS 洗涤每个网格 5 次。每次洗涤时，用移液器除去大部分液体，不要让网格干燥，加入15μL新鲜PBS，孵育至少30秒，然后重复。在最终洗涤后，将每个网格留在PBS中。
   注意:网格可以在4°C的PBS中储存长达一周，而不会观察到质量下降。
5. 使用荧光显微镜检测ECM中的荧光团，以确认图案化以及碳箔保持完整。一些破碎的方块通常是可以容忍的。
6. 对于原发 性果蝇 神经元，将图案网格移动到含有无菌PBS的30毫米玻璃底皿中。
7. 从培养皿中吸出PBS，并施用2mL 0.5mg / mL荧光团偶联的康那瓦林A.在无菌环境中在25°C孵育过夜。
8. 从培养皿中取出康那瓦林A溶液（不干燥网格），并用PBS洗涤网格3次。每次洗涤时，从培养皿中加入并取出 2 mL PBS。
9. 使用荧光显微镜检测ECM中的荧光团，以确认图案化以及碳箔保持完整。一些破碎的方块通常是可以容忍的。
10. 最后洗涤后，从玻璃底培养皿中取出PBS，加入2mL新鲜制备的，无菌过滤的补充施耐德果蝇^培养基21，含有20%热灭活胎儿牛血清（FBS），5μg/ mL胰岛素，100μg/ mL青霉素，100μg/ mL链霉素和10μg/ mL四环素。在无菌环境中孵育25°C，直到神经元准备好接种。

7. 接种前原代 果蝇 细胞的制备

1. 用70%EtOH对55mm解剖皿进行灭菌，然后将2-3mL无菌过滤的1×解剖盐水（9.9mM HEPES pH 7.5，137mM NaCl，5.4mM KCl，0.17mM _NaH2PO4，0.22mM _KH2PO4，3.3mM葡萄糖，43.8mM蔗糖）²¹。
2. 使用一对镊子从^食物中轻 轻挑选30-40个3龄幼虫。
3. 将幼虫放入具有1×PBS的管中，然后将它们转移到具有1×PBS的第二管中以洗涤幼虫。
4. 将幼虫转移到具有70%EtOH的管中以洗掉PBS，然后将它们转移到具有70%EtOH的第二管中。将幼虫留在第二管中2-3分钟以对幼虫进行灭菌。
5. 将幼虫转移到具有1×解剖盐水的管中，然后立即将它们转移到具有1×解剖盐水的第二管中。
6. 将单个幼虫转移到含有1×解剖盐水的解剖皿中。用一对镊子和一台解剖显微镜，快速撕裂每个幼虫以提取大脑，并用1×解剖盐水将其转移到第三管。重复此步骤，直到提取所有大脑。
7. 将含有大脑的管子以300× g 离心1分钟。
8. 弃去上清液，用1mL的1×解剖盐水洗涤，并以300×g离心管1分钟。再次重复此步骤。
9. 弃去上清液，直到200-250μL留在管中，并在1x解剖盐水中加入20μL2.5mg / mL Liberase。
10. 在室温下旋转管子在旋转器上旋转1小时;在此期间，每10分钟移取溶液25-30次。到最后，溶液应该稍微不透明。
11. 将细胞以300× g 离心5分钟。
12. 弃去上清液，然后加入1 mL补充的施耐德培养基。将溶液移取30次以混合。
13. 将细胞以300× g 离心5分钟。
14. 弃去上清液，并通过加入1mL补充的施耐德培养基洗涤细胞沉淀。将溶液移取30次以混合。
15. 将细胞以300× g 离心5分钟。
16. 弃去上清液，然后用300μL补充的施耐德培养基重悬细胞沉淀。将溶液移取30-40次以混合。

8. BEAS-2B和HeLa细胞的培养和RSV感染

1. 将HeLa细胞和BEAS-2B细胞维持在37°C和5%CO ₂的T75烧瓶中。每3-4天传代细胞一次达到约80%的汇合度。维持HeLa细胞在DMEM + 10%FBS + 1×抗生素 - 抗真菌剂。维持BEAS-2B在RPMI + 10%FBS + 1×抗生素 - 抗真菌药^6，22，23。
2. 对于未感染细胞的接种，请跳到第9部分。BEAS-2B和HeLa细胞容易受到RSV感染;BEAS-2B细胞用于此处显示的涉及RSV的所有实验。
   注意:使用适当的生物安全柜（BSC）和个人防护装备（PPE），按照机构规程执行所有BSL-2步骤。
3. 在细胞RSV感染之前，将5×¹⁰⁴ 个细胞每孔传代到具有2mL生长培养基的6孔板（表面积〜9.6 cm ²）中并孵育过夜。
4. 胰蛋白酶消化并计数一个细胞孔。要进行胰蛋白酶消化，从一个孔中吸出培养基，并用2 mL不含Mg2 ^{+和Ca2 +}的无菌PBS洗涤以除去残留的培养基。加入500μL0.25%胰蛋白酶溶液。在37°C孵育5-10分钟。定期检查细胞，看看它们是否从表面释放出来。一旦细胞被释放，加入1.5mL培养基。
5. 将100μL胰蛋白酶消化细胞与100μL台盼蓝混合。将10μL稀释的细胞混合物移液到血细胞计数器中。计算细胞数并计算每个孔的细胞数。使用此数字在下面计算 MOI。
6. 在生长培养基中制备RSV-A2mK + ²⁴ 的稀释液，以在750μL培养基中达到每孔10的MOI。RSV-A2mK+的MOI可以通过储备的荧光聚焦单位（FFU）滴度计算（例如:对于1.0×每孔¹⁰⁵ 个细胞和1.0×¹⁰⁸ FFU / mL的RSV储备，将病毒储液稀释1:75至1×¹⁰⁶ FFU / 750μL或1.33×¹⁰⁶ FFU / mL）。
7. 从6孔培养皿中的细胞中吸出培养基，并从上方向每个孔中加入750μL病毒溶液。
8. 在室温下摇动板1小时。
9. 1小时后，将每孔的总体积提高到2mL，将生长培养基预热至37°C，并将板置于设置为37°C的培养箱中，其中5%CO ₂₆ 小时。
10. 胰蛋白酶消化细胞以释放它们并继续接种，如下所述。播种后，在冷冻前将网格再孵育18小时（感染后总共24小时）。

9. 细胞接种到微图案网格上

1. 对于培养的细胞，请遵循步骤9.2-9.8;对于原发 性果蝇 神经元，请遵循9.9-9.11。
2. 胰蛋白酶消化细胞以释放它们（参见上面第8节中的步骤4）。为了减少细胞聚集，胰蛋白酶消化细胞以60%或更低的汇合度。
3. 将100μL胰蛋白酶消化细胞与100μL台盼蓝混合。将10μL稀释的细胞混合物移液到血细胞计数器中并计数细胞。
4. 将培养基中的细胞稀释至2×¹⁰⁴ 个细胞/ mL。
5. 将1μL培养基加入30 mm玻璃底皿的中心，以帮助放置网格并防止其干燥。将网格从盖玻片上的PBS转移到玻璃底盘的中心。将10μL细胞溶液加入网格中。
6. 使用明场显微镜，观察5分钟后细胞粘附到网格上。如果大多数图案仍然未被占用，则再加入10μL细胞溶液滴。在孵育期间将网格和细胞溶液保持在37°C。
7. 重复步骤 9.6，直到大多数模式被占用或许多已占用的模式开始具有多个单元格。在培养箱（37°C，5_{%CO 2}）中孵育网格2小时。
8. 用2 mL预热的培养基淹没培养皿并孵育过夜（37°C，5%CO ₂）。
9. 对于原发 性果蝇 神经元，从含有网格的培养皿中取出培养基并将细胞平板到培养皿上。
10. 等待30-60分钟，让细胞附着，然后加入2毫升补充的施耐德培养基。
11. 在25°C培养箱中培养神经元至少2-3天，然后沉入冷冻。

10. 图案网格的成像和玻璃化

1. 将含有图案网格和培养细胞的玻璃底培养皿放在荧光显微镜上。
2. 使用明场和适当的荧光通道获取网格图像，以检测细胞中的图案和任何其他标记。确保细胞密度和定位适合下游成像和分析。
   注:明场和荧光图像在斐济软件包中处理²⁵。
3. 准备一个低温冰箱;冷冻设备的类型将取决于最适合样品的可用性，成本和功能。
   注意:原发 果蝇 神经元在自动沉降冷冻机上制备，BEAS-2B细胞使用半自动沉降冷冻机制备。
4. 将金基准应用于样品，以使倾斜系列正确对齐。将样品吸走以除去多余的介质，然后将样品放入冷冻剂中，例如由液氮冷却的液体乙烷。对于原发 性果蝇 神经元，从背面印迹4秒。对于HeLa和BEAS-2B细胞，从两侧印变4-6秒。然后，冷冻的网格可以储存在液氮中，直到进一步使用。
5. 在冷冻电子显微镜中对玻化细胞进行成像，使用直接电子探测器相机在300 kV下操作。使用SerialEM26等软件为每个感兴趣的区域设置倾斜系列收集，用于冷冻电镜/冷冻ET数据收集。
   注意:在-60°至60°的直接电子探测器上以2°的增量以-8μm散焦的增量在-8μm散焦下从-60°双向收集原始 果蝇 神经元的倾斜系列，总剂量为70-75 e^-/ ^Å2。在带有能量滤波器（20 eV狭缝）的直接电子探测器上收集RSV感染的BEAS-2B的倾斜系列，散焦为-5μm，像素尺寸为4.603 Å，总剂量约为80 e^-/^Å2。
6. 处理倾斜系列以重建断层扫描图。
   注:此处介绍的断层扫描是使用IMOD软件包²⁷重建的;低通滤波是使用EMAN2软件包²⁸完成的。

该程序用于全细胞冷冻ET实验的EM网格图案。本研究中提出的整个工作流程，包括初始细胞培养制剂，微图案化（图1）和成像，包括3-7天。使用两步程序通过向电网施加PLL并随后通过添加反应性PEG-SVA来连接PEG来生成防污层。防污层也可以通过在一次孵育中添加PLL-g-PEG来单步施用。PLPP凝胶是紫外微图案化的催化剂，也可以作为浓度较低的液体使用。与液体相比，凝胶允许以显着减少的剂量进行图案化，从而实现更快的图案化。使用该系统，完整TEM网格的实际图案化时间约为2分钟。仅微图案化工作流程通常跨越5-6小时，并允许个人在TEM网格上为标准细胞培养设计八个网格。

微模式化过程中的许多步骤需要较长的孵育时间（参见步骤2.1，2.3，6.4）。方便的是，其中一些步骤，如PLL钝化（2.1）或PEG-SVA钝化（2.3），可以扩展到过夜孵育。此外，网格可以预先图案化并储存在ECM蛋白或PBS的溶液中以供以后使用。在我们的研究中，这些选择在细胞制备和接种时间至关重要的情况下是有价值的，例如原发 果蝇 神经元和BEAS-2B细胞的RSV感染。

使用清洁工具，无菌溶液在一般生物安全2级（BSL-2）实验室环境中制备网格，并在生长培养基中包括抗生素/抗真菌药6，22，29，30。对于对微生物污染特别敏感的样品，防污层和ECM可以应用于组织培养罩或其他无菌环境。此外，网格可以在图案化和ECM应用之间用乙醇洗涤。如果使用传染性病原体，重要的是要调整程序以符合适当的生物安全协议。

该工作流程和所呈现的程序（图1）允许将HeLa细胞（图4），RSV感染的BEAS-2B细胞（图3， 图5）和原代 果蝇 幼虫神经元（图6， 图7）接种到图案化的EM网格上，以实现最佳的冷冻ET数据收集。

接种到微图案TEM网格上的HeLa细胞仍然存活，通过使用基于钙黄素-AM和乙锭同源二聚体-1的细胞活力测定法的荧光染色来确定（图4A，B）。使用胶原和纤维蛋白原的混合ECM，HeLa细胞很容易粘附在整个网格中的模式（图4A，C）。沿着模式扩展的细胞的整体形态与在无图案网格上生长的细胞相似（图4C，D）。在HeLa细胞的情况下，总细胞厚度保持在〜<10μm，在细胞外围附近显着变薄〜<1μm厚（图4E，F）。

对于RSV研究，我们使用梯度对整个网格正方形进行图案化，边缘有低剂量暴露，中心有较高剂量的模式（图3A）。梯度模式在搜索存在于细胞外围附近的释放病毒时产生了更好的结果。通过这些模式，发现细胞优先粘附于较高的ECM浓度，但也能够在较低的ECM浓度下粘附和生长。当使用需要多次剂量的模式时，需要优化区域之间的相对剂量。如果剂量和ECM浓度彼此过于相似或太不同，则使用多种剂量的效果将丧失。

在 图3中，对TEM网格进行了图案化，随后接种了RSV感染的BEAS-2B细胞，并用于冷冻电镜数据收集。 图4A 是使用梯度图案在TEM网格上图案化的ECM荧光图像。细胞粘附和生长沿着模式的中心区域可以在 图3B 中看到细胞在接种后18小时的明场图像。在 图3C中，来自RSV-A2mK+复制的荧光信号（红色）与来自ECM的信号叠加在一起。大多数受感染的细胞位于梯度模式的高密度中心区域。冷冻固定后网格的低磁透射电图显示许多细胞，包括RSV感染的细胞，位于网格正方形中心附近的碳箔上。如前所述，对于在标准TEM网格上生长的细胞22，倾斜系列被定位并收集RSV病毒粒子，靠近在微图案网格上生长的受感染BEAS-2B细胞的外围（图5A，B）。许多RSV结构蛋白可以在断层扫描中鉴定，包括核衣壳（N）和病毒融合蛋白（F）（图5C，分别为蓝色和红色箭头）。

对于主要的 果蝇 神经元研究，发现狭窄的图案，接近软件提供的分辨率极限（图案的厚度为2μm），允许在网格正方形内分离一个到几个细胞（图6）。神经元体细胞能够在模式内的几天内延长其神经突起。与在无图案网格上培养的神经元相比，这允许轻松识别和倾斜串联获取神经突起（图7）。还发现荧光标记的康康那瓦林A，一种已被用作 体外果蝇 神经元培养物的ECM的凝集素20，21，适合于图案化。

根据先前发表的协议分离来自三龄幼虫的果蝇神经元20，21，31。将神经元制剂应用于微模式冷冻电镜网格，其中康卡伐林A沉积在图案上以调节细胞放置，扩散和组织。允许图案化或无图案网格上的神经元至少孵育48-72小时，然后将网格骤降冷冻。图6A显示了分布在图案化区域中的几个果蝇神经元的微图案EM网格的代表性图像。这些神经元来自在膜中具有泛神经元GFP表达的转基因苍蝇菌株，可以很容易地通过光学显微镜跟踪，不仅因为它的荧光标记，还因为它在微模式中的位置。虽然在未图案网格上培养的神经元也可以通过光学显微镜通过其GFP信号跟踪（图7A，黄色圆圈），但由于细胞碎片的存在和来自介质的污染，将它们定位在冷冻电镜中变得更加困难（图7B，黄色圆圈）。对于图案化网格上的神经元来说，这种存在减少了，这可能是由于非图案化区域的防污层中的PEG排斥细胞碎片粘附。由于神经元细胞体的尺寸和扩展的神经突起（图6A，B，黄色圆圈），沿着细胞较薄的区域收集冷冻ET倾斜系列（图6C，D，红色圆圈）。神经元细胞膜，线粒体（青色），微管（紫色），肌动蛋白丝（蓝色），囊泡结构（橙色和绿色）和大分子如核糖体（红色）在更高倍率的图像蒙太奇和切片中通过3D断层扫描很好地分辨（图6E）。虽然从无模式神经元的3D断层扫描中可以看到类似的亚细胞特征（图7E），但定位可行的细胞靶标以进行数据收集的困难大大降低了通量。

在 图 8 中，来自具有其中一些问题的网格的代表性图像已被组装起来，以帮助识别和故障排除。一旦确定了最佳条件，微图案化是一种可靠且可重复的方法，用于在冷冻透射电镜的网格上定位细胞。

图1:冷冻电镜微图案化的一般工作流程。 工作流程大致可分为四个部分:网格制备、微图案化、ECM和细胞接种以及冷冻制备和数据收集。每个部分的主要步骤列在标题下方，完成每个部分的大致时间显示在左侧。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2:图案位于网格上的软件的屏幕截图。 区域 1 包含用于图案设计的 μm/pix 比率。区域 2 是用于测量网格的标尺。领域3是添加或更改模式和投资回报率的地方。区域 4 包含图案定位和剂量的所有信息。区域 5 包含图案选项，包括切换叠加、复制或删除图案以及选择用于微图案的图案。区域 6 是可以保存和加载模板的位置。为清楚起见，下面显示了区域 4 和 5 的较大视图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:图案化冷冻TEM网格上的RSV感染的BEAS-2B细胞 。（A）添加荧光标记的ECM后图案化网格的荧光图像。输入模式显示在左下角。（B）在A网格上生长的BEAS-2B细胞的明场图像，（C）在暴跌 - 冷冻之前将A（青色）和B（灰色）的图像与RSV感染细胞的荧光图像（红色）合并;感染的细胞表达mKate-2。比例尺为500μm.（D）低倍率低温TEM图，在暴跌冷冻后，网格在B中。荧光图像是伪彩色的。比例尺为500μm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:图案化和无图案细胞的活/死染色。 （A）在图案网格上生长并用钙黄素-AM（活细胞染色，绿色）和乙锭同源二聚体-1（死细胞染色，红色）染色的HeLa细胞的荧光图像。（B）HeLa细胞在未图案的网格上生长并染色，如A.（C）在具有0.01mg / mL胶原和纤维蛋白原647 ECM（红色）的图案化Quantifoil R2 / 2网格上投影HeLa细胞的共聚焦z堆。用钙黄素-AM（绿色）和Hoechst-33342（蓝色）染色细胞。（D）未模式网格上的HeLa细胞与0.01mg / mL胶原和纤维蛋白原647 ECM孵育，孵育并用骨钙黄素-AM和Hoecsht-33342染色。荧光图像与透射光（灰度）合并。（E） C 的 X，Z 投影 （F） D 的 X，Z 投影 图像是伪彩色的。（A）和（B）中的比例尺为500μm;（C） - （F） 中的比例尺为 10 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。

图5:RSV感染的BEAS-2B细胞在图案化冷冻TEM网格上的冷冻ET。近似像元边界由绿色虚线表示。（B） （A） 中红色框住的区域的更高分辨率图像。近似像元边界由绿色虚线表示。RSV病毒粒子在细胞外围附近可见（白色箭头和黄色框）。（C）从（B）中黄色框区域收集的断层扫描的单个z切片。红色箭头指向RSV F融合蛋白，蓝色箭头指向核糖核蛋白（RNP）复合物。（A）-（C） 中的比例尺嵌入在图像中。请点击此处查看此图的放大版本。

图6:来自图案化冷冻TEM网格上3龄果蝇幼虫大脑的原代神经元。 （A）覆盖的果蝇神经元的活细胞荧光显微镜网格蒙太奇，在图案化的网格方块上表达膜靶向GFP，具有0.5mg / mL荧光康纳瓦林A. Green:果蝇神经元。蓝色:照片模式。（B）冷冻保存后网格的冷冻电镜图像蒙太奇（A）。黄色圆圈表示与 （A） 中相同的网格正方形。（C）由（A）和（B）中的黄色圆圈突出显示的正方形的冷冻EM图像蒙太奇。（D）（C）中由红色圆圈包围的区域的高倍率图像，其中在细胞的神经突起上收集了倾斜序列。E. 从（C）中的红色圆圈获得的倾斜系列重建的25nm厚的断层扫描切片。在这个断层扫描中可以看到各种细胞器，例如线粒体（青色），微管（紫色），致密的核心囊泡（橙色），浅囊泡（绿色），内质网（黄色）和肌动蛋白（蓝色）。大分子，如核糖体（红色），也可以在右上角看到。荧光图像是伪彩色的。（A）-（E） 中的比例尺嵌入在图像中。请点击此处查看此图的放大版本。

图7:原代神经元来自无图案网格上的3龄果蝇幼虫的大脑。 （A）真细胞荧光显微镜网格蒙太奇果蝇神经元在网格正方形上表达膜靶向GFP，具有0.5mg / mL可康纳瓦林A. Green:果蝇神经元。（B）坠落冻结后（A）中同一网格的冷冻电镜网格蒙太奇。黄色圆圈显示与 （A） 中相同的网格正方形。请注意细胞碎片和介质污染的存在，与图案化网格相比，这使得目标识别变得困难。（C）由（A）和（B）地图中的黄色圆圈突出显示的正方形的冷冻EM图像蒙太奇。（D）（C）中由红色圆圈包围的区域的高倍率图像，其中在细胞的神经突起上收集了倾斜序列。（E）从（C）和（D）的倾斜系列中重建的25nm厚的断层扫描图。在这个断层扫描中可以看到许多细胞器，例如微管（紫色），肌动蛋白（蓝色），内质网（黄色）和致密的核心囊泡（橙色）。大分子，如核糖体（红色），也可以看到。荧光图像是伪彩色的。（A）-（E） 中的比例尺嵌入在图像中。请点击此处查看此图的放大版本。

图 8:图案化可能出现的问题示例。 沉积在微图案网格上的标记ECM的荧光图像。（A）由于PLPP凝胶分布不均匀，整个网格的图案化不均匀。（B） 在图案化过程中，ECM 无法粘附在 PDMS 模板覆盖的区域。（C）总剂量过高的网格上的饱和梯度图案（右侧）或倒置图案（左侧）。（D）ECM粘附在网格条上的区域以及图案区域，由于在图案化过程中紫外线激光的反射。图像是伪彩色的;输入模式显示在左下角;比例尺为100μm， 请点击此处查看此图的放大版本。

表 1:微图案化过程中的潜在问题。 此表描述了用户在微图案化或细胞接种过程中可能遇到的一些问题。为每个问题提供了潜在原因和疑难解答。一些问题的代表性图像如图 8 所示。

作者没有什么可透露的。