以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。
本文内容
摘要
摘要
神经退行性蛋白质构象病（PCD）患病率的上升多年来引发了人们对这一领域的极大关注。这种日益增长的关注促使人们需要开发并改进能够重现人类PCD疾病表型的动物模型。尽管小鼠模型已被证明具有重要价值，但其成本高昂，且相关实验方法繁琐、通量较低。利用线虫Caenorhabditis elegans研究PCD的优势在于其易于培养、成本低且繁殖周期短，适合高通量应用。此外，C. elegans与人类基因组之间高度保守，使该模型成为极具价值的发现工具。表达荧光标记的组织特异性多聚谷氨酰胺（polyQ）片段的线虫会表现出年龄依赖性和polyQ长度依赖性的蛋白聚集现象，表现为荧光焦点。这类报告系统常被用作监测不同组织中蛋白质稳态变化的替代指标。人工进行聚集体定量耗时较长，限制了实验通量；此外，由于聚集体识别具有高度主观性，人工焦点计数可能引入偏差。本文建立了一套标准化流程，包括线虫培养、图像采集和数据处理，以支持对表达肠道特异性polyQ的C. elegans进行高通量聚集体定量分析。通过采用基于C. elegans的图像处理流程（使用图像分析软件CellProfiler），该方法已优化为可分离并识别单个线虫，并统计其各自的聚集体数量。尽管自动化概念并非完全新颖，但为实现可重复性、消除人工计数带来的偏差以及提高通量，标准化此类操作流程的需求十分迫切。预计这些方法可显著简化利用C. elegans模型对大型细菌库、基因组文库或药物库的筛选过程。
引言
阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症等与年龄相关的神经退行性蛋白质构象疾病（PCD），其特征是蛋白质错误折叠，进而导致聚集、细胞死亡和组织退化1。尽管蛋白质错误折叠被认为是致病原因，但这些疾病的病因尚不明确。因此，由于对导致疾病发生和进展的因素与条件缺乏了解，有效疗法的开发受到阻碍。近期研究表明，微生物组的变化会影响PCD的发生、进展和严重程度2,3,4。然而，人类甚至小鼠微生物组的复杂性使得开展揭示微生物对宿主确切影响的研究变得困难。因此，常采用更简单的生物体（如Caenorhabditis elegans）作为发现工具5,6,7,8。最近的研究利用C. elegans探讨了细菌对宿主蛋白质稳态及疾病发病机制的影响9,10。细菌定植、毒物兴奋效应和基因组变化是影响多聚谷氨酰胺（polyQ）序列聚集的典型条件示例9,11,12。此外，这些错误折叠的蛋白质聚集体在宿主体内的积累表现出polyQ长度依赖性和年龄依赖性，并与运动能力受损相关9,13。通过相对简单的方法定量荧光标记的点状结构，即可获得有关影响蛋白质折叠与聚集的条件、因素或药物的重要数据。
尽管荧光斑点的定量分析已被证明是一种可靠且相对简单的实验方法，但目前仍面临挑战，即如何建立一种能够促进对影响蛋白质聚集的化合物、细菌或条件进行大规模筛选的实验方案。自动化的C. elegans图像处理与斑点定量分析这一概念并非完全新颖，已有多种实用的辅助工具被开发出来14,15。然而，将培养、图像采集与数据处理流程整合为一体，对于消除实验结果的变异性并实现高通量筛选至关重要。
因此，本论文旨在标准化利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）中多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集的定量方法，作为检测蛋白质稳态（proteostasis）变化的替代指标。该目标通过使用CellProfiler——一种开源图像分析软件16，能够自动识别线虫及蛋白聚集物——来实现，并已整合到一个完整的实验流程中，涵盖线虫培养、图像采集和数据处理。
方案
所有操作均遵循经佛罗里达大学机构生物安全委员会审查和批准的安全指南。已采取适当的 生物安全措施，以降低暴露于生物安全二级细菌的风险。
注意：所有实验中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）必须在接种了大肠杆菌OP50（Escherichia coli OP50）的线虫生长培养基（NGM）平板上培养和维持。
1. 10 cm NGM 平板的制备
- 将3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨和17 g 琼脂加入2 L 锥形瓶中，用双蒸水（ddH2O）定容至1 L。灭菌前放入磁力搅拌子。
- 在121 °C、21 psi 压力下高压灭菌45分钟。随后将混合物置于水浴中冷却至50 °C。
- 采用无菌操作技术，加入以下无菌溶液：1 mL 1 M CaCl2·2H2O、1 mL 1 M MgSO4·7H2O、1 mL 溶于100%乙醇中并预热至室温的5 mg/mL胆固醇溶液，以及25 mL 1 M KH2PO4 （pH = 6.0）。使用磁力搅拌器混匀，可在700 RPM转速下搅拌1分钟。
- 将培养基倒入培养皿，直至完全覆盖10 cm培养皿底部。或者，可使用带刻度的血清移液管，每皿加入约20 mL培养基。
- 制备好的平板在室温下干燥24小时，然后接种细菌；或干燥后于4 °C保存备用。
注意：所有培养基组分均需采用无菌操作。步骤1.3–1.4应在超净工作台内进行。
2. 在24孔板中制备含FUDR的NGM琼脂
- 按照步骤 1.1–1.3 操作。
- 在 NGM 中添加 5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR），混匀，使终浓度达到 100 µg/mL。
注意：FUDR 可抑制 DNA 复制，通过靶向生殖系和胚胎发生过程阻断线虫 C. elegans 的繁殖，从而影响其寿命。因此，在将线虫转移至含 FUDR 的培养板之前，必须使其充分发育至年轻成虫阶段。
警告：FUDR 具有毒性，操作时应遵循生产商提供的安全数据表（Safety Data Sheet）中的指导。 - 使用移液器将 1 mL NGM-FUDR 加入每个孔中。
注意：此过程可借助自动平板注液系统完成。 - 在接种细菌前，或将未接种的平板储存于 4 °C 前，于室温下干燥 24 小时。
3. 平板接种：OP50 及其他测试菌
- 过夜培养的准备 E. coli OP50 培养物，将 200 µL 冻存菌种中的细菌等分试样加入含有 250 mL 新鲜的 无菌LB肉汤（Luria broth）。
注意：培养基的体积取决于需要接种的培养板数量。准备其他细菌培养物时，用无菌微量移液器吸头从冻存菌种中取菌，接种至含有5 mL生长培养基的16 mL培养管中。 - 在37 °C摇床培养箱中，以220 RPM（每分钟转数）振荡培养过夜。
注意：使用灭菌的锥形瓶，其容积至少为培养基工作体积的两倍，并用经高压灭菌的铝箔封口。接种步骤及细菌分装操作均须采用无菌技术进行。 - 加入1-2 mL过夜培养物 E. coli 将OP50菌液接种至每块10 cm NGM平板的中心。无需将菌液涂布至整个NGM平板表面。
- 在使用或储存前，将培养板在室温下晾干。
注意：接种后的平板可连同盖子置于有气流的通风橱中，以促进干燥。
4. 培养与铺板：24孔板
- 按照步骤 3.1–3.2 中的培养说明，制备所需细菌菌株的过夜培养物。
- 将每种细菌培养物各 200 µL 转移至含有 NGM 琼脂的 24 孔板的每个孔中。200 µL 的细菌液可覆盖整个琼脂表面，以最大化食物量，确保线虫不会避开细菌菌苔。
- 将平板在生物安全柜（BSC）中保持微开状态，以促进干燥。定期检查平板，防止过度脱水，并调整平板方向以促进空气均匀流通和干燥。平板应在 5 小时内干燥。
注意：所有涉及生物安全等级 2 级细菌的操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，并须经机构生物安全委员会批准。
5. 年龄同步化
注意：所有步骤均应采用适当的无菌技术进行（即在火焰附近或生物安全柜内操作）。
- 使用滤膜过滤除菌的 M9 溶液（5.8 g Na2HPO4·7H2O，3.0 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，溶于 1 L ddH2O 中）从 10 cm OP50 平板上冲洗出怀卵的雌雄同体线虫。
- 使用无菌玻璃或塑料移液管将 M9 溶液多次加入平板，以使线虫脱离细菌菌苔。
- 收集线虫悬液，并将液体转移至 15 mL 聚苯乙烯圆锥形离心管中。
- 在室温（RT，约 23 °C）下以 270 x g 离心 2 分钟。
- 使用真空抽滤瓶吸除上清液并弃去，保留管底线虫沉淀不受扰动。
- 加入 5–10 mL M9 溶液重悬沉淀，清洗线虫，并重复步骤 5.2–5.3 两次。
- 向离心管中加入 5 mL 20% 漂白溶液（8.25 mL ddH2O，3.75 mL 1 M NaOH，3.0 mL 非杀菌型次氯酸钠），持续颠倒混匀以溶解线虫。当线虫几乎完全溶解时，即可进行离心。
注：漂白时间及漂白溶液体积取决于样品量。漂白过度或不足均为常见错误。因此，通常需要优化该步骤以确定样品何时适合离心。 - 以 423 x g 离心 2 分钟，并弃去上清液。
- 加入 10 mL 无菌 M9 溶液以重悬卵沉淀。
- 以 423 x g 离心 2 分钟使卵沉淀，使用抽滤瓶移除上清液。
- 重复步骤 5.6–5.6.1。
- 将卵沉淀重悬于 5 mL 无菌 M9 溶液中，并在设定温度下置于旋转混合仪（nutator）上过夜。
注：同步化年龄的 L1 幼虫将于次日准备好转移至培养平板。
6. 年龄同步化后线虫的制备
- 在室温（约 23 °C）下，以 270 × g 离心同步化年龄的线虫 3 分钟。
- 在洁净环境中（如超净台或本生灯旁）吸除上清液，保留约 200 µL 上清液，并将线虫重新悬浮。
- 使用移液器将浓缩的线虫悬液转移至预先接种 OP50 的 10 cm NGM 平板。
注意：每个平板最多可容纳 1,500 条线虫而不会食物不足；但具体数量需根据细菌菌苔密度和培养温度进行调整。建议使用多个平板以防止线虫饥饿。需特别注意，这些平板中不得含有 FUDR。 - 让平板干燥后倒置，并在 25 °C 下培养 48 小时。
注意：根据筛选条件的不同，第 6.1 步中的线虫可直接放置于测试平板（含细菌、药物或待测化合物）。若待测条件影响发育，则应先将线虫在含 OP50 的 NGM 平板上培养至年轻成虫阶段（约 48 小时），再暴露于测试条件下。 - 经过 48 小时培养后，用无菌 M9 溶液冲洗平板上的线虫，并将其转移至锥形管中。
注意：成年线虫会沉降至管底。沉降所需的确切时间取决于从 10 cm 平板回收的线虫数量。在此条件下，线虫通常在 10 分钟内完成沉降。 - 通过肉眼观察确定沉降时间，以确保去除残留的卵或已孵化的幼虫。
- 加入额外的 10 mL M9 溶液以冲洗线虫体表残留的细菌。
- 在 23 °C 下以 270 × g 离心线虫 2–3 分钟。
- 再重复洗涤步骤 3 次。为获得最佳效果，最后一次洗涤后在管中保留约 1–1.5 mL M9 溶液。
- 取 10 µL 线虫悬液滴加到载玻片上，计数线虫数量。
- 将线虫密度调整至每 10 µL M9 溶液中约含 150 条线虫。离心后可通过添加或去除 M9 溶液来调节悬液中的线虫浓度。
- 通过多次不同液滴的计数取平均值，确认已达到目标浓度。建议至少对三个液滴进行计数并取平均值。
- 采用无菌操作技术，将含有约 150 条线虫的 10 µL 线虫悬液转移至测试板的每一孔中。
- 在显微镜下检查各孔，确保每孔含有足够数量的线虫。可在培养前添加额外线虫。
- 让平板干燥约 10 分钟，然后倒置并转移至 25 °C 培养箱中培养 72 小时。
注意：最终培养时间可根据实验需求进行调整。在 25 °C 下，72 小时的培养时间足以支持 24 孔板中每孔 150 条线虫以 200 µL 细菌为食的生长。
7. 准备用于成像的线虫
- 为促进更有效的沉淀并减少样本损失，在洗涤前固定线虫以防止其游动。
注意：如果处理的样本较少，可通过暴露于左旋咪唑（100 µM）实现固定。然而，若处理大量样本，可通过冷冻固定线虫。此外，长时间冷冻（18–24 小时）可在制备过程中防止 polyQ 聚集体的进一步形成。- 将多孔板置于 -20 °C 冰箱中 15–20 分钟，或直至线虫不再移动。
- 将样本从冰箱中取出，静置 5 分钟。
- 使用移液器向目标孔中加入 1 mL 预冷至 4 °C 的 M9 培养基，反复按压和释放移液器活塞 4–6 次，以洗涤每个孔中的线虫。
注意：有时线虫会粘附在移液器吸头内壁上。因此，应在每孔之间更换新的吸头，以避免线虫交叉污染。 - 将线虫悬液转移至微量离心管中，静置使线虫沉降至管底。
- 吸除并弃去上清液。总共洗涤样本三次。
- 在最后一次洗涤中待线虫完全沉降后，吸除 500 µL 上清液，保留 500 µL 用于重悬线虫。
- 将剩余的线虫悬液转移至新的平底 24 孔板中，放入 -20 °C 冰箱冷冻 48 小时。
注意：冷冻线虫可降低背景荧光，有助于更清晰地观察聚集体。
8. 成像
- 从超低温冰箱中取出培养板，使其自然解冻，擦去多余的冷凝水，然后在成像前取下盖子。
注意：图像采集的具体细节将根据所使用的设备和软件而有所不同。本部分的方案仅作为指导，预期可能需要进行适当调整。此外，必须以 TIFF 文件格式保存图像。 - 在图像采集过程中，使用以下显微镜设置：曝光时间 500 毫秒；40 倍物镜配合 0.63 倍相机适配器（总放大倍数 25.2 倍）；GFP 荧光强度设为 100%。
注意：不同的显微镜配置和系统所获取的图像可能与结果部分提供的图像存在差异。为了更通用地描述所需图像，此处提供更为客观的图像参数标准。在 CellProfiler 中，只有直径为 1.0–10.0 像素、荧光强度为 0.10–1.0（任意单位，量程 0–1）的聚集体才能被准确识别。这些聚集体图像的荧光背景强度通常低于 0.10 的阈值。对于明场图像，线虫的强度范围为 0.7–1.0，背景强度为 0.1–0.2。明场图像中线虫的平均长度从头到尾约为 250 至 350 像素。 - 调节透射光控制参数，使线虫相对于暗背景呈现明亮清晰的成像效果。避免过度曝光，否则会导致线虫尺寸被错误放大。
- 可能需要调整孔内线虫的位置，以防止过度聚集。可使用移液器吸头将聚集的线虫分散开。
- 将通道设置为 GFP，以确定两张图像的焦平面。
注意：必须在 GFP 通道中确定焦平面。在采集明场图像过程中任何对焦的改变，都会导致在图像分析时聚集体与线虫的位置无法对齐。 - 采集一张明场图像后，立即在不移动培养板的情况下采集对应的荧光图像。
- 将测试图像导入分析流程，根据第 8.2 步后的"注意"说明，确定图像中目标物的强度和尺寸参数。
注意：在正式分析前，CellProfiler 可提供有关目标物强度和长度的所有必要信息。 - 为评估图像，首先下载 CellProfiler17。打开软件后，将感兴趣的图像直接拖拽至“Images”（图像）框中。
- 点击文件列表中的图像以打开查看。
- 屏幕左上角有多个图标，可用于测量目标物尺寸或放大特定区域。选择放大镜图标以高亮显示感兴趣区域。
- 选择箭头图标以测量线虫和聚集体的长度。
- 将鼠标悬停在目标物上，可在屏幕底部查看其强度值。
注意：由于所有图像均为灰度图像，因此所有红色、蓝色和绿色像素值均相同。
9. 图像分析
- 使用 CellProfiler 图像分析流程前，需正确命名图像对。命名格式如下：P1_A01_S1_C1，其中 P1 表示特定的培养板及其对应的数字编号；"A" 表示行，"01" 表示列；"S" 表示单个孔的特定图像对；"C" 表示通道，其中 "1" 用于表示明场图像，"2" 用于表示荧光图像。
- 从官方网站下载 CellProfiler（版本 4.1.3 或更高）17。
- 下载分析流程（补充文件 1）。通过选择 文件 > 导入 > 从文件导入流程，将该流程（Pipeline）上传至 CellProfiler。
注意：模块 2 和模块 3 已被禁用，因其被认为非必要。若图像分析未能实现线虫的有效分离与识别，可恢复其功能；但需对流程进行修改。 - 如需启用这些模块，请选中各模块左侧的复选框。将 "UntangleWorms" 模块的输入二值图像重命名为 "convertobjectstoimage" 模块的输出图像。
- 初次使用时可能出现与模块 2 相关的错误提示。若出现此情况，可继续进行分析。
- 将用于识别线虫的训练集上传至 "UntangleWorms" 模块。该训练集可在 补充文件 2 中找到。
- 选择 UntangleWorms 模块以打开其设置界面。
- 找到 训练集文件名，并点击上传文件图标。
- 上传 补充文件 2（训练集）。
- 通过点击左上角的 图像 模块上传图像。将按步骤 9.1 所述正确命名的图像拖放至该区域。
- 在分析图像前，选择用于存储结果的目标输出文件夹。
- 点击程序左下角附近的 输出设置 按钮。
- 点击 默认输出 右侧的文件夹图标，选择所需的输出路径。
- 点击 分析图像 图标以开始图像分析。
- 若分析耗时过长且卡在单张图像处理上，可能是由于图像采集问题所致。若发生此情况，请中止运行，并通过检查输出文件夹、查找缺失的图像名称，来确定未处理的图像。
注意：部分图像可能需要额外预处理，以去除流程无法处理的大尺寸或高亮度伪影。某些情况下，此类图像需从分析中排除。 - 分析完成后，软件将结果整理为 Excel 表格，其中包含每条线虫的信息（N 列）及其对应的聚集体数量（K 列）。
注意：成功运行后将生成一个 Excel 表格，列出每个孔中每条被识别线虫的聚集体数量。实验人员可根据需要对这些数据进行进一步处理。 - 从 补充文件 3（Windows）或 补充文件 4（Mac）下载元数据整理工具（图形用户界面），以便便捷地整理 CellProfiler 输出的 CSV 文件数据。
注意：该软件无正式许可证，下载后不会自动打开。 - 若使用 64 位 Windows 操作系统，请执行步骤 9.14–9.17；若使用 Mac 操作系统，请执行步骤 9.18–9.20。步骤 9.21–9.22 适用于两种操作系统。
- 对于 Windows 操作系统，找到已下载的文件并将其解压至目标位置。
- 找到并打开解压后的文件夹 gui_windowsOS_64x，通过点击 "gui" 应用程序图标启动程序。
- 系统可能会弹出请求运行权限的提示。选择 更多信息，然后点击 仍然信任。
- 元数据整理工具现已就绪，可直接拖放 CellProfiler 输出的 CSV 文件。继续执行步骤 9.21。
- 对于 Mac 操作系统，找到已下载的文件并打开 gui_macOS_64x.zip。此操作将自动解压所有文件。
- 打开位于 "下载" 文件夹中的解压后文件夹。
- 右键点击 "gui" 应用程序，选择 打开。由于缺少官方许可证，系统将弹出权限请求提示。选择 打开，然后继续执行步骤 9.21。
- 点击 上传您的文件 或直接拖放所需的 CellProfiler CSV 文件。
- 点击 整理 按钮，程序将跳转至新界面并显示 下载文件 按钮。点击该按钮并选择保存输出文件的目标位置。输出文件将以原始文件名加上 "_organized" 后缀的形式保存。
结果
本文描述了一种秀丽隐杆线虫（C. elegans）的工作流程，包括培养、图像采集和图像处理方案，可在24孔板作为培养和成像平台的条件下，评估不同细菌存在时多聚谷氨酰胺（polyQ）的聚集情况（图1）。该方案可调整用于研究细菌、特定条件、小分子、药物或基因组操作对宿主蛋白质稳态（proteostasis）的影响。所述方法已使用持续表达肠道定位的黄色荧光蛋白标记的多聚谷氨酰胺融合蛋白（vha6p::polyQ44::YFP）的线虫进行优化；然而，其他报告肌肉或神经元中蛋白质稳态的模型经进一步优化后也可适用。例如，初步实验表明，该方法可用于其他组织（如肌肉中多聚谷氨酰胺聚集）中蛋白聚集体的定量分析（补充图1）。但如第8节注释所述，为准确调整聚集体的大小和亮度，需对流程进行相应修改。
图1：工作流程示意图。 本实验方案的主要步骤包括五个不同阶段：线虫准备与年龄同步化（步骤1-5）、肠道定植/线虫处理（步骤6）、成像样品制备（步骤7）、图像采集（步骤8）和图像处理（步骤9）。图中将方案的“部分”标注为“步骤”。请点击此处查看此图的放大版本。
初步优化实验揭示了由于子代数量过多导致的过度拥挤问题，从而引起食物更快耗尽。第2节中所述在NGM平板中添加FUDR解决了这一问题（图2）。此外，在添加FUDR的情况下，饲喂不同细菌的线虫体长更为一致，从而实现了更均匀且准确的线虫检测。
图2：使用FUDR可通过减少子代数量来提高成像质量。 添加FUDR的培养皿可完全消除C. elegans子代，而对照组未添加FUDR的NGM培养皿（接种E. coli OP50）中则有大量子代线虫生长。图像采集放大倍数为25.2倍（使用0.63倍相机适配器的40倍物镜）。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
背景荧光导致多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集体的假阳性检测。为了降低肠道中的此类荧光信号并提高聚集体的自动检测准确性，成像前必须对线虫进行冷冻处理。将线虫在 -20 °C 下冷冻 18–48 小时可显著改善 polyQ 聚集体的检测效果，有效消除背景荧光（图 3A）。人眼能够区分聚集体与背景荧光，因此冷冻前后的手动计数结果一致（图 3B）。然而，自动计数的准确性较低，但经过冷冻处理后，自动计数的准确性显著提高，接近手动计数水平（图 3B）。
图3：冻存可提高聚集物的检出率。（A）表达肠道 polyQ44::YFP 的 C. elegans 在冻存前和冻存后的荧光图像。插图为所选区域的放大图像。比例尺 = 500 µm。（B）在定植 P. aeruginosa MPAO1 的线虫中，采用手动或自动（分析流程）定量方法检测冻存前后每条肠道中平均聚集物数量。数据来自两个生物学重复（n = 60–109）。统计学显著性通过学生t检验计算（**** p < 0.0001）。误差线表示均值的标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
采用倒置明场照明来检测完整的 C. elegans（图4A），并使用GFP通道对polyQ44::YFP聚集体进行成像（图4B）。每条线虫的检测、去缠绕及聚集体定量通过应用优化的CellProfiler图像处理流程（补充文件1）完成，从而获得每条个体线虫中的聚集体数量（图4C-D）。为验证该方法的可行性以及自动检测与定量聚集体的准确性，按照既定方案（第1–7节）培养并制备表达肠道特异性polyQ44::YFP的线虫用于成像。每条线虫的聚集体数量通过自动流程（第8–9节）或人工计数进行评估。每次实验均独立重复三次，每次实验每组条件使用90–571条线虫。尽管通过两次重复实验获得的每条肠道平均聚集体数量无显著差异，但在第三次重复实验中，使用自动方法定量时聚集体数量显著减少（图5A）。三次重复实验的平均结果显示，使用CellProfiler流程（第8–9节）进行定量时，聚集体数量略少，但差异显著（图5B）。然而，两种方法之间的差异极小，表明该自动方法可用于大规模筛选。
图 4：使用 CellProfiler 检测聚集体。（A）用于识别线虫体的明场图像。（B）通过 GFP 通道获取的原始荧光图像，用于识别并定量肠道内 polyQ44::YFP 聚集体的总数。（C）使用 CellProfiler 识别出的聚集体。（D）识别出的聚集体总数叠加在原始荧光图像上，显示线虫轮廓及聚集体轮廓。图像采集与处理均采用第 8–9 节所述参数设置。图 E–H 为图 A–D 中相应标示区域的放大图像。图像采集时放大倍数为 25.2 倍（40 倍物镜配合 0.63 倍相机转接器）。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：自动聚集体定量的效能。（A）使用手动计数法（手动）和基于 CellProfiler 的自动定量流程（流程化）对定植了对照 E. coli OP50 的线虫肠道中平均聚集体数量进行统计。结果来自三次独立实验（T1-T3）的数据分析（n = 90–571）。（B）通过手动或自动（流程化）聚集体定量方法获得的每条肠道中聚集体的平均数量。统计学显著性采用 Student t 检验计算（* p < 0.05，** p < 0.01）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
为了评估不同实验者之间结果的可重复性，由三位实验者分别采集了一块包含六孔线虫的培养板的图像，其中线虫分别饲喂Pseudomonas aeruginosa MPAO1 或 Escherichia coli OP50；这三位实验者中有两位此前从未使用这些方案进行过线虫成像。每个孔采集的图像中检测到的线虫数量在30至115条之间。三位实验者对同一孔中的线虫成像后，检测到的聚集行为无显著差异。尽管在饲喂MPAO1和OP50的线虫中，三位实验者所测得的每条肠道平均聚集物数量均保持高度一致，但在平均聚集物数量上仍存在一些统计学显著差异，且仅出现在定植MPAO1的线虫中（补充图2）。这些结果表明，即使由缺乏经验的实验者操作，该实验结果仍具有良好的可重复性。
为确保聚集体定量的可重复性不受线虫位置的显著影响，选取一组15条线虫，在每次图像采集之间使用移液器吸头进行搅动后，分别进行15次独立成像。对喂食后线虫中聚集体的成像 E. coli OP50 和 P. aeruginosa 使用CellProfiler收集并分析MPAO1。来自每组不同图像的聚集体平均数量虽略有差异，但无统计学意义，进一步支持了该方法的可重复性（补充图3).
已在C. elegans肠道中定植革兰氏阴性肠道病原菌的研究表明，此类定植可在多种组织中破坏蛋白质稳态，其中P. aeruginosa是诱导多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集的最强诱导剂之一9。为了确定这些优化后的实验方案是否能够成功检测并量化P. aeruginosa介导的聚集增强效应，我们对表达肠道polyQ的线虫分别进行了E. coli OP50（对照细菌）和P. aeruginosa MPAO1的定植，并执行了第1至第8节所述步骤。所获得的图像使用CellProfiler进行分析（第9节，补充文件1）。自动定量分析结果显示，由P. aeruginosa MPAO1诱导的聚集体数量显著增加，与喂食对照E. coli OP50的线虫相比，聚集体数量 consistently 增加了两倍（图6）。
图6：在定植了对照菌的线虫肠道中，每个肠道的平均聚集体数量 E. coli OP50 和 P. aeruginosa MPAO1 使用 CellProfiler（第8-9节）评估每条肠道中的聚集体数量。数据表示为定植 OP50（n = 1068）和 MPAO1（n = 1557）的线虫每条肠道中聚集体的平均数量。统计学显著性通过学生t检验计算（**** p < 0.0001）。 < 0.0001）。误差线表示标准误（SEM）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
优化的实验流程旨在支持大规模筛选影响蛋白质稳态的条件。为验证该方法在筛选大量细菌文库以检测其对宿主蛋白质稳态影响方面的可行性，采用本文所述流程（第1-9节）检测了90种细菌的影响 P. aeruginosa 非必需基因敲除突变株对多聚谷氨酰胺聚集的影响18。该初步筛选是更大规模项目的一部分，旨在筛选全部 P. aeruginosa 非必需突变菌株影响宿主蛋白质稳态能力的检测。在测试的90种细菌菌株中，定植 秀丽隐杆线虫 其中一种候选物使肠道内的聚集体数量显著减少（图7）。为评估该检测方法的敏感性，随后通过手动计数随机选取的六个样本中的聚集体进行后续实验 P. aeruginosa 与MPAO1对照组无显著差异的突变体。这些实验采用更传统的6 cm NGM平板，将线虫在L1阶段转移至测试菌株，以重复此前 established 的实验方法。9通过人工计数进行的验证实验表明，所有突变体均未减少聚集体数量，包括那个显著降低聚集体数量的突变体图7），影响多聚谷氨酰胺聚集（polyQ 聚集）补充图4此外，在90个突变株的筛选中观察到的聚集性细微变化，并未在所选候选菌株的人工计数中被检测到，表明这些变化可能源于生物学和实验变异性，例如样本量n值较低。综上所述，结果表明，尽管我们的方法能够可靠地检测出显著变化，但细微变化很可能被遗漏，所有潜在候选菌株均需逐一验证。
图 7：定植了92种细菌菌株的线虫肠道中聚集体数量的代表性样本集。 数据表示每条肠道中聚集体的平均数量，已标准化为定植MPAO1菌株的线虫数据。虚线表示定植MPAO1菌株（上方，空心圆）和OP50对照菌株（下方，空心方块）的线虫中聚集体的平均数量。实心符号代表90种不同的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）MPAO1基因敲除突变株。定植MPAO1菌株与单个突变株的线虫之间，每条线虫的平均聚集体数量差异具有统计学意义。灰色圆圈代表经人工确认的样本（补充图 4）。统计学显著性通过单因素方差分析（ANOVA）后接多重比较的Dunnett事后检验进行计算（** p < 0.01，**** p < 0.0001）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
为了管理 CellProfiler 生成的大量数据，开发了一个图形用户界面（GUI）以自动处理和组织数据（图8）。该图形用户界面使用 Tkinter 开发，Tkinter 是一个开源的 Python 跨平台控件工具包。应用程序从给定的元数据中提取每块孔板中每个孔（J列）对应的聚集体数量（K列）。上述过程使用了一个名为“Pandas”的 Python 数据处理库来实现。该 GUI 应用程序支持用户通过拖放方式上传数据文件。每个文件中的数据以二维表格结构（称为数据框）的形式存储。对于数据框中出现的每一个唯一孔位，都会初始化一个空的字典键值对。接着，统计每个孔中不同的聚集体数量，并将其追加到对应的字典键值对中。数据较少的列将用空字符串进行填充，以确保所有列的长度一致。最后，该结构被转换为一个数据框，并以电子表格的形式导出至用户指定的目录中。
图 8：图形用户界面。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：肌肉特异性多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集体的检测。 表达肌肉特异性polyQ35::YFP的线虫在L1期接种，并在OP50上培养48小时。当线虫发育至年轻成虫阶段后，将其转移至24孔NGM平板，添加100 µg/mL FUDR，并接种MPAO1，继续培养72小时，随后进行成像。(A) 用于识别线虫体形的明场图像。(B) 使用GFP通道获取的原始荧光图像。(C) 使用CellProfiler软件识别的聚集体。(D) 识别出的聚集体总数叠加在原始荧光图像上，显示线虫轮廓及聚集体轮廓。图像采集与处理均采用第8–9节所述参数设置。图中E–H为对应A–D图中划定区域的放大图像。比例尺 = 500 µm。请点击此处下载该文件。
补充图2：不同实验者之间聚集体定量结果的可重复性。 使用CellProfiler对定植了P. aeruginosa MPAO1的六孔线虫（黑色柱）和定植了对照菌E. coli OP50的六孔线虫（灰色柱）进行聚集体数量的定量分析。每孔样本由三位实验者（AVS、DMC、RDH）分别成像。数据以每条肠道中聚集体的平均数量表示（n = 30–115）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey多重比较检验进行统计学显著性分析（* p < 0.05，** p < 0.01）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处下载该文件。
补充图3：线虫在孔板中的位置对聚集体定量可重复性的影响。 在定植了对照 E. coli OP50（灰色柱）和 P. aeruginosa MPAO1（黑色柱）的线虫中，每条肠道的平均聚集体数量。结果表示使用CellProfiler定量的每条肠道聚集体的平均数量（15≥n≥12）。通过在每次成像之间进行震荡，改变线虫在孔内的位置。两组中均未发现具有统计学意义的差异。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey多重比较检验进行计算。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处下载该文件。
补充图4：通过手动计数验证初步筛选结果。 每条肠道中聚集物的平均数量通过人工手动进行定量。数据表示定植了六种MPAO1基因敲除突变株的线虫（灰色圆圈 图7）与野生型MPAO1及OP50对照组（n = 30）的聚集特征对比。统计学显著性采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett多重比较事后检验（**** p < 0.0001）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处下载该文件。
补充图5：FUDR对肠道多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集的影响。 数据以每条肠道中polyQ44::YFP聚集体的平均数量表示（n = 20）。线虫在25 °C下于E. coli OP50培养基上生长48小时后，转移至对照组（无FUDR）或含FUDR的培养板（100 µg/mL）中。额外培养48小时后进行人工计数。统计学显著性采用Student's t检验计算（ns = 无显著性差异）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处下载该文件。
补充文件1：蛋白质稳态分析流程。可在CellProfiler中使用的可下载图像分析流程。应用说明详见第9节。请点击此处下载该文件。
补充文件2：训练集解缠蠕虫。需上传至“UntangleWorms”模块的文件。该特定训练集专用于初始方法中所使用的蠕虫。若蠕虫的大小和形状发生变化，将影响识别的准确性和质量。可能需要创建更具个性化的训练文件。创建新训练集的说明可在CellProfiler官方网站17上找到。请点击此处下载该文件。
补充文件3：适用于Windows操作系统的图形用户界面。 gui_windowsOS_64x.zip。 请点击此处下载该文件。
补充文件4：适用于Mac操作系统的图形用户界面。 gui_MacOS_64x.zip。 请点击此处下载该文件。
讨论
C. elegans 的培养、成像及图像处理流程描述了利用 CellProfiler（一种开源图像分析软件）的操作步骤。代表性结果表明该方法具有可重复性、可减少偏差并具备可扩展性。这一标准化流程将有助于改进针对大型细菌库、基因组库或药物库的筛选策略。尽管目前已存在其他自动化的 C. elegans 目标检测方法，但本研究所述技术提供了一条标准化、高通量的整合性流程，涵盖生物培养、图像采集与分析环节。
为了优化本文所述的实验方案，必须测试多种线虫培养条件。最初，线虫在年龄同步化后（L1阶段）立即转移至待测细菌上。然而，这种方法导致线虫群体体型存在差异，即使在同一孔内的线虫之间也存在不一致。C. elegans 已知具有病原体回避行为19，这可能导致观察到的体型差异，并最终影响后续成像过程中对线虫的检测。为消除此类变异，将每孔中的全部NGM区域均覆盖上待测细菌。此外，线虫先在 E. coli OP50 上饲养，并在25 °C条件下培养48小时，使其完全发育为年轻成虫。在转移至待测细菌前，让线虫在 E. coli OP50 上发育至成虫阶段，可获得更一致的体长。此外，通过在NGM琼脂中添加FUDR，避免了过度拥挤及子代快速消耗食物的问题。使用FUDR可消除子代干扰，提高自动识别线虫的准确性，因为子代与亲代混合会阻碍自动识别。然而，在使用FUDR时必须谨慎，并设置适当的对照，因为该化合物已被证实会影响 C. elegans 的蛋白质稳态和寿命20,21。在本实验方案所述条件下，FUDR并未影响肠道内polyQ的聚集（补充图5）；因此，其使用对本方法而言是合适且有益的。
成像前对样品进行冷冻被证明是成功应用该流程的关键步骤。冷冻前的聚集体计数显著高于手动计数（图3B）。在成像前将线虫置于-20 °C环境中保存18-48小时，可降低背景荧光，最终提高聚集体的检测效果（图3A）。目前仅针对polyQ模型研究了冷冻对聚集体检测的影响，因此在未进一步验证的情况下，不应将此效应推广至其他模型。
尽管所有条件均保持一致，但在不同实验运行之间，每条线虫的平均聚集体数量仍可能有所差异，而定植OP50与定植MPAO1动物之间聚集体数量的比值则保持一致（图6，补充图2，补充图5）。因此，每次实验运行中必须始终包含E. coli OP50对照，或任何其他合适的参考对照。实验间聚集体计数的此类变异性可能受环境条件（温度、湿度）22,23或遗传背景8的影响。事实上，观察到在长期培养后，肠道荧光显著减弱甚至完全消失，此时需从冻存菌种中重新复苏新菌株。荧光减弱可能是由于遗传变化抑制了毒性转基因（如表达polyQ的转基因）所致。然而，不同实验操作者之间（补充图2）、生物学重复之间（图5）以及同一样本内部（补充图3）结果所表现出的极高可重复性，凸显了该方法的可靠性。
已有大量研究报告采用肠道多聚谷氨酰胺（polyQ）来研究蛋白质稳态9,11,12,13,24,25。然而，由于不同实验方法和检测手段之间存在差异，各项研究结果难以直接比较。尽管如此，本文所述的自动化定量方法重现了部分先前发表的研究结果，包括细菌诱导的蛋白聚集现象9,13以及相似数量的聚集物11。综上所述，本研究所描述的分析流程为蛋白质稳态研究提供了一种有价值的工具。
本文所述方法存在一些固有的挑战。例如，需要足够的时间来掌握本方案的全部内容，尤其对于第8部分而言更是如此，该部分要求操作者熟悉该检测方法，以判断所获取的图像是否适用于本分析流程。可以偏离本方案中使用的图像采集参数设置；然而，这可能需要对参数设置和线虫训练集进行相应调整。本分析流程能够区分不同大小的聚集体以及相互接触的聚集体，从而减少聚集体之间发生"融合"的情况，并最终提高检测灵敏度。然而，在识别超出可接受尺寸范围的大聚集体时可能会出现问题，因为扩大上限尺寸阈值可能导致识别错误，例如无法区分相互接触的聚集体。在进行图像分析之前，必须在准确性、尺寸和强度之间找到平衡。通过引入机器学习构建能够增强聚集体检测能力的神经网络，可进一步提高聚集体识别的效率。目前正积极探索此类改进措施，未来将有助于解决现有难题，例如位于不同焦平面或具有异常形态的聚集体的检测问题。
所述方法的一个显著缺点是自动聚集体计数存在变异性，因为在饲喂不同细菌菌株的线虫中，这些结果并不总能通过人工计数重现。例如，根据自动计数结果，饲喂P. aeruginosa突变株53（M53）的线虫相比野生型菌株（MPAO1）具有显著更少的聚集体（图7）；然而，对该阳性结果的验证并未显示显著差异（补充图4）。通常情况下，高通量药物筛选具有较高的假阳性率，本方法也不例外26。因此，验证所有潜在阳性结果是该实验方案中的关键步骤。
尽管本实验方案已针对筛选影响宿主蛋白质稳态的细菌的策略进行了优化，但每一步均可进一步修改，以检测基因组RNAi文库、小分子或其他条件的影响。可根据特定筛选策略的需求，在每一步中进行额外的调整。此外，该技术具有一定的灵活性，允许对各个步骤进行优化，以适应特定的模型系统。例如，该方法可拓展应用于其他组织中的polyQ聚集研究，或提取图像中检测到的其他特征，如利用可诱导的荧光报告系统监测基因表达（例如热休克基因）、评估蛋白质的亚细胞定位（例如DAF-16的核定位）、研究其他疾病模型中的蛋白聚集（如Aβ1-42、α-synuclein、TDP-43等），或评估生理表型（如线虫体型大小）。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（1RO3AG069056-01）和美国传染病学会对 DMC 的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们感谢 Czyz 实验室成员对稿件的校对。卡通图示使用 BioRender 付费许可证生成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 微管 | 奥林巴斯塑料 | 货号#24-282 | 微量离心管 |
| 10 mL 血清移液管 | GenClone | 货号#12-104 | 塑料移液管 |
| 15 mL 离心管，带架 | 奥林巴斯塑料 | 货号 28-101 | 锥形管 |
| 5-氟-2′-脱氧尿苷 | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
| Accu-jet Pro 移液器控制器 | Genesee Scientific | 91-600RB | 移液枪 |
| 琼脂 | Fisher Scientific | 货号 BP1423-2 | 颗粒状琼脂 |
| BioRender | BioRender | 图形图表生成器 | |
| 漂白剂（常规） | Clorox | 条码# 044600324111，无飞溅漂白剂 | 4.5% 次氯酸钠 |
| C. elegansAM140： rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | 莫里莫托实验室（西北大学） | AM140，Q35::YFP | 肌肉 polyQ |
| C. elegansAM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | 莫里莫托实验室（西北大学） | AM738，Q44::YFP | 肠道多聚谷氨酰胺 |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 货号#C79-500 | 二水合氯化钙 |
| CellProfiler | 布罗德研究所 | 图像分析软件 | |
| 胆固醇 | Fisher Scientific | 货号#ICN10138201 | 胆固醇 |
| 循环水浴头 | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
| CoolLED pE300lite 365 直接安装件 STEREO | CoolLED | 8114931 | 荧光光源控制与发射器 |
| 16 mL 培养管 | 奥林巴斯塑料 | 21-129 | 培养管，17 mm × 100 mm |
| 大肠杆菌 OP50 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心 | OP50 | 大肠杆菌 对照菌株 |
| 乙醇，200 证明 | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
| 目镜 10x/23B，可调，3 代 | 徕卡显微系统 | 10450910 | 目镜组 |
| 滤光片组 ET GFP - MZ10F | 徕卡显微系统 | 10450588 | 滤光片组 |
| GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | 统计分析工具 | |
| Heratherm 培养箱 IMP180 | 热 | 51031562 | 冷藏培养箱 |
| Innova 4000 | 新不伦瑞克科学公司 | M1192-0000 | 摇床培养箱 |
| K5 相机 | 徕卡显微系统 | 11547112 | 体视显微镜相机 |
| KH2P04 | Fisher Scientific | 货号 P285-3 | 磷酸二氢钾 |
| LAS X 成像软件 | 徕卡显微系统 | 显微镜成像软件 | |
| 徕卡 MZ10 F 光学载具 | 徕卡显微系统 | 10450103 | 体视显微镜 |
| 左旋咪唑 | Fisher Scientific | 货号#0215522805 | 盐酸左旋咪唑 |
| Luria肉汤（Lennox） | Apex Bioresearch Products | 货号#11-125 | LB |
| 磁力搅拌器 | Fisher Scientific | 11-100-49S | 磁力搅拌器 |
| MgSO₄4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | 七水合硫酸镁 |
| 显微镜载玻片 | 首映 | 8205 | 单面磨砂载玻片 |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | 货号 S373-500 | 磷酸氢二钠七水合物 |
| NaCl | Fisher Scientific | 货号 S671-500 | 氯化钠 |
| NaOH | Fisher Scientific | 货号 S318-3 | 氢氧化钠颗粒 |
| 平场消色差物镜，f = 100 mm | 徕卡显微系统 | 10411597 | 物镜镜头 |
| 培养皿 | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm × 15 mm |
| Pseudomonas aeruginosa 突变体文库 | 马诺伊尔实验室（华盛顿大学） | P. aeruginosa 突变体文库 | |
| 24孔平底悬浮培养板 | 奥林巴斯塑料 | 25-102 | 用于线虫培养与成像 |
| 三目镜筒 100% M系列 | 徕卡显微系统 | 10450043 | |
| 胰蛋白胨 | ThermoFisher，Difco | 货号#211921 | |
| TX-400 转子 | 赛默飞世尔科技 | 货号#75003181 | 摆桶式转子 |
| 真空驱动滤膜系统 | GenClone | 货号#25-227 | 500 mL，PES 膜，0.22 µm |
| C-Mount 视频物镜 | 徕卡显微系统 | 10447367 | 0.63倍相机适配接头 |
参考文献
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