使用微流控装置制备装载siRNA的脂质纳米颗粒

摘要

基于微流控技术的脂质纳米颗粒（LNP）制备方法在药物递送系统（DDS）中受到关注，包括RNA递送。本方案描述了使用我们自主研发的名为iLiNP的微流控装置进行LNP（负载siRNA的LNP）的制备、生产及评价过程。

摘要

功能性脂质纳米颗粒（LNPs）的开发是药物递送系统（DDS）领域的主要挑战之一。近年来，基于LNPs的RNA递送系统，即RNA负载型LNPs，因其在RNA治疗中的潜力而受到广泛关注。特别是，mRNA负载型LNP疫苗已获批准用于预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19），推动了下一代纳米药物研发的范式转变。对于基于LNPs的纳米药物而言，LNP的粒径是调控其体内分布及性能表现的关键因素。因此，在LNP的制备过程中，精确的粒径控制技术至关重要。本文报道了一种利用名为iLiNP的微流控装置实现粒径可控的LNP制备方案。同时，也采用iLiNP装置制备了siRNA负载型LNPs，并对其进行了评估 体外 实验。展示了LNP粒径的代表性结果，包括载有siRNA的LNPs、Zeta电位、siRNA包封效率、细胞毒性及靶基因沉默活性。

引言

脂质纳米颗粒（LNP）是RNA递送系统中最常用的纳米载体之一。最近，装载mRNA的LNP已被批准作为预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疫苗^1,2,3。通常情况下，LNP的尺寸在其生物分布和药物递送系统（DDS）性能中起着关键作用，包括基因沉默或蛋白表达^4,5,6。因此，在LNP的生产过程中需要一种精确的尺寸控制方法。

多年来，为了制备尺寸可控的脂质纳米颗粒（LNPs），微流控装置受到了广泛关注⁷。2018年，首个经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的载有siRNA的LNPs（例如Onpattro）即采用微流控装置开发而成^8,9。在基于微流控的LNPs制备方法中，脂质溶液与水相溶液分别被引入微流控装置，随后在微通道内混合。为了提高混合效率，已采用混沌混合器装置用于LNPs的制备^10,11,12。该混沌混合器装置可实现特定尺寸LNPs的制备。

一种名为侵入式脂质纳米颗粒制备（invasive lipid nanoparticle production, iLiNP）的简单微流控装置，配备挡板结构，已被开发用于精确控制脂质纳米颗粒（LNP）的粒径^13,14。与混沌混合器装置相比，iLiNP 装置能够在 10 nm 间隔下将 LNP 粒径控制在 20 至 100 nm 范围内。此外，iLiNP 装置可制备载有 siRNA 的 LNPs⁶、载有 mRNA 的 LNPs¹⁵、载有核糖核蛋白的 LNPs¹⁶以及类似外泌体的 LNPs¹⁷。本文旨在介绍 iLiNP 装置的 fabrication（制备）及其载 siRNA 的 LNP 制备流程，并描述由该装置所制备的 LNP 的评价过程。

方案

1. iLiNP 装置的制备

注意：iLiNP 装置采用标准的软光刻方法制备¹⁸。详细的制备方案此前已有报道^10,13。

1. SU-8模具的制备
   1. 将SU-8 3050倾倒至3英寸硅片上，通过旋涂获得厚度为100 µm的SU-8层。
   2. 将硅片置于热板上，在65 °C下预烘5分钟，随后在95 °C下烘烤45分钟。
   3. 烘烤完成后，将硅片放置于台式无掩模光刻系统的载物台上。
   4. 在365 nm波长紫外光下对硅片进行曝光，每个位置曝光1.5秒。
      注：本实验采用台式无掩模光刻系统。该系统可自动对微通道的分段辐照区域（每个位置）进行紫外光曝光。
   5. 紫外曝光后，将硅片置于热板上，在65 °C下烘烤1分钟，随后在95 °C下烘烤5分钟。
   6. 冷却硅片，然后将其浸入SU-8显影液中15分钟，以去除未曝光的SU-8材料。
   7. 使用干燥器和真空泵，对SU-8模具进行三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气处理。
2. iLiNP器件的制备
   1. 按10:1（质量比）混合硅胶基体与聚二甲基硅氧烷（PDMS）固化剂。
   2. 使用真空泵和干燥器对混合物进行脱气处理。
      ​注：PDMS在室温下使用真空泵脱气10分钟。
   3. 将脱气后的PDMS倒入盛有SU-8模具的100 mm培养皿中，厚度控制在0.5至1 cm，随后在80 °C烘箱中烘烤1小时。
   4. 冷却模具后，使用镊子将PDMS基底从SU-8模具上剥离。
   5. 在PDMS基底上打三个孔（直径0.5 mm），并通过氧等离子体清洗仪将PDMS基底与载玻片键合，构建iLiNP器件（见图1）¹³。
   6. 将三根PEEK毛细管（内径0.3 mm，外径0.5 mm）连接至iLiNP器件的进样口和出样口，并用瞬干胶固化密封。
      ​注：PEEK毛细管的长度可根据实验需求调整。

2. 脂质溶液的制备

1. 配制脂质/乙醇溶液：13.4 mM 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、10 mM 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、20 mM 1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、5 mM 1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和 20 mM 胆固醇。实验前将储备液储存于 -20 °C。
2. 为制备载有 siRNA 的脂质纳米颗粒（LNP），按 50/10/38.5/1.5 的摩尔比混合 DOTAP、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2k 溶液。总脂质浓度调整至 8 mM。

3. 水溶液的配制

1. 配制水溶液：使用无 DNase/RNase 的蒸馏水配制 154 mM NaCl（生理盐水）和 pH 4.0 的 25 mM 乙酸盐缓冲液。
2. 使用 0.2 µm 孔径的膜滤器或注射器滤器过滤上述溶液。

4. siRNA/缓冲液溶液的制备

1. 将70 µg siGL4溶解于1 mL 25 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.0）中。
   注意：siGL4用于敲低荧光素酶基因。

iLiNP 装置的设置与脂质纳米颗粒（LNPs）的制备

注意：示意图参见图1。

1. 分别用玻璃注射器吸取脂质溶液和水相溶液（来自步骤3.1和4.1，分别装入不同的注射器）。
   注意：根据LNP评价实验所需用量，调整脂质溶液和水相溶液的体积。
2. 使用注射器连接件将玻璃注射器与PEEK毛细管连接。
3. 设定脂质溶液和水相溶液的流速。
   注意：水相与脂质相的流速比（FRR）范围为3:1至9:1。
4. 通过注射泵将脂质溶液和水相溶液分别引入iLiNP装置。
5. 从iLiNP装置的出口处收集LNP悬浮液至微量离心管中（图1）。

6. LNP 悬液的透析及 LNP 粒径测定

1. 使用透析膜（分子量截留范围为12−14 kDa）在4 °C条件下，分别用生理盐水或D-PBS对POPC脂质纳米颗粒（LNPs）和负载siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）悬浮液进行过夜透析。
   注意：POPC不溶于生理盐水（请参见2.1节）。POPC/乙醇溶液在iLiNP装置中用生理盐水稀释。
2. 将透析后的LNP悬浮液收集至微量离心管中。
3. 用移液器将20–30 µL的LNP悬浮液转移至微量石英比色皿中。
4. 采用动态光散射法（DLS）测定LNP的粒径、粒径分布及多分散指数。

7. LNP 的 Z 电位测定

注意：测量Z电位时，按照仪器制造商的说明使用了粒径分析仪（参见材料表）。

1. 用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）将步骤6.1中获得的LNP悬浮液稀释35倍。
2. 用移液器将700至1000 µL稀释后的LNP悬浮液转移至毛细管池中。
3. 按照仪器制造商的说明测量Z电位。

8. 利用RiboGreen法检测siRNA包封效率

注意：采用Ribogreen法检测siRNA在脂质纳米颗粒（LNP）中的包封率¹⁹。Ribogreen法可在有或无表面活性剂（如TritonX-100）的条件下，测定LNP内外RNA的含量。

1. 用 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）将 2 mg/mL 的 siGL4 稀释至 500 ng/mL 的 siGL4 溶液。
2. 制备 siGL4 溶液的系列稀释液（0、12.5、25、50、100、200 ng/mL），用于绘制 Triton (+) 和 Triton (-) 样品的标准曲线。
3. 用 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）将 LNP 悬液稀释 100 倍。
4. 配制 Triton (+) 溶液：每 10 个 96 孔微孔板孔，混合 980 µL 的 10 mM HEPES（pH 7.4）、20 µL 的 10% w/v TritonX-100 和 1.25 µL RiboGreen。
5. 配制 Triton (-) 溶液：每 10 个 96 孔微孔板孔，混合 1000 µL 的 10 mM HEPES（pH 7.4）和 1.25 µL RiboGreen。
6. 将 siGL4 溶液的系列稀释液和稀释后的 LNP 悬液各取 100 µL 加入黑色 96 孔微孔板的孔中。
   注：每种条件下，siGL4 溶液的系列稀释液和稀释后的 LNP 悬液分别加入四个微孔。
7. 向各孔中加入 100 µL 检测溶液（TritonX-100 (+) 或 Triton (-)）。
   注：每种样品条件下的每个样本，TritonX-100 (+) 溶液加入两个孔，TritonX-100 (-) 溶液加入剩余的两个孔。
8. 将微孔板在室温下孵育 5 分钟。
9. 使用微孔板读数仪在 475 nm 波长下测定荧光强度。
10. 根据以下公式计算 siRNA 包封效率¹⁹。
    

9. 细胞培养

1. 配制含有DMEM、10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和400 µg/mL G418的生长培养基。
2. 将稳定表达萤火虫和海肾荧光素酶（HeLa-dluc）的HeLa细胞在含有上述生长培养基的100 mm组织培养处理过的细胞培养皿中，于37 °C、5% CO₂培养箱中进行培养。

10. 细胞活力检测

1. 在96孔微孔板中接种100 µL HeLa细胞悬液（含生长培养基，6 × 10³ 个细胞/孔）。
   注：细胞计数使用细胞计数板和显微镜完成。
2. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育24小时。
3. 用不含胎牛血清的DMEM培养基将载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）稀释至siRNA终浓度为10和100 nM。
4. 每孔加入100 µL稀释后的载siRNA LNPs悬液。
5. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育4小时。
6. 移除LNPs悬液，每孔加入100 µL含胎牛血清的DMEM培养基（FBS (+)）。
7. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续孵育20小时。
8. 根据试剂盒生产商提供的操作说明，使用市售试剂盒检测细胞活力。
   注：以不含钙镁离子的D-PBS缓冲液（D-PBS (-)）作为阴性对照。

11. 荧光素酶基因敲低实验

1. 在96孔微孔板中接种75 µL HeLa细胞悬液（含4.5 × 10³ 个细胞/孔），使用生长培养基。
2. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育24小时。
3. 用不含FBS的DMEM将载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）稀释至siRNA终浓度为10和100 nM。
4. 每孔加入75 µL稀释后的载siRNA LNPs悬液。
5. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育4小时。
6. 移除LNP悬液，每孔加入75 µL含FBS的DMEM（FBS (+)）。
7. 将微孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续孵育20小时。
8. 根据试剂盒生产商提供的操作说明，使用市售试剂盒检测荧光素酶表达水平。
   注：本实验使用D-PBS (-) 作为阴性对照。

结果

图2A、B展示了在不同流体条件下制备的POPC脂质纳米颗粒（LNP）的粒径分布。基于微流控技术的LNP制备方法可通过总流速（TFR）和流速比（FRR）等流体条件来调控LNP的粒径。与典型的微流控装置（包括混沌混合器装置和流动聚焦微流控装置）相比，iLiNP装置能够实现对LNP粒径的精确调控，粒径范围可控制在20至100 nm之间（图2）。在较高的总流速条件下形成较小粒径的LNP。此外，无论总流速如何，在FRR为5时形成的LNP粒径均小于FRR为3时的粒径¹³。

使用iLiNP装置制备了载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）（图3A）。在制备载siRNA的LNPs时，采用了阳离子脂质DOTAP，以有效将siRNA包封入LNPs中。iLiNP装置生成了粒径为90 nm、分布均一的载siRNA阳离子LNPs（图3A，B）。由于阳离子脂质与带负电荷的siRNA之间存在静电相互作用，siRNA的包封效率达到95%（图3C）。

如图4和图5所示，评估了90 nm大小的载siRNA脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性和基因沉默活性。载siRNA的LNPs在10和100 nM siRNA剂量下表现出一定的细胞毒性。我们还证实，荧光素酶的表达水平随siRNA浓度的增加而降低。在100 nM siRNA剂量下，载siRNA的LNPs可抑制80%的荧光素酶表达。关于LNP粒径对基因沉默活性的影响，已有文献报道^6,13,17。

图1：（A）iLiNP装置的示意图和（B）实物照片。 iLiNP装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）和玻璃基板组成。该装置通过瞬干胶与PEEK毛细管连接。使用注射泵将脂质溶液和siRNA/缓冲液溶液分别引入iLiNP装置中。生成的脂质纳米颗粒（LNP）悬浮液被收集至微量离心管中。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：iLiNP 装置在不同流速比（FRR）下生成的 POPC LNP 尺寸分布。 POPC LNP 尺寸通过动态光散射（DLS）测定。POPC LNP 通过改变总流速和 FRR 制备：（A）3 FRR 和（B）5 FRR。在高总流速条件下形成较小尺寸的 LNP。此外，在 FRR 为 5 时形成的 LNP 尺寸小于 FRR 为 3 时的尺寸。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：载siRNA脂质纳米颗粒（LNPs）的表征。（A）载siRNA的LNPs的粒径分布。siRNA（siGL4）通过阳离子脂质（DOTAP）与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用被包封到LNPs中。（B）载siRNA的LNPs的zeta电位。测量前，将LNP悬浮液用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释。数据以均值±标准差（SD）表示。n = 3。（C）基于DOTAP的LNPs的siRNA包封效率。包封效率通过RiboGreen法测定。数据以均值±标准差表示。n = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：载siRNA脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性。将载siRNA的LNPs用DMEM（不含FBS）稀释，得到siGL4浓度为10和100 nM。将LNP悬液加入HeLa-dLuc细胞中，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育4小时。N.T.：未处理组（D-PBS(-)）。数据以均值±标准差表示。n = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：用载有siRNA的脂质纳米颗粒处理后的荧光素酶基因敲低活性。 载有siRNA的脂质纳米颗粒的制备方法与细胞活力测定中的方法相同。使用Dual-Glo荧光素酶检测试剂系统测定荧光素酶表达水平。N.T.：未处理组（D-PBS(-)）。数据表示为均值 ± 标准差。 n = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

LNP 的尺寸会影响其在体内的分布、抗肿瘤效果以及基因沉默效率。因此，LNP 尺寸控制技术是制备包括RNA递送系统在内的DDS纳米药物的重要方法。本文旨在介绍利用iLiNP装置实现LNP尺寸的精确调控，并将其应用于载siRNA的LNP的制备。iLiNP装置能够将LNP的尺寸控制在20至100 nm范围内（图2）¹³。当通过改变总流速和流速比（FRR）等流动条件来调控LNP尺寸时，应在流动状态稳定约5至10秒后开始收集LNP悬液。从iLiNP装置出口收集的LNP悬液需立即进行透析处理，以缓冲液置换除去乙醇，防止LNP发生聚集。

LNP 尺寸控制是药物递送系统（DDS）领域的主要挑战之一。通常，传统的 LNP 制备方法（如脂质膜水化法）在 LNP 制备完成后需要进行尺寸调节步骤²⁰另一方面，基于微流控的LNP制备方法可通过将脂质溶液和水相溶液引入微流控装置，实现对LNP粒径的控制。^6,11,13尽管透析过程是去除LNP悬浮液中乙醇所必需的，但通过微流控装置与切向流系统联用的连续化工艺有望实现LNP制备过程的自动化。¹⁴根据文献报道，使用聚焦流动微流控装置制备的POPC脂质纳米粒（LNP）尺寸分别为50–60 nm和30–60 nm²¹ 以及混沌混合装置¹⁰与其他微流控装置相比，iLiNP 装置能够将 POPC LNP 的粒径控制在 20 至 100 nm 的较宽范围内。

本研究中采用的iLiNP装置的制备工艺为标准的软光刻技术。因此，iLiNP装置可通过快速成型技术实现大规模生产，并通过使用一次性装置避免溶液间的交叉污染。iLiNP装置可像POPC脂质纳米颗粒（LNP）制备方法一样，用于制备载有siRNA的LNPs。利用iLiNP装置进行LNP制备时，操作者无需任何复杂的操作步骤。基于上述原因，包括iLiNP装置在内的基于微流控的LNP制备方法有望成为标准的LNP制备方法。本文所述的实验方案也可适用于其他用于LNP制备的微流控装置。此外，通过将siRNA/缓冲液替换为含有mRNA的缓冲液，同样可实现载有mRNA的LNPs的制备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）	NOF Corp.	MC-6081
1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）	NOF Corp.	GM-020
1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）	NOF Corp.	CL-8181TA
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）	NOF Corp.	MC-8080
10 × D-PBS（-）	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	048-29805
乙酸	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	017-00251
CellTiter-Blue 细胞活力检测试剂盒	Promega	G8081
胆固醇	Sigma-Aldrich	C8667-5G
桌面无掩模光刻系统	NEOARK CORPORATION	DDB-701-DL4
透析膜	Repligen	132697
Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E2940
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	批号：42G6587K
G418	Nacalai Tesque	08973-14
玻璃基板	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S1111
玻璃注射器	Hamilton	GASSTIGHT 1002
HeLa 细胞			HeLa-dluc 细胞由北海道大学的 Yusuke Sato 博士提供
HEPES	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	342-01375
低糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D6046-500ML
氧气等离子体清洗仪	Femto Science	CUTE-1MP/R
青霉素–链霉素，胰蛋白酶（2.5%）	Thermo Fisher Scientific	15140122
Quant-iT RiboGreen RNA 定量试剂	Thermo Fisher Scientific	R11491
siGL4	北海道系统科学有限公司	siGL4 的正义链和反义链序列分别为 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' 和 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3'。
硅晶圆	GTC
SILPOT 184 W/C（PDMS）	Dow Corning Toray Co., Ltd.		包含硅胶基料和固化剂
乙酸钠	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	192-01075
氯化钠	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.	191-01665
SU-8 3050	日本化药株式会社
注射器连接头	微化学技术研究所有限公司	ISC-011
注射泵	Chemyx	CX07200
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
UltraPure  无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977015
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments	ZEN3600