一种有效的接种方法 Phytophthora capsici 在黑胡椒植株上

摘要

用针刺穿胡椒植株基部茎头是一种简便且省时的损伤方法。本文提供了通过视频详细展示感染胡椒植株的具体操作步骤。

摘要

Piper nigrum L.（黑胡椒）是一种典型的木质藤本植物，是全球重要的经济香料作物。由Phytophthora capsici（辣椒疫霉）引起的根腐病严重影响了黑胡椒的生产，已成为制约产业发展的“瓶颈”问题。然而，黑胡椒抗性分子遗传机制尚不明确，导致新品种培育进展缓慢。建立一种针对黑胡椒植株上Phytophthora capsici的有效接种与精确取样体系，对于研究该植物与病原菌互作至关重要。本研究的主要目的是展示一种详细的方法，即对黑胡椒植株基部茎头进行接种Phytophthora capsici，同时为木质藤本植物的接种提供参考。在接种过程中，先用针刺法损伤黑胡椒植株的基部茎头，随后将菌丝团覆盖于三个刺孔之上，并保持湿润，以利于病原菌充分侵染植株。该方法有效解决了传统接种方法（如灌根法或根部浸泡法）所导致的不稳定性问题，也为研究植物与其它土传植物病原菌之间的互作机制以及农业精准育种提供了有前景的技术手段。

引言

胡椒（Piper nigrum L.）是一种木质攀援植物，也是最重要的香料作物之一。它被称为“香料之王”¹，在亚洲、非洲和拉丁美洲的40多个国家和地区均有种植。由卵菌Phytophthora capsici引起的疫霉根腐病是胡椒最严重的病害。该病原体还可侵染葫芦科植物、茄子、辣椒和番茄^2,3。在胡椒种植中，这种病害有时会导致整片作物毁灭。由于缺乏抗病品种，胡椒种植区域的扩展受到限制，这严重阻碍了中国胡椒产业的发展。为了研究胡椒与Phytophthora capsici之间的互作关系，建立有效的接种方法和精确的取样体系至关重要。

种质资源中抗性的鉴定与筛选是研究病原菌致病性以及抗性品种选育和利用的基本前提。目前广泛应用的方法是根据植物种类和病原菌类群采用多种鉴定手段。近年来发展出的鉴定方法包括群体鉴定、个体鉴定、器官鉴定、组织鉴定、细胞鉴定、生化鉴定和分子鉴定等^4,5。这些领域已取得一定成果，但也存在诸多问题。无论选择何种方法，植物抗性鉴定的基本要求始终一致，即目标明确、结果可靠，且方法应简便、快速、易于标准化。胡椒抗性鉴定也必须遵循这一原则。

在自然田间条件下，抗病性的鉴定可能受到多种环境因素的影响。因此，建议在实验室中利用离体叶片和灌溉根系来鉴定抗病性。取健康植株的幼嫩叶片进行接种 体外 在实验室中，通过接种病原菌以测定病害叶片面积，从而鉴定植物的抗病性⁶。然而， 体外 叶片接种仅可用于一般抗性鉴定，不能用于分子互作研究。尽管如此，抗病状态常在灌溉式根部接种中表现，导致后续抗病分子育种研究存在不确定性。因此，快速简便的室内检测方法至关重要。本研究旨在提供一种实验室抗性鉴定方法。

方案

1. 感染前黑胡椒插条植株的准备

1. 使用已消毒的修枝刀或修枝剪，从健康且生长旺盛的胡椒直立枝条上截取一段长约 40 cm、直径约 0.5 cm 的五节插条。修剪掉插条上部的三个节位处的侧生枝条，保留顶部两个节位，每个节位保留约 10 片完整叶片。
2. 准备由土壤和动物粪肥（牛粪或羊粪）按 1:1 比例混合而成的生根基质。将该基质在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
3. 以约 50° 的倾斜角度将插条插入生根基质中，使第三个节位刚好接触基质表面，且该节位上的腋芽位于基质上方。
   注意：此处使用的袋子尺寸为：高度 40–60 cm，直径 25–30 cm。
4. 向植株根部浇灌 10–20 L 水。将插条置于遮光率为 90%、温度为 25–30 °C 的温室中，以促进生根和生长。

2. 辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici，P. capsici）的培养

注意：胡椒疫霉（Phytophthora capsici）菌种保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所植物保护实验室⁷。

1. 在流动的自来水下刷洗并清洁马铃薯块茎，然后将200 g马铃薯切成1 cm³的立方体。取部分立方体放入含有800 mL双蒸水（ddH₂O）的烧杯中，煮沸20 min。
2. 通过双层纱布进行重力过滤，滤出液体。向滤液中加入20 g葡萄糖和15 g琼脂，用ddH₂O定容至1 L，配制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。在121 °C条件下高压灭菌20 min⁸。
3. 在超净工作台内，将20 mL灭菌后的液态PDA倒入直径为9 cm的圆形培养皿中。将PDA平板开盖放置于超净工作台内过夜，以防止冷凝水形成。
4. 使用接种环从试管内的Phytophthora capsici菌种中挑取菌丝，将接种物以菌丝面接触PDA的方式置于培养皿中。

3. 胡椒的感染

1. 孵育
   1. 在基质表面以上5 cm处、靠近根部的茎段上确定接种区域。
   2. 使用打孔器从培养在培养皿PDA培养基上的Phytophthora capsici菌落生长边缘切取直径为0.5 cm的菌丝圆片。
   3. 用注射器针头刺伤茎部，在选定的接种区域以三角形排列方式打三个孔，每个孔覆盖一个菌丝圆片。将孔的位置设置得彼此靠近，以确保受伤区域被菌丝圆片完全覆盖。
   4. 用灭菌并湿润的棉垫覆盖菌丝圆片，以防止干燥。用聚乙烯条带将棉垫固定在茎上，以保持接种圆片的位置。
      注意：接种后8小时，接种孔变为黑色，病斑随时间推移逐渐扩展。叶片变黄并脱落，接种植株在接种后7–10天死亡。对照植株未出现病斑。Phytophthora capsici接种组与对照组相比，大多数基因的表达发生差异。对感染组织的组织病理学分析表明，Phytophthora capsici定植于木质部中。
2. 采集目标植物材料，并在液氮中速冻后于-80 °C保存，用于后续研究。
   注意：实验前需准备好液氮、塑料袋、记号笔、修枝剪及其他相关材料。
3. 在采集特定植物材料用于实验后，应对所有剩余的植物材料、残留的Phytophthora capsici培养物及培养基，以及本接种实验中使用过的所有器械和实验器皿进行高压灭菌处理。

结果

图1显示了胡椒叶片接种P. capsici后的症状。图2显示了胡椒茎部接种P. capsici后的症状。病原菌从茎基部侵染胡椒植株，症状逐渐表现为叶片黄化、萎蔫、木质部褐变以及导管变黑。图3显示，与对照组相比，接种Phytophthora capsici后大多数基因的表达发生差异。图4通过感病组织的组织病理学分析，证实了Phytophthora capsici在木质部中的定殖。

讨论

在本研究中，通过针刺胡椒植株的基部茎段造成损伤，以建立有效的接种体系。随后将菌丝团覆盖于三个刺孔处，以保持湿度并促进病原菌对植株的有效侵染。接种后，植株叶片变黄脱落，最终导致植株死亡。对照植株未出现任何病斑。大多数基因在接种后表现出差异表达 Phytophthora capsici 与对照组相比。真菌病害导致大量作物出现结构和生理紊乱，造成生产力下降以及生产者经济损失。利用组织学技术对真菌侵入和定殖植物组织方式的结构研究，可详细揭示病原体与植物组织之间的相互作用。这些研究揭示了有助于理解病害单循环的重要方面。对感病组织的组织病理学分析表明 Phytophthora capsici 在木质部定殖。该方法为解决传统接种方法（如土壤浇灌或根部浸泡）所引起的不稳定性问题提供了更优的手段。一种有效的接种与精确取样系统 Phytophthora capsici 对胡椒植株上的植物-病原体互作研究至关重要，同时也为农业精准育种中植物与其他土传植物病原体之间作用机制的研究提供了有前景的方法。

同时，该方案为木本藤本植物的培养提供了更高效的参考。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂粉	Solarbio	A8190
超净工作台	Haier
葡萄糖	Xilong Scientific	15700501
高温灭菌烘箱	Zaelway
培养皿	Biosharp	BS-90-D