一项关于重复经颅磁刺激对恒河猴脑脊液中Aβ和Tau蛋白水平影响的初步研究

摘要

本文描述了一项初步研究的实验方案，旨在探讨不同频率（1 Hz/20 Hz/40 Hz）的重复经颅磁刺激对猕猴脑脊液中Aβ和tau蛋白代谢的影响。

摘要

既往研究表明，非侵入性光闪烁干预和听觉音调刺激可影响大脑中 Aβ 和 tau 蛋白的代谢。作为一种非侵入性技术，重复经颅磁刺激（rTMS）已被用于治疗神经退行性疾病。本研究探讨了 rTMS 对恒河猴脑脊液（CSF）中 Aβ 和 tau 蛋白水平的影响。这是一项单盲、自身对照研究。采用三种不同频率（低频：1 Hz；高频：20 Hz 和 40 Hz）的 rTMS 刺激恒河猴双侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）。通过导管法采集脑脊液样本。所有样本均接受液相芯片检测，以分析脑脊液中的生物标志物（Aβ₄₂、Aβ₄₂/Aβ₄₀、tTau、pTau）。脑脊液生物标志物水平在 rTMS 刺激后随时间发生变化。刺激后，脑脊液中 Aβ₄₂ 水平在所有频率（1 Hz、20 Hz 和 40 Hz）下均呈上升趋势，其中高频刺激组的变化更为显著（p < 0.05），而低频刺激组差异较小。

高频重复经颅磁刺激（rTMS）后，脑脊液中总Tau蛋白（tTau）水平在刺激后即刻显著升高（p < 0.05），并在24小时后逐渐下降。此外，结果显示，磷酸化Tau蛋白（pTau）水平在40 Hz rTMS后即刻升高（p < 0.05）。Aβ₄₂/Aβ₄₀的比值在1 Hz和20 Hz刺激后呈上升趋势（p < 0.05）。低频（1 Hz）刺激对Tau蛋白水平无显著影响。因此，高频（20 Hz和40 Hz）rTMS可能对猕猴脑脊液中Aβ和Tau蛋白水平具有积极作用，而低频（1 Hz）rTMS仅能影响Aβ水平。

引言

淀粉样蛋白-β（Aβ）和tau蛋白是重要的脑脊液生物标志物。Aβ由42个氨基酸组成（Aβ_1-42），是跨膜淀粉样前体蛋白（APP）被β-和γ-分泌酶水解后的产物¹。由于其溶解特性，Aβ_1-42可在脑内聚集形成细胞外淀粉样斑块^1,2。tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要存在于轴突中，参与顺向轴突运输³。异常的tau蛋白过度磷酸化主要由激酶与磷酸酶之间的失衡引起，导致tau蛋白从微管上解离并形成神经原纤维缠结（NFT）¹。在神经退行性过程中，tau蛋白和磷酸化tau蛋白（pTau）被释放到细胞外空间，从而使脑脊液中tau蛋白浓度升高。既往研究表明，脑脊液生物标志物与阿尔茨海默病（AD）大脑的三大主要病理改变相关：细胞外淀粉样斑块、细胞内NFT形成以及神经元丢失⁴。Aβ和tau蛋白的异常浓度在AD早期即已出现，因此可用于AD的早期诊断^5,6。

2016年，Tsai 等人发现，非侵入性光闪烁刺激（40 Hz）可降低早前沉积阶段小鼠视觉皮层中 Aβ_1-40 和 Aβ_1-42 的水平⁷。最近，他们进一步报道，听觉音调刺激（40 Hz）可改善5XFAD小鼠的识别记忆和空间记忆，降低其海马体和听觉皮层（AC）中的淀粉样蛋白水平，并减少P301S tau蛋白病模型中的pTau浓度⁸。这些结果表明，非侵入性技术可能影响Aβ和tau蛋白的代谢。

作为一种非侵入性工具，经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation, TMS）能够对包括脊髓、外周神经和大脑皮层在内的神经组织进行电刺激⁹。此外，它还可以改变受刺激部位大脑皮层的兴奋性以及功能连接。因此，TMS 已被用于神经退行性疾病的治疗及预后评估和诊断检测。TMS 中最常见的临床干预形式——重复经颅磁刺激（rTMS），可诱导皮层激活，调节皮层兴奋性，并调控认知/运动功能。

据报道，20 Hz rTMS 具有 体外 对谷氨酸和Aβ等氧化应激因子具有神经保护作用，并提高了小鼠单克隆海马HT22细胞的整体存活率¹⁰1 Hz rTMS 刺激后，海马体中的 β 位点淀粉样前体蛋白裂解酶 1、APP 及其 C 末端片段显著减少。值得注意的是，海马 CA1 区的长时程增强、空间学习和记忆功能损伤得到逆转^11,12白等人研究了重复经颅磁刺激（rTMS）对β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的伽马振荡功能障碍在工作记忆测试中的影响。他们得出结论，rTMS可逆转Aβ引起的伽马振荡功能障碍，从而对工作记忆产生潜在益处。¹³然而，关于重复经颅磁刺激（rTMS）对tau蛋白代谢的影响，以及rTMS前后脑脊液（CSF）中Aβ和tau动态变化的研究报道较少。本方案描述了在食蟹猴脑脊液中，研究不同频率rTMS（低频：1 Hz；高频：20 Hz和40 Hz）对Aβ和tau水平影响的实验操作流程。

方案

所有实验均遵循中华人民共和国科学技术部制定的《实验动物管理和使用指南》以及《巴塞尔宣言》的原则进行。本研究已获得中国四川大学华西医院（中国成都）动物护理委员会的批准。图1展示了本研究所采用的单盲、自身对照的研究设计。

1. 重复经颅磁刺激（rTMS）设备

1. 使用8字形磁场刺激线圈进行重复经颅磁刺激（rTMS）。

2. 动物

1. 将雄性恒河猴（Macaca mulatta，5 kg，5岁）饲养在单独的笼舍中，自由饮用自来水并提供标准饲料。确保环境条件受控，相对湿度为60-70%，温度为24 ± 2 °C，并维持12:12小时光照:黑暗循环^14,15。所有实验均应依照《实验动物护理与使用指南》进行。

3. 一种经小脑延髓池的脑脊液连续取样方法

1. 由两名经过培训的实验人员执行导管插入术，从延髓池采集脑脊液（CSF）（图2）。
2. 体位
   1. 通过肌肉注射5 mg/kg的唑拉西泮-替来他明（见材料表）对猴子进行麻醉。为确保猴子成功麻醉，应观察其是否出现呼吸深慢、角膜反射迟钝或消失以及四肢肌肉松弛等表现。 在此阶段需持续监测其体温、脉搏、呼吸、黏膜颜色及毛细血管再充盈时间。
   2. 每4小时通过肌肉注射给予2 mg/kg的吗啡。 
   3. 将猴子置于手术台上，采取侧卧位。使其颈部屈曲，背部弓起，并将双膝向胸部方向靠近。
3. 穿刺
   1. 采用无菌技术对腰部区域进行消毒。将脊髓穿刺针插入腰椎L4/L5椎间隙，推进至穿过黄韧带进入腰池时可感受到一次"弹响"。
   2. 继续推进穿刺针，直至第二次出现"弹响"，表示针尖已进入硬脑膜。拔出穿刺针内的针芯，收集脑脊液滴出液。
4. 导管置入
   1. 在荧光透视引导下，将硬膜外导管经穿刺针置入蛛网膜下腔，直至导管漂浮于延髓池内。
5. 采样端口植入
   1. 从穿刺点向头部方向做一条5 cm长的切口，分离皮肤与皮下组织以放置采样端口。将端口连接至硬膜外导管末端，并将端口植入皮下，随后缝合切口。每日对伤口进行消毒以预防感染。
      注：猴子通常在术后当天即可完全恢复。
6. 脑脊液采集
   1. 利用笼具栏杆固定猴子，使其背部保持弯曲状态。
   2. 将注射器插入采样端口中央，经导管从延髓池中抽取脑脊液。弃去最初的0.2 mL脑脊液（导管与端口的总容积为0.1 mL），然后收集1 mL脑脊液用于分析¹⁶。

4. 猴子椅适应性训练

1. 在实验前将猴子固定在猴椅上，以避免干扰rTMS干预过程（图3A，B）。
2. 在猴子清醒状态下采集脑脊液（CSF）用于生物标志物分析，以避免麻醉药物的影响。
3. 在蛛网膜下腔插管后第3天，即实验开始前2周，对猴子进行猴椅适应性训练，每天2次，每次30分钟。

5. 重复经颅磁刺激适应性训练/假刺激

1. 在猴子椅上完成适应性训练后一周，正式实验开始前一周进行重复经颅磁刺激（rTMS）适应性训练/假刺激，以避免刺激过程中产生的振动和声音影响正式实验的进程。
2. 使用假线圈（仅产生振动和声音，不产生磁场）对猴子进行刺激，刺激后给予食物奖励，帮助猴子适应该过程（图3C）。
3. 在猴子椅上每天进行两次rTMS适应性训练，每次30分钟，持续2周。

6. 治疗方案

1. 按照先前所述方法¹⁷，使用三种不同频率（1 Hz/20 Hz/40 Hz）的重复经颅磁刺激（rTMS）刺激猴双侧背外侧前额叶皮层（R-L-DLPFC）。根据国际10-20系统定位DLPFC。
   1. 进行三次不同的rTMS干预，每次干预之间洗脱期超过24小时^18,19。
      1. 第一阶段使用以下参数：rTMS频率为1 Hz，刺激模式由20个脉冲串组成，每个脉冲串包含20次脉冲，脉冲串间间隔10秒，刺激强度为平均静息运动阈值（RMT）的100%，每日两次，连续三天^20,21。
      2. 第二阶段使用以下参数：高频（20 Hz）rTMS脉冲串，刺激强度为100% RMT，持续时间为2秒，脉冲串间间隔28秒，每次会话共2,000次刺激（每串40次刺激，共50串），每日两次，连续三天²²。
      3. 第三阶段使用以下参数：伽马频率（40 Hz）rTMS脉冲串，刺激强度为100% RMT，每串持续1秒，脉冲串间间隔28秒。每次会话的总脉冲数保持与20 Hz rTMS相同，每日两次，连续三天^7,22。

7. 脑脊液生物标志物

1. 分析四种脑脊液生物标志物：Aβ₄₂、Aβ₄₂/Aβ₄₀、总 Tau 蛋白（tTau）和磷酸化 Tau 蛋白（pTau）。

8. 脑脊液采集与指数检测方法

1. 采用微创导管插管法采集脑脊液（CSF）。
2. 利用笼子的栏杆固定猴子，并使其背部弯曲。指示另一操作者将注射器插入采样口的中心位置，确保通过导管抽取脑脊液。
3. 在5个时间点（每个时间点间隔3分钟，采集4份样本）采集脑脊液：rTMS前、rTMS后0 h/2 h/6 h/24 h^23,24,25。针对3种频率共采集60份样本；编号后置于-80 °C冰箱中保存，最长保存1个月。实验结束后，按照试剂盒说明书对所有样本进行液相芯片检测（参见材料表）。

9. 统计分析

1. 所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。
2. 当样本量较小时，采用 Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验。采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）及 Tukey 多重比较检验。
   注意：采用双尾检验，P 值（two-tailed）< 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

结果显示，重复经颅磁刺激（rTMS）可影响恒河猴脑脊液中的Aβ和tau蛋白水平。在不同频率（1 Hz、20 Hz和40 Hz）的rTMS刺激后，脑脊液生物标志物水平随时间发生变化。

Aβ₄₂ 和 Aβ₄₂/Aβ₄₀
如图4A所示，经过1 Hz rTMS刺激后，Aβ₄₂水平在24小时内逐渐升高（p < 0.05），在洗脱期后恢复至基线水平。类似地，在以20 Hz rTMS刺激猴双侧DLPFC后，Aβ₄₂水平随时间推移而升高，并在刺激后6小时达到峰值（p < 0.05）。然而，在以40 Hz rTMS刺激后，Aβ₄₂水平在rTMS后即刻显著升高（p < 0.05），随后缓...

讨论

Aβ_1-42 是阿尔茨海默病（AD）公认的生物标志物，属于与脑内 Aβ 代谢及淀粉样斑块形成相关的脑脊液核心生物标志物，已在临床试验和临床实践中广泛应用²⁶。近期研究表明，脑脊液中 Aβ₄₂/Aβ₄₀ 比值比单独检测 Aβ₄₂ 更能有效诊断 AD，因其更能反映 AD 特征性病理变化^27,28。在神经退行性变过程中，Tau 蛋白和磷酸化 Tau（pTau）蛋白会释放到细胞外空间，导致脑脊液中 Tau 浓度升高^20,29。因此，脑脊液中的 Aβ_1-42、Aβ₄₂/Aβ₄₀、总 Tau（tTau）和 pTau 已被确认为联合生物标志物，并被纳入修订后的阿尔茨海默病诊断标准¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一次性麻醉穿刺包	Weigao, 山东, 中国
CCY-I 磁场刺激仪	YIRUIDE MEDICAL, 武汉, 中国
GraphPad Prism 7.0 版	GraphPad Software, Inc., 圣地亚哥, 加利福尼亚州, 美国
人淀粉样蛋白 β 和 Tau 蛋白磁珠检测试剂盒	EMD Millipore 公司, 比勒里卡, 马萨诸塞州 01821, 美国		液相芯片检测
MILLIPLEX Analyst 5.1	EMD Millipore 公司, 比勒里卡, 马萨诸塞州 01821, 美国
猴用固定椅 HH-E-1	Brainsight, 剑桥, 马萨诸塞州 02140, 美国
Zoletil 50	Virbac, 法国		唑拉西泮–替来他明