需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠脑海马组织的机械与酶解联合解离

4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63007

⸱

2021年10月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

本文内容

摘要

本神经细胞解离方案适用于起始材料较少的样本，可获得高活力的单细胞悬液，用于后续分析，并可选择性地进行固定和染色步骤。

摘要

本神经组织解离方案（基于商用成年动物脑组织解离试剂盒的实验流程改进而来）优化了组织处理步骤，为后续精细分析（如流式细胞术或单细胞测序）做好充分准备。神经组织解离可通过机械解离（如使用滤膜、剪切技术或移液吹打）、酶消化，或两者结合的方式进行。由于神经元细胞结构脆弱，获得高存活率、真正单细胞悬液且细胞碎片最少的目标极具挑战性，而单细胞分析对悬液质量要求极高。实验数据表明，采用自动化机械解离与酶消化相结合的方法，能够稳定获得高存活率（>90%）的单细胞悬液，有效克服上述困难。尽管部分步骤需要一定的手动操作技巧，但整体流程减少了样本操作环节和潜在的细胞损失。本文详细描述了该流程的每一步操作，旨在帮助其他实验室成功解离少量神经组织，为后续分析提供高质量样本。

引言

海马体最早由一位博洛尼亚的解剖学家朱利奥·凯撒·阿兰齐奥（Julio Cesare Aranzio）在16世纪描述1。在命名这一新发现的结构时，阿兰齐奥很可能受到其与海马属（Hippocampus）海马极为相似的外形启发1。海马体参与应激反应，但其最为人所知的功能是在学习和记忆中的作用。更具体而言，海马体负责陈述性记忆和空间记忆的编码与提取1。

海马或称海马本体，可分为CA1（阿蒙角）、CA2和CA3三个亚区1。与其他神经系统区域相比，海马具有若干独特的特征，包括其可塑性以及持续发生神经发生的潜能2。神经发生是指神经干细胞增殖并分化为神经元，随后整合到已有神经网络中的过程。在成体中，神经发生仅局限于齿状回的颗粒下区以及侧脑室的室下区（以及嗅球）3。尽管神经发生在胚胎发育阶段最为活跃，但它是一种终生持续的过程3,4。因此，本文将重点讨论海马中的成体神经发生。

脑室下区和颗粒下区是具有神经发生能力的微环境，其中含有室管膜细胞和血管细胞，以及未成熟和成熟的神经干细胞谱系5。小胶质细胞作为免疫细胞参与这些微环境，调控神经发生过程6。神经前体细胞是神经干细胞产生的非干细胞子代细胞7。脑室下区存在三种类型的神经前体细胞：放射状胶质样B型细胞、C型过渡性扩增前体细胞以及A型成神经细胞3,8。脑室下区中分裂较慢的B型神经前体细胞可分化为快速分裂的C型细胞8，随后C型细胞进一步分化为A型细胞8。这些成神经细胞通过吻侧迁移流迁移到嗅球，最终分化为中间神经元或少突胶质细胞9。嗅球中的中间神经元在嗅觉短期记忆和联想学习中起关键作用，而少突胶质细胞则负责胼胝体轴突的髓鞘形成9。大多数成年个体的神经发生发生在齿状回的颗粒下区，在此区域可发现放射状1型和非放射状2型神经前体细胞3。大多数神经前体细胞最终将分化为齿状回颗粒神经元和星形胶质细胞10。星形胶质细胞通过缝隙连接相互连接，形成网络以调节突触可塑性、突触活动及神经元兴奋性5。颗粒细胞作为齿状回主要的兴奋性神经元，将来自内嗅皮层的信息传入CA3区11。

可通过免疫磁珠或免疫荧光分离策略分离神经干细胞群体12,13。神经组织尤其难以解离；尝试解离时常导致细胞活力差的样本，和/或无法获得下游分析所需的单细胞悬液。神经组织的解离可通过机械解离（如使用滤器、剪切技术或移液吹打）、酶消化，或多种技术联合使用来完成14,15。在一项评估神经组织解离方法的研究中，比较了仅通过移液吹打进行的手动机械解离与结合使用移液吹打及多种酶消化的处理方式在细胞活力和质量上的差异15。质量评估依据是制备的悬液中细胞团块以及DNA或亚细胞碎片的多少15。仅接受手动机械解离的胶质瘤组织悬液，其细胞活力显著低于使用dispase或DNase、胶原酶与透明质酸酶联合处理的样本15。Volovitz等人指出不同解离方法在细胞活力和质量方面存在差异，并强调解离不充分可能降低下游分析的准确性15。

在另一项研究中，作者比较了超过60种不同的培养神经元细胞解离方法及其组合方式14。这些方法包括八种不同的移液吹打手动机械解离方式，五种酶在三个不同时间点的单独孵育比较，以及机械解离与酶消化的不同组合或两种酶联合使用的方案14。所有机械方法均未能获得单细胞悬液14。四种单独酶处理、十种联合酶处理以及四种机械解离与酶消化的组合方法成功获得了单细胞悬液14。其中，先使用TrypLE再使用Trypsin-EDTA进行酶消化对样本的解离效果最佳14。但值得注意的是，经TrypLE和/或Trypsin-EDTA处理的样本倾向于形成胶状团块14。尽管该研究是在培养细胞上进行的，但它揭示了仅使用移液吹打或仅使用酶消化方法的局限性。

目前尚缺乏手动与自动机械解离方法的并行比较。然而，有研究团队通过流式细胞术，比较了结合商用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶消化试剂盒对完整小鼠脑组织进行手动与半自动机械解离的效果16。使用组织解离仪处理时，获得活细胞的结果更为一致16。解离后，作者还分离出了Prominin-1阳性细胞、神经前体细胞以及小胶质细胞16。在三种分离细胞群体中的两种中，与手动处理相比，使用解离仪处理的样本所获得细胞的纯度略高16。Reiß 等人指出，操作者之间移液技术的差异会影响组织解离过程中活细胞得率的可重复性16。作者总结认为，自动机械解离可实现样本处理的标准化16。

本文所述的解离方法结合了全自动机械解离与酶消化法，并使用商业成人脑组织解离试剂盒配套的溶液17。与标准方案不同，该优化方案减少了对样本的操作步骤，可获得高活性的单细胞悬液，且适用于起始组织量极少的样本处理。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验按照美国医科大学机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行。购入6月龄雌性C57Bl6/J野生型小鼠，每4只一组共同饲养，置于恒定的12小时光照/12小时黑暗循环环境中。

1. 试剂的准备

  1. 制备可固定的活/死细胞染料储备液。用 20 µL 二甲基亚砜（DMSO）重悬荧光染料。
  2. 将小瓶用铝箔包裹，标记为"重悬液"，并在 -20 °C 下保存，最长可保存六个月。
  3. 制备含肝素的 0.9% 生理盐水溶液。将一瓶肝素钠（每 10 mL 含 10,000 USP 单位）的内容物溶于 1 L 双蒸水（ddH2O）中。
  4. 每只动物准备约 45 mL，4 °C 下保存，最长可保存一周。
  5. 配制 1% 多聚甲醛（PFA）。
    1. 在通风橱内，将加热板预热至 50 °C。在微波炉中将玻璃烧杯中的 100 mL 双蒸水（ddH2O）加热至约 60 °C。加入磁力搅拌子，然后转移至加热板上。
    2. 在通风橱内称取 1 g PFA，加入 ddH2O 烧杯中。加入 0.1125 g 氢氧化钠（NaOH）晶体，搅拌至完全溶解（5–10 分钟）。
    3. 加入 0.4 g 一碱磷酸钠（NaPO4- monobasic），搅拌至溶解（2–5 分钟）。用滤器过滤溶液，并用 HCl 和 NaOH 调节 pH 至 7.4。
    4. 置于冰上或 4°C 冷却 30 分钟后保存。
      注意：可将溶液分装为每份 1.5 mL，在 -20 °C 下保存一年。避免反复冻融。若解冻后溶液变浑浊或出现沉淀，则不应继续使用。
      警告：有毒、易燃。操作 PFA 时必须在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。
  6. 用 1 mL 缓冲液 A 重悬冻干的酶 A。切勿涡旋震荡该溶液。
    注意：酶 A 与缓冲液 A，以及缓冲液 A、Y 和 Z 均为市售成年脑组织解离试剂盒17中的组分。
  7. 将酶 P 分装为每份 50 µL，酶 A 分装为每份 10 µL。根据试剂盒说明书，于 -20 °C 保存，最长可保存六个月。避免反复冻融。

2. 实验当天

  1. 将台式离心机预冷至 4 °C。
  2. 将PFA分装样品置于冰箱中，使其逐渐解冻。
  3. 将重悬的活/死染料置于避光处（例如抽屉内），在室温下解冻。
  4. 配制牛血清白蛋白（BSA）缓冲液。将0.5 g BSA加入100 mL不含钙和镁的1×杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，pH 7.2）中。
  5. 加入搅拌子，在搅拌器上混合30分钟。转移至50 mL锥形管中，于4 °C保存。
    注意：务必使用新鲜配制的BSA缓冲液。
  6. 配制活/死染料工作液。将1 µL重悬后的活/死染料原液加入360 µL D-PBS中，于室温避光保存（例如置于抽屉或盒子中）。每份样品准备50 µL工作液。

3. 灌注

  1. 将含肝素的生理盐水置于冰上。
  2. 打开氧气，将小动物麻醉蒸发器系统的流量计指示球调节至 1 L/min。确保氧气压力充足，并备有足够的异氟烷。
  3. 调节蒸发器旋钮至 3.5%（用于诱导和维持麻醉）。
  4. 用生理盐水/肝素溶液预冲灌注泵管路，设置流速为 6 mL/min。
  5. 将小鼠放入诱导室，开启呼吸机，等待数分钟直至小鼠无反应。通过施加有害夹捏后无足底回缩反应，确认麻醉深度足够。
  6. 将小鼠仰卧于解剖托盘上，鼻部置于鼻罩中，再次通过有害夹捏后无足底回缩反应确认完全麻醉状态。用针固定四肢于托盘上。
  7. 用 20% 乙醇喷洒动物腹部。
  8. 使用镊子夹住下腹部并提起皮肤，用剪刀剪开毛发和皮肤直至肋骨下缘。
  9. 从肋骨下方向两侧肩部各做一斜向切口。
  10. 小心切除膈肌（避免损伤肺和心脏），切除肋骨以暴露心脏。
  11. 仔细切断心脏周围的所有结缔组织。
    注意：步骤 3.10–3.11 至关重要，需熟练且灵巧地操作。
  12. 用剪刀剪开右心房（心脏左上方的暗色叶状结构），关闭输送至呼吸机的异氟烷气流。
  13. 用镊子固定心脏，使蝴蝶针斜面朝上，保持针头水平且与动物体平行，穿刺左心室。
  14. 固定针头位置，启动泵，以至少 30 mL 生理盐水/肝素溶液进行灌注，直至流出液体变浑浊，且肝脏和肺颜色变苍白。
    注意：步骤 3.13–3.14 至关重要，需熟练且灵巧地操作。
  15. 关闭泵，拔出针头，将小鼠转移至解剖区域。

4. 解剖

  1. 使用大型手术剪将头部离断。
  2. 从头部后方剪开毛发至眼睛处，剥离皮肤以暴露颅骨。
  3. 在两眼之间夹住颅骨，于颅骨后部10点钟和2点钟位置各做一剪切，然后沿颅骨正中矢状线向先前两眼之间的切口处做一长切口（操作时保持剪刀尖端朝上，避免损伤脑组织）。
  4. 用镊子将颅骨两侧分开，用刮匙取出脑组织，放入盛有冷D-PBS的60 mm玻璃培养皿中，并置于冰上（图1）。
  5. 使用手术刀或剃刀分离两侧大脑半球，随后去除嗅球和小脑。
  6. 用镊子去除中脑组织，直至海马体暴露。
  7. 用镊子固定脑组织，再用另一把镊子轻轻将每个半球中的海马体剥离出来，并将两个海马体转移至含有冷D-PBS的已标记1.5 mL离心管中。
  8. 将装有小鼠两个海马体的样本管置于冰上。

5. 为每个样本配制酶混合液1和2

注意：对于大于 2 mL 的体积，使用 10 mL 移液管；对于 200 µL–2 mL 的体积，使用 1000 µL 移液器；对于 21–199 µL 的体积，使用 200 µL 移液器；对于 2–20 µL 的体积，使用 20 µL 移液器；对于小于 2 µL 的体积，使用 0–2 µL 移液器。

  1. 每个样本分别在室温下解冻一份酶P和一份酶A。
  2. 配制酶混合液1：将50 µL酶P与1900 µL缓冲液Z加入已标记的C管中（材料表）。
  3. 配制酶混合液2：向已解冻的10 µL酶A中加入20 µL缓冲液Y。

6. 成年小鼠脑组织解离方案17

注意：处理样本时，除非另有说明，应将试管置于室温下的试管架中，而 BSA 和 D-PBS 应保持在冰上。

  1. 打开组织解离仪。
  2. 使用镊子将海马组织块转移至C管中。
  3. 向C管中加入30 µL酶混合液2。旋转管盖直至感到阻力，然后继续拧紧直至发出咔嗒声。
  4. 将C管倒置放入解离仪的指定位置；样品将显示为已选中状态（图2）。将加热器牢固覆盖在C管上。
  5. 按下文件夹图标，选择收藏夹文件夹，滚动并选择37C_ABDK_02程序。点击确定将该程序应用于所有已选中的C管，然后点击开始（图2）。
  6. 为每个样品标记一个50 mL离心管。
  7. 在每个50 mL离心管上放置一个70 µm细胞滤筛，并用2 mL BSA缓冲液润湿。
  8. 程序完成后，从解离仪上取下加热器和C管。
  9. 向样品中加入4 mL BSA缓冲液，并将混合液转移至50 mL离心管上的细胞滤筛中。
  10. 向C管中加入10 mL D-PBS，盖紧管盖，轻轻摇晃溶液，然后将其转移至50 mL离心管上的细胞滤筛中。
  11. 弃去细胞滤筛和C管。将悬液在4 °C下以300 × g离心10分钟，随后吸除并弃去上清液。

7. 去除碎片

  1. 用1550 µL冷的D-PBS重悬沉淀，并将悬液转移至已标记的15 mL锥形管中。
  2. 加入450 µL冷的去碎片溶液 ，上下吹打混匀（切勿涡旋震荡）。
    注意：去碎片溶液为商用成年动物脑组织解离试剂盒17中的组分。
  3. 沿锥形管管壁缓慢将1 mL冷的D-PBS轻柔铺加在细胞悬液上方。重复此操作，直至总铺加体积达到2 mL。
    注意：此步骤至关重要，需熟练且精准操作。
  4. 在4 °C条件下以3000 × g离心10分钟，加速度和刹车均设为最大。
    注意：若分层不清晰，需重复步骤7.2–7.3。最后在4 °C条件下以1000 × g离心10分钟。
  5. 此时悬液应分为三层清晰的液层（图3）。吸除最上层液体，用移液器枪头来回扫动以吸除中间白色层。尽可能去除中间层，同时避免扰动最底层。
    注意：此步骤至关重要，需熟练且精准操作。
  6. 加入2 mL冷的D-PBS，上下吹打混匀。
  7. 在4 °C条件下以1000 × g离心10分钟，加速度和刹车均设为最大。吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于1 mL BSA缓冲液中。
    ​注意：此时可将细胞重悬于适当的缓冲液中，进行磁性标记与分离，为单细胞测序做准备。

8. 细胞计数

  1. 根据现有细胞计数仪的制造商说明书进行细胞计数（一种可选仪器见材料表）

9. 活/死染色

  1. 将剩余的 900 µL（来自步骤 7.7）在 4 °C 条件下以 1000 × g 离心 10 分钟，加速度和刹车均设为最大。
  2. 在样品离心的同时，为每个样品标记一个流式管，并用铝箔包裹以减少光照。
  3. 吸除并弃去上清液。
  4. 将沉淀重悬于 50 µL 已稀释的活/死染料（先前配制）中。
    注意：此步骤应在避光条件下进行。关闭室内顶灯以实现低光照环境。
  5. 将每个样品转移至相应标记的流式管中，在室温下避光孵育 8–10 分钟（例如置于抽屉或盒子中）。
  6. 加入 500 µL BSA 缓冲液，在 4 °C 条件下以 1000 × g 离心 10 分钟，加速度和刹车均设为最大。
  7. 吸除并弃去上清液。
    ​注意：沉淀可能不可见；保留少量缓冲液，以免意外吸走沉淀。此时可将细胞重悬于适当的缓冲液中，进行封闭处理，并用特异性抗体染色。参见 补充文件 1 中的示例方案18。

10. 固定（可选）

  1. 将沉淀重悬于200 µL的1%多聚甲醛（预先配制）中，在4 °C孵育15分钟。
  2. 加入500 µL D-PBS洗涤，于4 °C以300 × g离心10分钟。
  3. 吸除上清液。
    注意：沉淀可能不可见；应保留少量缓冲液，以免误吸沉淀。
  4. 将沉淀重悬于200 µL D-PBS中，于4 °C保存，可保存至多3天。

11. 流式细胞术

  1. 标记新试管的滤膜盖。
  2. 使用 1 mL 移液器，将每个样品移液至滤膜盖上。
  3. 在 4 °C 条件下以 200 x g 短暂离心，仅使离心机达到 200 x g 后即停止运行。
  4. 送至流式细胞术检测中心进行后续分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

样本在核心设施使用流式细胞仪进行处理，并使用流式分析软件包对所得数据进行评估。此前已分析了补偿对照——活/死染料染色和阴性对照。若使用多种荧光染料，应为每种抗体准备荧光减一（FMO）对照和单染对照。实验样本的光谱重叠补偿根据所分析的对照计算得出。对于细胞群体鉴定，采用分层设门策略。第一道门在前向散射（细胞大小）对侧向散射（颗粒度）图中排除碎片19,20。随后排除死细胞（图4、图5、图6、补充图1、补充图2、补充图3 和 补充图4）。下一道门排除髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein）阳性的细胞（补充图4）。对剩余细胞，生成每种荧光染料阳性细胞的密度图（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该神经组织解离方案中的多个步骤需要熟练的技术和操作灵巧性——包括灌注、上清液吸取以及髓鞘去除。在整个灌注过程中，必须保持内脏器官的完整性（仅需移除膈肌并夹闭心脏）；尤其需避免使用蝶形针刺入心脏的上部腔室。尽管所需含肝素的生理盐水量因情况而异，但当有透明液体从心脏流出时，表明灌注已完成。大脑必须完全且正确地灌注到位，此时其外观将呈现偏白色（图1）。通过充分灌注，红细胞去除步骤变得多余，从而避免了对样本的额外操作，减少细胞丢失的风险。随后的去碎片步骤则需要稳定的操作手法。为了在D-PBS覆盖后离心形成清晰分层（图3），在转移或移液过程中不得扰动各层。此外，在吸取最上两层时，应移除足够的悬液以清除过量的细胞碎片，同时仍保留足够量的样本。这一步骤至关重要，因为死细胞更易发生非特异性结合并产生自发荧光22,23，进一步凸显了选择一种能够持续获得高细胞活力方法的重要性。最后，在吸取上清液时，沉淀物并不总是可见的，因...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Aimee Rogers 提供实践培训和持续的产品支持。感谢 Amanda Burke 博士在持续的问题排查和讨论澄清方面给予的帮助。感谢 Meredith Joheim 和 UAMS 科学传播小组对本文稿的语法编辑和格式整理。 本研究由 NIH R25GM083247 和 NIH 1R01CA258673（A.R.A）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific02-682-003Basix，混合颜色
15 mL Falcon管Becton Dickinson 实验室用品欧洲公司352009聚苯乙烯
25 mL 血清学移液管Fisher Scientific14-955-235
5 mL 圆底聚苯乙烯试管Falcon352052
500 mL 真空过滤/储存瓶系统康宁431097
70 μm细胞滤筛Fisher Scientific08-771-2
成年脑组织解离试剂盒Miltenyi Biotec 130-107-677包含酶P、缓冲液Z、缓冲液Y、酶A、缓冲液A、去残渣溶液
铝箔Fisher Scientific01-213-105
抗ACSA-2-PE-Vio770，小鼠，克隆株 REA969Miltenyi Biotec130-116-246
抗髓鞘碱性蛋白Sigma-AldrichM3821-100UG
抗PSA-NCAM-PE，人、小鼠和大鼠，克隆号2-2BMiltenyi Biotec130-117-394
BD LSRFortessaBD
BSASigma-AldrichA7906-50G
CD11b-VioBlue，小鼠，克隆号 REA592Miltenyi Biotec130-113-810
CD31 抗体Miltenyi Biotec130-111-541
陶瓷加热板搅拌器Fisher Scientific11-100-100SH
二甲基亚砜Fisher ScientificBP231-100
乙醇Greenfield Global Pharmco111000200
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
精细剪刀 - 锐利精细科学工具14060-09灌注
FlowJoBD(v10.7.0)
gentleMACS C 管Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo 组织解离器（带加热模块）Miltenyi Biotec130-096-427
Gibco DPBS (1X)赛默飞世尔科技14190144
玻璃烧杯Fisher Scientific02-555-25A
肝素钠Fresenius Kabi504011
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒ThermoFisherL34965
磁力搅拌子Fisher Scientific14-513-51
诺伊斯弹簧剪Fine Science Tools15012-12解剖
多聚甲醛Sigma-Aldrich441244-3KG喷雾造粒，95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10Rainin30389270
吸头 GP LTS 250 µL 960A/10Rainin30389277
移液器吸头 RT LTS 1000 µL FL 768A/8Rainin30389213
Rainin Pipet-Lite XLS（2、20、200、1000） μLRainin30386597
RBXMO FITC XADSFisher ScientificA16167
带盖圆形冰桶Fisher Scientific07-210-129
带细胞筛网帽的圆底管Falcon100-0087
S1 移液管助吸器赛默飞世尔科技9541
刮勺 &与探针Fine Science Tools10090-13解剖 &灌注
Surflo 翼型输液套件 23 G x 3/4"泰尔茂SV-23BLK蝴蝶针
试管架Fisher Scientific14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR 离心机赛默飞世尔科技已停止或其它标准台式离心机
可变流速蠕动泵Fisher Scientific13-876-2低流量模型
小鼠VetFlo启动套装Kent ScientificVetFlo-MSEKIT麻醉面罩、管路、诱导室、活性炭罐
VetFlo 单通道麻醉系统蒸发器Kent ScientificVetFlo-1210S0.2–4 LPM
Vi-CELL XR 细胞活力分析仪贝克曼库尔特生命科学731196细胞计数
Vi-CELL XR 4 袋样本瓶贝克曼库尔特生命科学383721细胞计数

参考文献

  1. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
  2. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
  3. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).
  5. Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
  6. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
  7. Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
  8. Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
  9. Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
  10. Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
  11. Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
  12. Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
  13. Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
  14. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
  15. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
  16. Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
  17. Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
  18. Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
  19. Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
  20. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).
  22. Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
  23. Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
  24. Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
  25. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  26. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
  27. Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
  28. Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).
  29. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
  30. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
  31. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
  32. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
  33. O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
  34. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

小鼠脑海马组织的机械与酶解联合解离
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。