本神经细胞解离方案适用于起始材料较少的样本，可获得高活力的单细胞悬液，用于后续分析，并可选择性地进行固定和染色步骤。
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本文内容
摘要
摘要
本神经组织解离方案（基于商用成年动物脑组织解离试剂盒的实验流程改进而来）优化了组织处理步骤，为后续精细分析（如流式细胞术或单细胞测序）做好充分准备。神经组织解离可通过机械解离（如使用滤膜、剪切技术或移液吹打）、酶消化，或两者结合的方式进行。由于神经元细胞结构脆弱，获得高存活率、真正单细胞悬液且细胞碎片最少的目标极具挑战性，而单细胞分析对悬液质量要求极高。实验数据表明，采用自动化机械解离与酶消化相结合的方法，能够稳定获得高存活率（>90%）的单细胞悬液，有效克服上述困难。尽管部分步骤需要一定的手动操作技巧，但整体流程减少了样本操作环节和潜在的细胞损失。本文详细描述了该流程的每一步操作，旨在帮助其他实验室成功解离少量神经组织，为后续分析提供高质量样本。
引言
海马体最早由一位博洛尼亚的解剖学家朱利奥·凯撒·阿兰齐奥（Julio Cesare Aranzio）在16世纪描述1。在命名这一新发现的结构时，阿兰齐奥很可能受到其与海马属（Hippocampus）海马极为相似的外形启发1。海马体参与应激反应，但其最为人所知的功能是在学习和记忆中的作用。更具体而言，海马体负责陈述性记忆和空间记忆的编码与提取1。
海马或称海马本体，可分为CA1（阿蒙角）、CA2和CA3三个亚区1。与其他神经系统区域相比，海马具有若干独特的特征，包括其可塑性以及持续发生神经发生的潜能2。神经发生是指神经干细胞增殖并分化为神经元，随后整合到已有神经网络中的过程。在成体中，神经发生仅局限于齿状回的颗粒下区以及侧脑室的室下区（以及嗅球）3。尽管神经发生在胚胎发育阶段最为活跃，但它是一种终生持续的过程3,4。因此，本文将重点讨论海马中的成体神经发生。
脑室下区和颗粒下区是具有神经发生能力的微环境，其....
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方案
实验按照美国医科大学机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行。购入6月龄雌性C57Bl6/J野生型小鼠，每4只一组共同饲养，置于恒定的12小时光照/12小时黑暗循环环境中。
1. 试剂的准备
- 制备可固定的活/死细胞染料储备液。用 20 µL 二甲基亚砜（DMSO）重悬荧光染料。
- 将小瓶用铝箔包裹，标记为"重悬液"，并在 -20 °C 下保存，最长可保存六个月。
- 制备含肝素的 0.9% 生理盐水溶液。将一瓶肝素钠（每 10 mL 含 10,000 USP 单位）的内容物溶于 1 L 双蒸水（ddH2O）中。
- 每只动物准备约 45 mL，4 °C 下保存，最长可保存一周。
- 配制 1% 多聚甲醛（PFA）。
- 在通风橱内，将加热板预热至 50 °C。在微波炉中将玻璃烧杯中的 100 mL 双蒸水（ddH2O）加热至约 60 °C。加入磁力搅拌子，然后转移至加热板上。
- 在通风橱内称取 1 g PFA，加入 ddH2O 烧杯中。加入 0.1125 g 氢氧化钠（NaOH）晶体，搅拌至完全溶解（5–10 分钟）。
- 加入 0.4 g 一碱磷酸钠（NaPO4- monobasic），搅拌至溶解（2–5 分钟）。用滤器过滤....
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结果
样本在核心设施使用流式细胞仪进行处理，并使用流式分析软件包对所得数据进行评估。此前已分析了补偿对照——活/死染料染色和阴性对照。若使用多种荧光染料，应为每种抗体准备荧光减一（FMO）对照和单染对照。实验样本的光谱重叠补偿根据所分析的对照计算得出。对于细胞群体鉴定，采用分层设门策略。第一道门在前向散射（细胞大小）对侧向散射（颗粒度）图中排除碎片19,20。随后排除死细胞（图4、图5、图6、补充图1、补充图2、补充图3 和 补充图4）。下一道门排除髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein）阳性的细胞（补充图4）。对剩余细胞，生成每种荧光染料阳性细胞的密度图（
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讨论
该神经组织解离方案中的多个步骤需要熟练的技术和操作灵巧性——包括灌注、上清液吸取以及髓鞘去除。在整个灌注过程中，必须保持内脏器官的完整性（仅需移除膈肌并夹闭心脏）；尤其需避免使用蝶形针刺入心脏的上部腔室。尽管所需含肝素的生理盐水量因情况而异，但当有透明液体从心脏流出时，表明灌注已完成。大脑必须完全且正确地灌注到位，此时其外观将呈现偏白色（图1）。通过充分灌注，红细胞去除步骤变得多余，从而避免了对样本的额外操作，减少细胞丢失的风险。随后的去碎片步骤则需要稳定的操作手法。为了在D-PBS覆盖后离心形成清晰分层（图3），在转移或移液过程中不得扰动各层。此外，在吸取最上两层时，应移除足够的悬液以清除过量的细胞碎片，同时仍保留足够量的样本。这一步骤至关重要，因为死细胞更易发生非特异性结合并产生自发荧光22,23，进一步凸显了选择一种能够持续获得高细胞活力方法的重要性。最后，在吸取上清液时，沉淀物并不总是可见的，因.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Aimee Rogers 提供实践培训和持续的产品支持。感谢 Amanda Burke 博士在持续的问题排查和讨论澄清方面给予的帮助。感谢 Meredith Joheim 和 UAMS 科学传播小组对本文稿的语法编辑和格式整理。 本研究由 NIH R25GM083247 和 NIH 1R01CA258673（A.R.A）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix，混合颜色 |
| 15 mL Falcon管 | Becton Dickinson 实验室用品欧洲公司 | 352009 | 聚苯乙烯 |
| 25 mL 血清学移液管 | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管 | Falcon | 352052 | |
| 500 mL 真空过滤/储存瓶系统 | 康宁 | 431097 | |
| 70 μm细胞滤筛 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 成年脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | 包含酶P、缓冲液Z、缓冲液Y、酶A、缓冲液A、去残渣溶液 |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| 抗ACSA-2-PE-Vio770，小鼠，克隆株 REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| 抗髓鞘碱性蛋白 | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| 抗PSA-NCAM-PE，人、小鼠和大鼠，克隆号2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue，小鼠，克隆号 REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| 陶瓷加热板搅拌器 | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| 乙醇 | Greenfield Global Pharmco | 111000200 | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 精细剪刀 - 锐利 | 精细科学工具 | 14060-09 | 灌注 |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C 管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo 组织解离器（带加热模块） | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | 赛默飞世尔科技 | 14190144 | |
| 玻璃烧杯 | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| 肝素钠 | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher | L34965 | |
| 磁力搅拌子 | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| 诺伊斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15012-12 | 解剖 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | 喷雾造粒，95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| 吸头 GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| 移液器吸头 RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS（2、20、200、1000） μL | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| 带盖圆形冰桶 | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| 带细胞筛网帽的圆底管 | Falcon | 100-0087 | |
| S1 移液管助吸器 | 赛默飞世尔科技 | 9541 | |
| 刮勺 &与探针 | Fine Science Tools | 10090-13 | 解剖 &灌注 |
| Surflo 翼型输液套件 23 G x 3/4" | 泰尔茂 | SV-23BLK | 蝴蝶针 |
| 试管架 | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR 离心机 | 赛默飞世尔科技 | 已停止 | 或其它标准台式离心机 |
| 可变流速蠕动泵 | Fisher Scientific | 13-876-2 | 低流量模型 |
| 小鼠VetFlo启动套装 | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | 麻醉面罩、管路、诱导室、活性炭罐 |
| VetFlo 单通道麻醉系统蒸发器 | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR 细胞活力分析仪 | 贝克曼库尔特生命科学 | 731196 | 细胞计数 |
| Vi-CELL XR 4 袋样本瓶 | 贝克曼库尔特生命科学 | 383721 | 细胞计数 |
参考文献
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
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