本方案详细介绍了从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）无细胞转录-翻译（TX-TL）系统中高效合成大量重组蛋白的改进方法。
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本文内容
摘要
摘要
Streptomyces 属是临床抗生素和工业化学品的重要来源。Streptomyces venezuelae ATCC 10712 是一种生长迅速的菌株，天然可产生氯霉素、嘉德霉素和匹克罗霉素，因此是下一代合成生物学底盘的理想候选 菌株。因此，开发能够加速 S. venezuelae ATCC 10712 以及其他 Streptomyces 属模式菌株发展的遗传工具，对于天然产物的工程化改造与发现具有重要意义。为此，本方案提供了一种专用于 S. venezuelae ATCC 10712 的无细胞系统，以实现高 G+C (%) 基因的高效异源表达。该方案适用于在96孔或384孔板中进行小规模（10–100 μL）的批处理反应，且反应体系具有可放大的潜力。该无细胞系统性能稳定，在最简配置下即可实现多种重组蛋白的高产量表达（约 5–10 μM）。本研究还整合了一套广泛的质粒工具集，可用于实时监测 mRNA 和蛋白质的合成，以及对带标签蛋白进行凝胶内荧光染色。该方案还可与高通量 基因表达表征工作流程相结合，或用于研究放线菌基因组中高 G+C (%) 基因编码的酶促通路。
引言
无细胞转录-翻译（TX-TL）系统为合成生物学提供了一个理想的原型构建平台，可用于实现快速的设计-构建-测试-学习循环，这是合成生物学的概念性工程框架1。此外，人们日益关注在开放反应环境中利用TX-TL系统进行高价值重组蛋白的生产2，例如在抗体-药物偶联物中引入非标准氨基酸3。具体而言，TX-TL需要细胞提取物、质粒或线性DNA以及能量溶液，以在批处理或半连续反应中催化蛋白质合成。尽管大肠杆菌（Escherichia coli）TX-TL是目前占主导地位的无细胞系统，但多种新兴的非模式TX-TL系统也因其在不同应用中的潜力而受到关注4,5,6,7,8。TX-TL的关键优势包括灵活的可扩展性（纳升级至升量级）9,10、高度可重复性以及自动化工作流程8,
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方案
注意：G YM 培养基和平板琼脂，以及 S30A 和 S30B 洗涤缓冲液的配方见表 1和表 2。
1. 溶液的配制与一般指导
- 除特别说明外，所有溶液、细胞（培养后）和细胞提取物在制备后均需置于冰上。
- 1 M Mg-谷氨酸盐、4 M K-谷氨酸盐、40% (w/v) PEG 6000、1 g/mL 聚乙烯磺酸在室温下保存，其余试剂均保存于 -80 °C。尽量减少冻融次数，以避免化学降解。
- 配制能量溶液储备液（见表3），如3-磷酸甘油酸（需调节pH），请参照大肠杆菌（E. coli）TX-TL 实验方案41中的指导进行。
注意：所有组分均可完全溶于ddH2O中，并分装后储存于-80 °C冰箱中。 - 将单个储备液或能量溶液（后文描述）在冰上解冻。将氨基酸储备液在42 °C下涡旋加热约15–30分钟，以充分溶解所有氨基酸。
- 由于部分氨基酸（L-Cys、L-Tyr、L-Leu）在冰上易析出沉淀，因此在尽量减少静置时间的前提下，将该溶液置于室温，并使用涡旋振荡器助溶。
- 按照计算好的体积（表3）加入储备液和水，使用涡旋振荡器....
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结果
本详细方案仅供参考，旨在帮助用户建立一种 链霉菌属 基于TX-TL系统的 S. venezuelae ATCC 10712 模式菌株（图1）。用户可能希望研究其他 链霉菌属s菌株；然而，对于其他具有较长倍增时间或不同生长偏好的菌株，其生长/收获阶段需要进行个性化优化，以获得最佳结果。在代表性结果中，来自pTU1-A-SP44-mScarlet-I 标准质粒（图2 和 图3) 已优化以在其中实现高效表达 S. venezuelae 采用多种检测方法（SDS-PAGE、荧光）的TX-TL系统。此外，该标准质粒经过改造，用于展示一系列次级代谢酶的合成 S. rimosus (图2)5最后，展示了一个放大规模的天然产物生物.......
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讨论
本文描述了一种高产的 S. venezuelae TX-TL 协议，其操作步骤详细且简便，无论是有经验的还是初次使用 TX-TL 系统的研究人员均可轻松实施。为了建立一种最简化但高产的 S. venezuelae TX-TL 协议5,26，本研究移除了现有 Streptomyces45 和 E. coli TX-TL41 协议中的多个步骤。推荐的工作流程是确保 S. venezuelae 在选定的丰富培养基中快速生长，以便能够在傍晚接种最终培养物。这样可在次日早晨收获处于生长高峰期的细胞，并允许 研究人员在同一天内完成细胞收获和活性细胞提取物的制备。通过遵循这一简化的操作流程，预计单个研究人员可在三天内方便地完成整个实验。此外，还提供了一套配套的质粒工具包，用于支持 S. venezuelae TX-TL 系统.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此致谢以下研究资助：英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）[EP/K038648/1] 为SJM在PSF处担任博士后研究员提供的资助；威康信托基金会（Wellcome Trust）资助的帝国理工学院ISSF博士后奖学金，由SJM在PSF处获得；英国皇家学会研究基金 [RGS\R1\191186]；威康信托基金会种子奖 [217528/Z/19/Z]，由SJM在肯特大学获得；以及全球挑战研究基金（GCRF）为KC在肯特大学攻读博士学位提供的奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2.5 L 超高产量摇瓶 | Thomson | 931136-B | |
| 3-磷酸甘油酸（3-PGA）（>93%） | Sigma | P8877 | |
| 384 孔黑底透明底板 | ThermoFisher | 10692202 | |
| 氯化铵（98%） | Fluorochem | 44722 | |
| ATP、CTP、UTP、GTP（100 mM 溶液，>99%） | ThermoFisher | R0481 | |
| 羧苄青霉素（联系供应商确认纯度） | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-葡萄糖（联系供应商确认纯度） | Melford | G32040 | |
| DFHBI（≥98%，HPLC） | Sigma | SML1627 | |
| 二硫苏糖醇（DTT）（联系供应商确认纯度） | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2（联系供应商确认纯度） | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| 葡萄糖-6-磷酸（>98%） | Sigma | G7879 | |
| HEPES 游离酸（联系供应商确认纯度） | Melford | B2001 | |
| L-谷氨酸半镁盐四水合物（>98%） | Sigma | 49605 | |
| 氯化镁（98%） | Fluorochem | 494356 | |
| 麦芽提取物 | Sigma | 70167-500G | |
| 聚乙二醇-6000（PEG-6000） | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96 孔微透析板，10K 分子量截留（MWCO） | ThermoFisher | 88260 | |
| 聚（乙烯硫酸）钾盐 | Sigma | 271969 | |
| 谷氨酸钾（>99%） | Sigma | G1149 | |
| RTS 氨基酸混合物试剂盒 | 5 Prime | 2401530 | |
| 氯化钠（99%） | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 固相萃取柱（1 g） | Sigma | 505471 | |
| 酵母提取物 | Melford | Y1333 | |
| 仪器设备 | |||
| 酶标仪 | BMG | Omega |
参考文献
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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重印与许可
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