数十年来，脂质单层膜一直被用作形成二维（2D）蛋白质晶体以进行结构研究的基础。它们在空气-水界面处稳定，可作为电子成像的薄层支撑材料。本文介绍了制备用于生物学研究的脂质单层膜的成熟步骤。
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摘要
摘要
电子晶体学是进行高分辨率结构解析的有力工具。在适宜条件下，可溶性蛋白或膜蛋白等大分子能够生长形成高度有序的二维（2D）晶体。所获得的二维晶体质量对于后续通过二维图像处理实现的最终结构重构分辨率至关重要。多年来，脂单层已被用作支持层，以促进外周膜蛋白以及可溶性蛋白的二维结晶。该方法也可用于整合膜蛋白的二维结晶，但需要更广泛的实证研究，以确定促进蛋白向脂单层分配的去垢剂和透析条件。脂单层在气-水界面处形成，其中极性的脂质头部基团保持在水相中并处于水合状态，而非极性的酰基链尾部则伸入空气中，从而打破表面张力并使水面展平。头部基团所带电荷或特有的化学基团可对溶液中的蛋白质产生亲和力，促进其结合并形成二维阵列。新形成的含有二维阵列的脂单层可直接转移至电子显微镜（EM）载网上，该载网为覆碳铜网，用于捞取并支撑晶体阵列。在本研究中，我们描述了一种用于低温电子显微镜（cryo-EM）成像的脂单层方法。
引言
在有利情况下，通过蛋白质的二维晶体或螺旋阵列进行电子衍射可达到亚纳米级分辨率1,2,3。特别值得关注的是在接近天然环境中的重组二维膜蛋白阵列或晶体1。由于晶体可作为信号放大器，增强特定空间频率下结构因子的强度，电子晶体学能够以高分辨率探测比单颗粒冷冻电镜更小的目标，例如小分子。当电子束穿过有序的二维蛋白质阵列时会发生衍射，根据图像平面在探测器上的记录位置不同，可生成衍射图样或晶格图像4。随后可提取并处理这些衍射强度，以重构晶体的二维投影结构。电子的散射截面大于X射线，其散射主要遵循卢瑟福模型，基于电子与分子中带电原子之间的库仑相互作用5。二维膜晶体的厚度通常小于100 nm，适合电子透射，且不会在样品内部发生动力学散射6。已有研究表明，电子晶体学是研究膜蛋白高分辨率结构信息以及脂质-蛋白相互作用的有力工具7,8,9,....
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方案
1. 聚四氟乙烯块的制备
- 使用耐化学腐蚀的聚四氟乙烯（PTFE）树脂制备特氟龙块。使用普通钻头在块体上钻孔，具体尺寸见图1所示。
2. 单层脂质制备
注意：预计操作时间：30–45 分钟
- 脂质储备液的制备
- 使用8.91 mL氯仿、0.99 mL甲醇和0.01 mL浓度为10 mg/mL的脂质，配制体积比为9:1（v/v）的氯仿/甲醇溶液，得到终浓度为0.01 mg/mL的脂质混合液。
- 聚四氟乙烯（Teflon）板的制备
- 将聚四氟乙烯板置于甲醇浴中超声处理5分钟。
- 用热水清洗15分钟。
- 用蒸馏水冲洗。
- 将聚四氟乙烯板放入干燥器中干燥30分钟，不使用时保持真空状态（图1）。
3. 在缓冲液储液池上形成脂单层
注意：预计操作时间：1.5 小时....
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结果
沉积在透射电镜（TEM）载网上的一层脂质单层膜无需染色即可在透射电子显微镜下观察。单层膜的存在可通过与电子束路径中无样品区域之间的对比度差异来识别。覆盖有脂质单层膜的区域局部对比度较低，而无覆盖区域由于电子束穿过空孔时未发生散射，呈现更亮的照明（图3）。
为了筛选二维单层结晶的条件，可使用负染电镜或冷冻电镜成像来观察样品形貌。当载物台倾斜时，若单层覆盖了载网孔洞，则可通过增强的边缘衬度进行观察。若形成晶体，图像的功率谱或周期图将显示出傅里叶衍射斑点。尺寸较小（< 200 nm）且随机取向的晶体可能在功率谱中呈现高强度的环状衍射信号。若未形成晶体，则功率谱中不会出现傅里叶衍射斑点。
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讨论
脂质单分子层是一种强大的工具，可促进生物大分子结构研究中大型二维晶体的生长。为了成功在气-水界面制备完整且无缺陷的脂质单分子层，强烈建议在实验当天新鲜配制脂质，因为脂质酰基链的氧化可能导致单分子层中分子排列紊乱，从而对最终晶体的形成产生不利影响。购买的粉末状脂质应使用氯仿:甲醇混合溶剂溶解，这种溶剂常用于溶解磷脂35。氯仿:甲醇溶剂可预先配制并储存于密封的玻璃小瓶中。当将溶解后的脂质滴加至气-水界面时，需等待氯仿:甲醇溶剂从缓冲液表面完全蒸发。在本实验中，确保脂质单分子层形成以及二维晶体生长所需的适当等待时间至关重要。通常，脂质单分子层及二维阵列的形成大约需要30至60分钟的孵育时间18。
当脂质单层膜正确形成后，应确保脂质能有效促进二维晶体阵列的形成。缓冲液成分需经过优化，以稳定二维阵列的构建，尤其是在使用DOGS-NTA-Ni脂质时18,36。若缓冲液中含有高浓度的E.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本论文的撰写工作部分得到了美国陆军研究办公室（W911NF2010321）以及亚利桑那州立大学向 P.-L.C. 提供的启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱， 1 × 25 mg，10 mg/mL，2.5 mL |
| 小移液管用吸头 | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| 真空干燥器 | 南方实验器材公司（Southern Labware） | 55207 | |
| 电镜载网 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm 孔，1.3 µm 间距 |
| 滤纸 | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | 直径 90 mm |
| 玻璃巴斯德移液管 | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| 哈密尔顿注射器（25 µL） | Hamilton Company | 80465 | |
| 哈密尔顿注射器（250 µL） | Hamilton Company | 81165 | |
| 哈密尔顿注射器（5 µL） | Hamilton Company | 87930 | |
| 哈密尔顿注射器（500 µL） | Hamilton Company | 203080 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| 培养皿 | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| 聚四氟乙烯（特氟龙）块 | Grainger | 55UK05 | 60 µL 孔，带侧向进样口，手工制作 |
| 镊子 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 78325 | 多种型号 |
| 超纯水 | |||
| 超声波清洗器 | VWR | 97043-996 |
参考文献
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W.
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