使用一锅法两步法合成1-(2-[18F]氟乙基)-L-色氨酸

摘要

本文介绍了一种在放射化学合成系统中采用一锅法、两步策略合成1-(2-[¹⁸F]氟乙基)-L-色氨酸的方法，该化合物是一种用于研究色氨酸代谢的正电子发射断层成像示踪剂，具有较高的放射化学产率、高对映体过量以及良好的重复性。

摘要

犬尿氨酸通路（KP）是色氨酸代谢的主要途径。大量证据表明，KP的代谢产物由于具有免疫调节、神经调节和神经毒性作用，在肿瘤增殖、癫痫、神经退行性疾病和精神疾病中发挥关键作用。目前最常用的用于示踪色氨酸代谢的正电子发射断层扫描（PET）显像剂是 α-[¹¹C]甲基-L-色氨酸([¹¹C]AMT，其半衰期较短，仅为20分钟，且放射性合成过程繁琐。需在现场配备回旋加速器以进行[C¹¹C]AMT。仅有少数几家中心能够生产[¹¹C]AMT 用于临床前研究和临床调查。因此，开发一种半衰期更长、性能更佳的替代性显像剂具有重要意义 体内 动力学，且易于自动化的检测方法亟需建立。1-(2-[¹⁸F]氟乙基-L-色氨酸是一种氟-18标记的色氨酸类似物，已在细胞系来源异种移植模型、患者来源异种移植模型及转基因肿瘤模型中报道用于临床前研究。

本文介绍了一种采用一锅法、两步策略合成1-(2-[¹⁸F]氟乙基)-L-色氨酸的放射性合成方案。利用该方案，放射性示踪剂的放化产率可达20 ± 5%（以合成结束时衰变校正计，n > 20），放化纯度和对映体过量均超过95%。该方案具有前体用量少、每步反应溶剂体积不超过0.5 mL、对潜在有毒试剂4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷（K222）的用量低、以及采用环境友好且可注射的流动相进行纯化等优点。该方案可便捷地在商用模块中配置，用于临床研究用1-(2-[¹⁸F]氟乙基)-L-色氨酸的制备。

引言

在人体中，色氨酸是日常饮食中的一种必需成分。色氨酸主要通过犬尿氨酸通路（KP）进行代谢。该通路由两种限速酶催化，分别为吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）。超过95%的色氨酸被转化为犬尿氨酸及其下游代谢产物，最终生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，后者对细胞能量转换至关重要。犬尿氨酸通路是免疫系统的关键调节因子，同时也是神经可塑性和神经毒性效应的重要调控通路^1,2。色氨酸代谢异常与多种神经系统、肿瘤、精神疾病及代谢性疾病相关，因此，放射性标记的色氨酸类似物已被广泛应用于临床研究。目前临床上研究最多的两种色氨酸放射性示踪剂是¹¹C-α-甲基-L-色氨酸（[¹¹C]AMT）和¹¹C-5-羟基色氨酸（¹¹C-5-HTP）³。

20世纪90年代，¹¹C-5-HTP被用于可视化分泌血清素的神经内分泌肿瘤⁴，以及诊断和监测转移性激素难治性前列腺腺癌的治疗⁵。随后，它被用作成像工具，用于量化内分泌胰腺中的血清素能系统⁶。¹¹

方案

警告：本实验方案涉及放射性物质。任何额外的放射性物质剂量都可能成比例地增加不良健康效应（如癌症）的发生风险。研究人员必须遵循“合理可行尽量低”（ALARA）的剂量原则，在热室或铅屏蔽罩内进行充分防护，以指导放射性合成实验的实施。在放射性合成过程中的任何辐射暴露步骤，均须尽量减少直接接触时间、使用铅屏蔽装置，并保持最大安全距离。在整个实验过程中，必须佩戴辐射剂量监测徽章和手部监测环，并频繁检测可能被污染的表面，例如手套、袖套和鞋底。放射性物质的使用、运输和处置必须严格遵守核管理委员会（NRC）以及地方和机构的相关法规。

1. 初始准备

1. 为半制备型高效液相色谱（HPLC）配制含10%乙醇的50 mM醋酸钠/醋酸流动相。
   1. 取3 mL冰醋酸置于洁净的1000 mL容量瓶中，加入900 mL超纯水（25 °C时电阻率为18百万欧姆·厘米），加入约8 mL 6 M氢氧化钠溶液，使用校准后的pH计和pH试纸将pH值调节至5.5。待溶液冷却至室温后，用超纯水定容至1000 mL，得到50 mM醋酸钠/醋酸溶液（pH 5.5）。
   2. 用0.2 µm膜滤器对溶液进行真空过滤，并将滤液转移至两个500 mL溶剂瓶中。
   3. 取约250 mL上述缓冲液置于500 mL容量瓶中。使用量筒量取50 mL美国药典（USP）级乙醇，加入该容量瓶中，再用50 mM醋酸钠/醋酸溶液定容至500 mL，并用pH试纸测定其pH值。

结果

反应路线如图1所示。放射性标记包括以下两个步骤：1）甲苯磺酸酯放射性标记前体与[¹⁸F]氟化物反应生成¹⁸F标记的中间体；2）中间体中的tert-丁氧羰基和tert-丁基保护基团去保护，得到终产物L-[¹⁸F]FETrp。两个反应步骤均在100 °C下持续进行10分钟。

在接收商业供应商提供的[¹⁸F]氟化物之前，需准备好试剂瓶、制剂瓶和色谱柱；平衡半制备型和质量控制（QC）系统；并运行QC系统适用性测试。L-[¹⁸F]FETrp放射性合成的详细流程见图2。简要而言，首先对放射性进行检测，并将放射性物质转移至放射化学合成系统；经过捕获/释放步骤后，在反应瓶中通过共沸法干燥[¹⁸F]氟化物。第一步完成[¹⁸F]氟化物的引入后，加入酸以脱除两个官能团的保护基团，随后进行碱中和。将反.......

讨论

色氨酸是人体必需的一种氨基酸，它在情绪、认知功能和行为的调节中发挥着重要作用。由于放射性标记的色氨酸衍生物，特别是碳-11标记的[¹¹C]AMT，在绘制5-羟色胺合成图谱^38,39、肿瘤的检测与分级⁴⁰、癫痫手术的引导^41,42以及糖尿病治疗反应评估⁴³等方面具有独特作用，已被广泛研究。然而，[¹¹C]AMT的半衰期较短且放射性标记过程繁琐，限制了其广泛应用。目前，研究人员正在致力于开发氟-18标记的色氨酸代谢示踪剂。两篇近期的综述文章总结了氟-18标记色氨酸显像剂的开发进展及其成像特性^3,28。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[18F]氟化物在[18O]H2O	PETNET Solutions 公司	N/A
4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷	ACROS	291950010	Kryptofix 222 或 K222，98%
乙酸	ACROS	222142500	99.8%
乙腈	Sigma-Aldrich	271004	无水，99.8%
安捷伦 1260 高效液相色谱系统	安捷伦科技	Agilent 1260	安捷伦 1260 系列
分析型手性高效液相色谱柱	Sigma-Aldrich	12024AST	Astec CHIROBIOTIC T，25 cm × 4.6 mm
二氧化碳，60磅	Airgas	REFR744R200S	99.99%
D-FETrp 标准参照物	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	定制合成
空的无菌小瓶	Jubilant HollisterStier	7515	20 mm 封口，10 mL
乙醇	Decon Labs	2716	200 证明，USP 级别。 ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm 注射器滤器，0.22 µ米，聚偏氟乙烯，无菌	Fisher Scientific	09-720-3
盐酸	Sigma-Aldrich	30721	≥37%
异丙醇	Decon Labs	8316	70%，无菌
L-[18F]FETrp 放射性标记前体	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	定制合成
L-FETrp 标准参照物	Affinity Research Chemicals Inc	N/A	定制合成
轻质C8柱	沃特斯	WAT036770	Sep-Pak  C8 加强型光 cartridges
20 G × 1 针头	Becton-Dickinson & Co.	305175
20 G × 1 针头 ½	Becton-Dickinson & Co.	305176
21 G 针头 × 2	Becton-Dickinson & Co.	305129
中性氧化铝	沃特斯	WAT023561	Sep-Pak 氧化铝 N plus light
尼龙膜（0.20 µm	MilliPore	GNWP04700	47 mm
Pall Acrodisc 25 mm 注射器无菌滤器	Pall Corporation	4907
PETCHEM 放射化学合成系统	PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI	N/A	放射性合成仪
pH 试纸 2.0 - 9.0	EMD Millipore	1.09584.0001
碳酸钾	Sigma-Aldrich	367877	99.995%
季铵甲基胺光反应盒	沃特斯	186004051	Sep-Pak QMA light
半制备型 C18 HPLC 柱	Phenomenex	00D-4253-N0	100 × 10 mm
半制备型手性高效液相色谱柱	Sigma-Aldrich	12034AST	Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
23.4% 氯化钠注射液	APP Pharmaceutical, LLC	18730	USP 级别
0.9% 氯化钠注射液	Hospira	NDC 0409-4888-10	USP 级
氢氧化钠	霍尼韦尔	306576	99.99%
脊髓穿刺针，20 G × 3 ½	Becton-Dickinson & Co.	405182
无菌酒精消毒片	BioMed Resource Inc.	PC661
无菌空瓶，2 mL	Hollister Stier	7505ZA	13 mm 封口
无菌空瓶，30 mL	Jubilant HollisterStier	7520ZA	20 mm 封口
3 mL，聚丙烯/聚乙烯注射器，鲁尔锁扣	Air-Tite	4020-X00V0
5 mL，聚丙烯/聚乙烯注射器，鲁尔锁扣	Becton-Dickinson & 公司	309646
注射器，  PP/PE，10 mL，NORM-JECT	Air-Tite	4100-000V0
1 mL鲁尔滑动式注射器	Becton-Dickinson & 公司	309659
注射器，3 mL，鲁尔锁	Becton-Dickinson & Co.	309657
超高纯氩气	Airgas	AR UHP300	99.999%
超纯水	MilliporeSigma	ZRQSVP300	Direct-Q 3 市政水纯化与超纯水制备系统