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免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

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DOI：

10.3791/63052

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2021年10月15日

 ,  ,  ,  , 
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠和人类细胞系中纯化MHC I类和II类肽复合物的实验方案，可获得高质量的免疫肽组学数据。该方案重点介绍使用商业化抗体进行样品制备的方法。

摘要

免疫肽组学是一个新兴领域，推动并指导着疫苗和免疫疗法的开发。更具体地说，它指的是利用质谱（MS）技术平台研究主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子所呈递的肽段组成的科学。在基于质谱的免疫肽组学工作流程中，样本制备对于获取具有治疗相关性的高质量数据至关重要。本文详细描述了通过免疫亲和纯化方法从小鼠（EL4和A20）及人源（JY）细胞系的质量控制样本中分离MHC I类和II类分子相关肽段的逐步操作步骤。文中全面介绍了从这些细胞系中分离MHC相关肽段所需的各种试剂和特异性抗体，包括验证抗体与磁珠结合效率以及MHC-肽复合物从磁珠上洗脱效率的操作步骤。该实验方案可用于建立和标准化免疫肽组学工作流程，也可用于评估新方案的性能。此外，该方案不仅为非专业研究人员提供了理想的起点，还有助于提高免疫肽组学样本制备过程在不同实验人员之间以及不同实验室之间的可重复性。

引言

近十年来，对MHC相关肽段谱的研究兴趣已超越学术界，延伸至生物技术和制药行业。事实上，在癌症领域，发现可靶向的肿瘤特异性新抗原已成为工业界的重要研究方向，旨在开发临床免疫疗法，推动个体化肿瘤治疗的发展1,2,3。从根本上讲，MHC相关肽段在全身广泛呈递，反映细胞的胞内状态，在多种疾病条件下具有重要意义，包括自身免疫、移植、感染性疾病、炎症、癌症和过敏等1,4。因此，MHC相关肽段（在人类中称为人类白细胞抗原（HLA）配体）具有重要的医学价值，统称为免疫肽组（immunopeptidome）5。

质谱法（MS）是一种强大的分析方法，可用于表征免疫肽组6,7，包括发现肿瘤特异性新抗原8,9,10,11。进行免疫肽组学实验的典型工作流程包括三个主要步骤：1）样本制备以分离MHC相关肽段，2）通过质谱法获取数据，3）使用多种计算软件工具进行数据分析12。本可视化方案中所述的高质量样本制备对于基于质谱的免疫肽组学研究项目的成功至关重要。下述方案重点是从已建立的细胞系中分离MHC I类和II类分子相关的肽段，这些细胞系适用于生成高质量的免疫肽组学数据。本方案中展示了来自这些细胞系的代表性结果。

方案

本方案改编自已建立的多种实验方法13,14,15,16,17,18,19,20。主要的MHC I类和II类肽段免疫亲和纯化（IP）流程如图1所示。有关所用细胞系和抗体的详细信息，请参见材料表。

1. 抗体与珠粒的偶联（第1天）：将抗体偶联到溴化氰活化的Sepharose珠粒上

注意：每次新实验均需配制新鲜溶液。试剂和溶液配方清单请参见材料表和补充表1。所有步骤均在室温（RT）下进行。当使用新抗体时，应通过收集关键等分试样（见“可选”标注）并进行考马斯亮蓝染色SDS-PAGE（图2）来检测其结合效率。

  1. 琼脂糖 CNBr 小球的活化
    1. 每份样品称取 80 mg 琼脂糖 CNBr 活化小球，转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
    2. 为促进干燥小球的重悬，先加入 5 mL 1 mM HCl，上下吹打 5 次；然后向离心管中再加入 8.5 mL 1 mM HCl 至满。
    3. 使用旋转仪在室温下以 20 rpm（每分钟转数）旋转 30 分钟。在室温下以 200 × g 离心 2 分钟，吸弃上清液。
    4. 向小球沉淀中加入 500 µL 偶联缓冲液，转移至新的 2.0 mL 离心管中，并留作步骤 1.2.2 使用。
  2. 抗体与 CNBr 活化小球的偶联
    1. 在新的 2.0 mL 微量离心管中，加入 2 mg 用于分离 MHC I 类或 II 类肽段的抗体（根据厂家提供的浓度），再用偶联缓冲液定容至 1 mL，使抗体终浓度为 2 mg/mL。
    2. 将步骤 1.1.4 中的小球在室温下以 200 × g 离心 2 分钟，吸弃上清液。
    3. 将抗体溶液加入含有活化小球的 2.0 mL 微量离心管中。
    4. （可选）取 18 µL 样品（INPUT），加入 6 µL 4x SDS-PAGE 上样缓冲液，立即冷冻保存。
    5. 将步骤 1.2.3 的微量离心管置于旋转仪上，以 20 rpm 旋转 120 分钟。在 200 × g 条件下离心 2 分钟，吸弃上清液。
    6. （可选）取 18 µL 上清液（未结合的抗体），加入 6 µL 4x SDS-PAGE 上样缓冲液，立即冷冻保存。
  3. 抗体偶联小球的封闭与洗涤
    1. 向步骤 1.2.5 得到的抗体偶联小球中加入 1 mL 0.2 M 甘氨酸溶液，使用旋转仪在室温下以 20 rpm 旋转 60 分钟。
    2. 以 200 × g 离心 2 分钟，吸弃上清液，加入 1 mL PBS（磷酸盐缓冲液）。
    3. 以 200 × g 离心 2 分钟，吸弃上清液。
    4. （可选）取 18 µL 上清液（未结合抗体，最后一次洗涤液），加入 6 µL 4x SDS-PAGE 上样缓冲液，立即冷冻保存。
    5. 向步骤 1.3.3 中的小球加入 1 mL PBS。
    6. （可选）取 18 µL 小球混合物（与抗体偶联的小球），加入 6 µL 4x SDS-PAGE 上样缓冲液，立即冷冻保存。
    7. 4 °C 保存，当日用于步骤 2.5。
      ​注意：小球可在免疫捕获前一天制备，但更长时间的储存尚未经过测试。

2. 细胞裂解及使用抗体偶联磁珠进行免疫捕获（第1天）

注意：不同细胞类型的 MHC 分子水平各不相同，建议对每个细胞上 MHC/HLA 分子的数量进行定量21 （图 4A）。我们建议每次免疫沉淀（IP）至少使用 1 × 108 个细胞。该细胞数量相当于使用含 0.5% Chaps 的缓冲液溶解 JY、EL4 和 A20 细胞后获得的 6–10 mg 蛋白质。为制备用于免疫沉淀的细胞沉淀，应收集细胞，离心，并用 5 mL PBS 洗涤两次。随后，细胞沉淀可保存在 1.5 mL 微量离心管或 15 mL 锥形管中，于 -80 °C 储存，直至进行免疫沉淀实验。需注意，免疫沉淀实验可使用新鲜收集的或冻存的细胞沉淀进行。

  1. 为分离 MHC I 类或 II 类肽段，将含有 1 × 108 个细胞的冷冻沉淀物置于掌心温育管底，使其融化。向沉淀中加入 500 µL PBS，上下吹打至悬液均匀。
    注意：根据细胞类型不同，细胞沉淀体积可能差异较大。若 500 µL PBS 不足以溶解细胞沉淀，可增加 PBS 用量，直至吹打时细胞易于分散。
  2. 测量 PBS 中重悬的细胞沉淀总体积，并转移至新的 2 mL 微量离心管中。如体积过大，可分装至多个离心管。
  3. 加入与上一步测得的 PBS 重悬细胞沉淀体积相等的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂的 PBS 配制的 1% CHAPS 缓冲液，每 10 mL 缓冲液加入 1 片蛋白酶抑制剂），最终裂解缓冲液中 CHAPS 浓度为 0.5%。
  4. 将样品置于旋转仪上，4 °C、10 rpm 旋转孵育 60 分钟。随后在 4 °C 下以 18,000 × g 离心 20 分钟（使用最大刹车），收集上清液（含 MHC-肽段复合物），转移至新的 2.0 mL 微量离心管中。
  5. 将步骤 1.3.7 中的抗体偶联磁珠在 200 × g 离心 2 分钟，回收磁珠并弃去上清液。
  6. 将步骤 2.4 中获得的细胞裂解液上清转移至抗体偶联磁珠中，置于旋转仪上，4 °C、10 rpm 旋转孵育 14–18 小时（过夜）。

3. MHC 肽段的洗脱（第 2 天）

注意：聚丙烯柱可使MHC-多肽复合物洗脱，同时将磁珠保留在柱中。为了评估在使用1%三氟乙酸（TFA）进行酸性洗脱前后，MHC-多肽复合物与磁珠结合的比例，可在实验流程的关键步骤取样进行蛋白质印迹分析（见“可选”标注）。图3所示的蛋白质印迹结果表明，经1% TFA酸性洗脱后，MHC-多肽复合物得到富集。若该组分中无信号，则表明洗脱步骤未成功。请注意，也可通过步骤3.1.6中所述样品平行进行蛋白质印迹分析，以评估未与磁珠结合的MHC-多肽复合物的比例。

  1. 从抗体偶联磁珠中洗脱MHC-肽复合物
    1. 取下聚丙烯柱的底盖，将柱子置于聚丙烯柱架上，并在下方安装一个空容器以收集穿流液。
      注意：每个样品需使用一根柱子。
    2. 用10 mL缓冲液A冲洗聚丙烯柱，依靠重力自然排空。若液体流速过慢，可进一步剪切聚丙烯柱的底部尖端。
    3. 量取并收集步骤2.5中的磁珠-裂解液混合物（约2 mL），转移至聚丙烯柱中。
    4. （可选）取20 µL（或总体积的1/100）用于Western blot检测，并立即冷冻。该部分代表与磁珠孵育的总MHC-肽复合物。
    5. 让液体混合物依靠重力自然流下。
    6. （可选）收集并测量穿流液，取20 µL（或总体积的1/100）用于Western blot检测，并立即冷冻。该部分代表未结合的残留MHC-肽复合物。
    7. 为尽可能回收磁珠-裂解液混合物，用1 mL缓冲液A冲洗步骤3.1.3中的试管，并将冲洗液转移至聚丙烯柱中。
    8. 向聚丙烯柱中加入10 mL缓冲液A，洗涤滞留在柱中的磁珠，让洗涤液依靠重力自然排空。
    9. 依次用10 mL缓冲液B、10 mL缓冲液A和10 mL缓冲液C重复洗涤步骤。
    10. 将聚丙烯柱从柱架上取下，放置在一个新的2.0 mL微量离心管上，用手固定柱子和离心管。
    11. 向聚丙烯柱中加入300 µL 1% TFA，用移液器上下吹打5次以混匀磁珠。
      注意：磁珠将保留在聚丙烯柱中，而与MHC结合的肽段将洗脱至2.0 mL微量离心管中。
    12. 将洗脱液转移至一个新的2.0 mL微量离心管中。重复步骤3.1.11，并合并两次洗脱液（含MHC-肽复合物的洗脱液体积应为600 µL，用于步骤3.2.4）。
    13. （可选）取6 µL（或总体积的1/100）用于Western blot检测，并立即冷冻。该部分代表从磁珠中洗脱的MHC-肽复合物。
  2. MHC肽段的脱盐与洗脱
    注意：可通过将C18柱安装在2.0 mL微量离心管上完成MHC肽段的脱盐与洗脱步骤。为获得更好的密封性，建议在C18柱与2.0 mL微量离心管之间使用制造商提供的连接环。本方案中使用的C18柱体积容量为5–200 µL（6–60 µg）。所有操作均在室温下进行。
    1. 在C18柱顶部加入200 µL甲醇，然后以1546 × g离心3分钟，弃去穿流液。
    2. 在C18柱顶部加入200 µL 80%乙腈（ACN）/0.1% TFA，然后以1546 × g离心3分钟，弃去穿流液。
    3. 在C18柱顶部加入200 µL 0.1% TFA，然后以1546 × g离心3分钟，弃去穿流液。
    4. 将步骤3.1.12中获得的200 µL MHC-肽复合物加至C18柱顶部，以1546 × g离心3分钟，弃去穿流液。
    5. 重复步骤3.2.4两次，直至全部体积加样完毕。注意：MHC肽段将保留在C18柱中。
    6. 向C18柱中加入200 µL 0.1% TFA，然后以1546 × g离心3分钟，弃去穿流液。
    7. 将C18柱转移至一个新的2.0 mL微量离心管上。加入150 µL 28%乙腈/0.1% TFA，从C18柱中洗脱MHC肽段。
    8. 以1546 × g离心3分钟。
    9. 将穿流液转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。注意不要丢弃穿流液，其中含有分离得到的MHC I类或II类肽段。
    10. 重复步骤3.2.7–3.2.9两次，最终洗脱总体积为450 µL。
    11. 将450 µL洗脱液（纯化的MHC I类或II类肽段）在-20 °C下冷冻保存，直至进行LC-MS/MS分析。
    12. 在进行LC-MS/MS分析前，将步骤3.2.11中获得的纯化MHC I类或II类肽段使用真空浓缩仪干燥。设定条件为：45 °C、2小时、真空度100 mTorr、真空斜坡5。
      ​注意：冷冻样品的蒸发效率很高。干燥后的肽段可再次冷冻保存直至分析。

4. 通过液相色谱-串联质谱法鉴定MHC I类和II类肽段

注意：使用高性能轨道阱（High-performance Orbitrap）和高分辨率四极杆飞行时间质谱仪分析 MHC I 类和 II 类免疫肽组6。以下信息仅作为参考，需注意现有的各种串联质谱仪器依据不同的操作标准运行。下文简要概述相关步骤：

  1. 将步骤 3.2.12 中获得的干燥样品溶于 50 µL 的 4% 甲酸（FA）中。
  2. 每份样品上样三次，每次 16 µL，使用自制反相色谱柱（内径 150 µm，长度 250 mm，Jupiter 3 µm C18 300 Å）进行分离，采用 5%–30% 乙腈-0.1% 甲酸的梯度洗脱，在连接质谱仪的纳米流超高效液相色谱（nano-flow UHPLC）系统上以 600 nL/min 的流速运行。
  3. 以 120000 的分辨率、4 × 105 的自动增益控制（AGC）值，并在自动模式下设置离子注入时间，采集每个完整的质谱图；对最丰富的多重带电前体离子进行串联质谱（MS-MS）分析，最大时间为 3 秒。
    注：串联质谱实验采用高能碰撞解离（HCD）模式，碰撞能量为 30%，分辨率为 30,000，AGC 值为 1.5 × 105，离子注入时间为 300 ms。
  4. 使用蛋白质组学 LC-MS/MS 分析软件（例如 PEAKS X），结合小鼠和人类数据库（UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)）处理每份样品三次上样的数据文件。
  5. 酶解参数选择“未指定酶消化”，前体离子和碎片离子的质量容差分别设置为 10 ppm 和 0.01 Da。
    ​注：可变修饰包括脱酰胺（NQ）和氧化（M）。其余搜索参数均采用默认值。最终的肽段列表通过蛋白质组学 LC-MS/MS 分析软件，以 80% 的 ALC 值和 1% 的错误发现率（FDR）进行筛选。

5. 免疫肽组学数据的可视化

注意：质谱法（MS）生成的免疫肽组学数据质量可通过多种方式进行评估，最近已有相关描述22,23。为可视化数据并评估其整体质量、组成成分及MHC特异性，可使用MhcVizPipe（MVP）软件工具。

  1. 按照 Caron 实验室 GitHub 网站上提供的 MVP 软件的相关说明和文档进行安装和运行24。
    注意：MVP 可提供样本质量、组成及 MHC 特异性的快速且整合的视图。MVP 并行使用了已广泛验证的免疫肽组学算法（NetMHCpan25、NetMHCIIpan26， 和 GibbsCluster27），并生成结构清晰、易于理解的 HTML（超文本标记语言）格式报告。这些报告完全可移植，可在任何配备现代网络浏览器的计算机上查看。HTML 报告示例请参见补充数据 1-4。

结果

通过质谱法分析免疫肽组时，分离MHC-肽复合物的一般工作流程如图1所示。图中还展示了抗体与磁珠结合效率（使用Y3抗-H2Kb抗体）的验证结果（图2）以及MHC-肽复合物从磁珠上洗脱效率的代表性结果（使用W6/32抗-HLA-ABC抗体）（图3）。此外，如图4A所示，还采用了基于流式细胞术的定量检测方法21，用于测定每个EL4细胞（H2Kb和H2Db）和JY细胞（HLA-ABC）表面MHC I类分子的绝对数量。

使用当前方案所得结果的个体内和个体间重复性如图4B-E所示。代表性结果来自从1 × 108个EL4细胞和1 × 108个JY细胞中鉴定出的MHC I类肽段。结果由两位不同的实验人员（使用者1和使用者2）独立获得。对于使用者1，从EL4细胞和JY细胞中检测到的MHC I类特异性肽段平均数量分别为1341和6361；对于使用者2，分别为1933和7238（图4B,D）。在三次不同的生物学重复实验中，检测到的肽段数量的平均变异系数（CV）介于1.9%至11%之间（图4B,D）。尽管三次不同实验中检测到的肽段数量的变异系数相对较小，但肽段的种类存在较大差异（图4C,E）。实际上，代表性维恩图显示，在三次生物学重复中可重复检测到的肽段所占比例介于39%（使用者2，EL4细胞）至63%（使用者1，JY细胞）之间（图4C,E和补充表2）。

由 MVP 软件生成的热图利用 NetMHCpan 套件工具显示了所鉴定肽段的预测 MHC 结合强度25,26,28。MVP 还执行两种 GibbsCluster 常规分析选项，分别为“非监督 GibbsCluster”和“等位基因特异性 GibbsCluster”，以提取 MHC 肽结合基序。需要注意的是，MVP 存在局限性；其主要目标并非以高准确性提取等位基因特异性基序或对肽段进行注释，而是提供关于样本整体质量、组成及 MHC 特异性的概览。

对于EL4细胞中鼠MHC I类分子（H2Db 和H2Kb）的肽段（图5A；上图及补充数据1），代表性热图显示，所有检测到的8-12聚肽段中有89%被预测为H2Db或H2Kb分子的强结合肽（SB：NetMHCpan %Rank <0.5）或弱结合肽（WB：NetMHCpan %Rank <2）。由8-12聚肽段生成的序列聚类结果与已报道的H2Db（P5位为天冬酰胺，P9位为亮氨酸）和H2Kb（P5位为苯丙氨酸，P8位为亮氨酸）的序列logo一致（图5）29。值得注意的是，使用M1抗体还可观察到第三种主要基序（P7位为组氨酸，P9位为亮氨酸）以及其他一些“人为假象”基序（补充数据1）。事实上，M1抗体已知会与非经典分子Qa2发生交叉反应，因此质谱（MS）也会检测到与Qa2相关的肽段（补充数据1）。此处为简化起见，图5重点展示EL4细胞中表达的两种经典H2b等位基因（即H2Db或H2Kb）的明确肽段结合基序。

在JY细胞中的人类HLA I类（HLA-ABC）肽段（图5A；下部图谱及补充数据2）中，代表性热图显示，所检测到的所有8-12个氨基酸长度的肽段中有97%被预测为可与HLA-A*0201、-B*0702或-C*0702结合为强结合（SB）或弱结合（WB）肽。肽段经过聚类分析以可视化HLA-A*0201和HLA-B*0702的肽结合基序。HLA-C*0702的结合基序未在图5A中展示，因为C*0702等位基因的表达水平相对较低，因此分离并鉴定出的C*0702肽段数量过少，不足以生成具有代表性的C*0702结合基序。需注意，C*0702的结合基序可在其他研究30,31,32或通过NetMHCpan 4.1基序浏览器网站33中观察到。

对于JY细胞中的人类HLA II类（HLA-DR）肽段（图5B；上图及补充数据S3），代表性热图显示，所检测到的所有9-22聚肽段中有70%被预测为可与HLA-DRB1*0404和DRB1*1301结合（SB或WB）。这两个等位基因的肽段结合基序如图所示（图5B）。需注意，此处所示的肽段结合基序可能与近期报道的HLA-DRB1*0404和DRB1*1301的序列标志图（logos）不完全一致34。这一差异凸显了当前MVP/NetMHCpan在精确注释HLA II类等位基因（如JY细胞中表达的HLA-DRB1*0404和DRB1*1301）所结合肽段方面的局限性，尤其是对于特征尚不充分的等位基因。有关II类肽段结合基序的更多信息可参见其他研究34,35以及NetMHCIIpan 4.0基序浏览器网站36。

最后，针对A20细胞中鼠MHC II类分子（H2-IAd 和 H2-IEd）的肽段（图5B；下图及补充数据4），代表性热图显示，所检测到的所有9-22个氨基酸长度的肽段中，有87%被预测为可与H2-IAd 或 H2-IEd 发生强结合（SB）或弱结合（WB）。这两个等位基因的肽段结合基序与已报道的序列标志图谱一致37。

可用于评估样本整体质量和MHC特异性的MVP软件生成的完整HTML报告见于补充数据1-4。

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图1：MHC I类和II类肽段分离完整流程示意图。（A-B）将一亿个细胞离心沉淀后，用含0.5% Chaps的缓冲液裂解。（C）细胞裂解液经离心处理，上清液加入预先与目标抗体偶联的CNBr-Sepharose珠中，并（D）于4 °C孵育14–18小时。（E）免疫捕获后，将珠子转移至聚丙烯柱中进行洗涤，并用1% TFA溶液洗脱MHC-肽段复合物。（F）使用C18柱对肽段进行脱盐并洗脱。（G）随后，肽段经真空离心浓缩干燥，再通过串联质谱法进行分析。（H）可利用免费提供的MhcVizPipe软件，基于HLA亚型评估所分离的MHC I类和II类肽段的质量。本图由 BioRender.com制作（NT22ZL8QSL）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：考马斯亮蓝染色法检测抗体与CNBr活化琼脂糖珠的结合效率。 取等体积样品上样至12% SDS-PAGE凝胶，随后进行考马斯亮蓝染色：珠子+偶联前抗体（1）、偶联步骤后的未结合抗体（2）、偶联后最后一次洗涤的上清液（3）、以及与抗体偶联后的珠子（4）。当抗体共价结合至CNBr珠子时（第4泳道），与偶联前抗体（第1泳道）相比，H2Kb轻链和重链的染色信号强度显著降低，表明结合效率较高。该图已重新出版并改编自bioRxiv38。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：通过酸性洗脱从抗体偶联的CNBr活化微珠中回收MHC-肽复合物后的Western印迹分析。 按照实验方案中所示步骤采集样品（总体积的1/100），上样至12% SDS-PAGE凝胶，随后转至硝酸纤维素膜：免疫捕获并完成最后一次洗涤后的微珠+裂解液（A）；最后一次洗涤的上清液（B）；以及从微珠上洗脱下来的MHC-肽复合物（C）。使用抗HLA-ABC重链抗体（Abcam, #ab 70328, 1:5000）在（C）中检测到强烈的信号，证实了经酸性洗脱后成功分离出MHC-肽复合物。需要注意的是，可通过收集步骤3.1.6中的流穿液，评估未被抗体偶联微珠捕获的MHC-肽复合物比例。可将一份等分试样加入Western印迹中（本凝胶未显示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：从 JY 和 EL4 细胞中鉴定 MHC I 类肽段。（A）柱状图显示每 EL4 细胞表面 H2Db 和 H2Kb 分子的绝对数量，以及每 JY 细胞表面 HLA-ABC 分子的绝对数量。定量通过流式细胞术进行。均值和标准误来自三次生物学重复实验。（B, D）柱状图显示由两位独立操作人员（USER_1 [U1] 和 USER_2 [U2]）鉴定出的 MHC I 类肽段的平均数量及平均值的标准差。图中展示了从小鼠 EL4 细胞（B）和人源 JY 细胞（D）中检测到的 MHC I 类肽段的平均数量和平均值的标准差。图中还标出了三次独立生物学重复实验间的变异系数（CV）。（C, E）维恩图显示在三次独立生物学重复实验中，由两位独立操作人员（U1 和 U2）在 EL4 细胞（C）和 JY 细胞（E）中可重复检测到的肽段数量。图4A 已重新印制并改编自 bioRxiv38。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：使用MVP软件工具可视化免疫肽组学数据。 小鼠和人类（A）MHC I类和（B）MHC II类肽段的数据分析。 图中显示了代表性的结合亲和力热图（左图）和肽段结合基序（右图）。热图颜色表示NetMHCpan 4.1预测的MHC结合亲和力（%rank）：强结合肽为红色（%rank <0.5），弱结合肽为蓝色（%rank <2），非结合肽为黄色（%rank >2）。括号中显示了8-12个氨基酸长度（A）和9-22个氨基酸长度（B）的强结合（SB）或弱结合（WB）肽段所占比例（%）。肽段结合基序由MVP软件使用“等位基因特异性Gibbscluster”选项生成。这些代表性结果来自1×108个细胞，并使用了以下抗体和细胞系：小鼠MHC I类肽段使用M1抗体和EL4细胞；人MHC I类肽段使用W6/32抗体和JY细胞；小鼠MHC II类肽段使用M5抗体和A20细胞；人MHC II类肽段使用L243抗体和JY细胞。请参阅补充数据1-4以获取MVP软件生成的完整HTML报告。请点击此处查看该图的放大版本。

补充数据 1-4： 请点击此处下载该文件。

补充数据 1：使用 M1 抗体从 1 × 108 个 EL4 细胞中分离肽段后，由 MVP 软件生成的 HTML 报告。 显示了三个生物学重复实验。该报告与 图 4 和 图 5 相关，代表性肽段列于 补充表 2 中。

补充数据 2：使用 W6/32 抗体从 1 × 108 个 JY 细胞中分离肽段后，由 MVP 软件生成的 HTML 报告。 展示了三个生物学重复实验的结果。该报告与图 4和图 5相关，代表性肽段列于补充表 2中。

补充数据3：使用L243抗体从1 x 108个JY细胞中分离肽段后，由MVP软件生成的HTML报告。 该报告与图5相关，代表性肽段列于补充表2中。

补充数据 4：使用 M5 抗体从 1 × 108 个 A20 细胞中分离肽段后，由 MVP 软件生成的 HTML 报告。该报告与图 5相关，代表性肽段列于补充表 2中。

补充表 1：缓冲液列表。 本方案中使用的所有缓冲液的配方均有描述。 请点击此处下载该表格。

补充表 2：与 H2Db/Kb、HLA-ABC、HLA-DR 和 H2-IAd/IEd 相关的代表性肽段列表。该表格包含从小鼠 EL4 和 A20 细胞系中分别分离出的 MHC I 类和 II 类肽段，以及从人源 JY 细胞系中分离出的 HLA I 类和 II 类肽段的代表性列表。这些数据已存入 ProteomeXchange（编号 PXD028633）。请点击此处下载该表格。

数据可用性：

本研究中使用的数据集已存入 ProteomeXchange（http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset）：  PXD028633。

讨论

两种小鼠细胞系（EL4 和 A20）、一种人源细胞系（JY）以及五种 commercially available 抗体 [M1（抗 H2Db/Kb）、Y3（抗 H2Kb）、M5（抗 H2-IAd/IEd）、W6/32（抗 HLA-ABC）和 L243（抗 HLA-DR）] 在本实验方案背景下经过测试并验证，可提供高质量的免疫肽组学数据。其他抗 HLA 抗体也可获得（例如抗 HLA-A2 BB7.2），但本研究未对其进行测试。需要注意的是，W6/32 抗体在该领域被广泛使用，是目前最成熟的抗体，能够用于富集所有人源 HLA-ABC 分子所呈递的肽段，并已被多个权威实验室报道适用于多种生物样本来源，包括新鲜或冷冻组织8,39、外周血单个核细胞和骨髓单个核细胞40、活检样本41、异种移植组织41,42、尸检样本43以及血浆样本44,45。

在整个实验方案中使用的新鲜配制溶液至关重要。特别是，使用玻璃瓶中新鲜配制的酸性溶液对于避免质谱分析样品受到后续污染尤为关键。此外，当首次进行该实验方案和/或使用新抗体时，必须通过考马斯亮蓝染色凝胶检测确认抗体确实已偶联到溴化氰活化的Sepharose珠上。在免疫捕获MHC-肽复合物后，对抗体偶联珠的洗涤步骤也至关重要，以避免非MHC来源肽段的污染。最后，需特别注意在使用1%三氟乙酸（TFA）洗脱MHC-肽复合物以及使用含0.1%甲酸的28%乙腈（ACN28%/0.1% FA）从C18柱洗脱肽段后，切勿弃去洗脱液。

文献中现有的方案描述了在分离过程结束时进一步纯化肽段的额外步骤，例如通过不同方法进行肽段分级14,46，或使用10–30 kDa滤膜进行超滤13,47。本方案未提供这些额外步骤的详细信息，但已足以获得高质量的免疫肽组学数据。然而，非专业人员可考虑引入此类步骤，以对肽段分离流程进行修改和优化，解决潜在问题。

用于洗脱珠上MHC复合物的珠子类型以及酸性洗脱缓冲液的类型也可根据需要进行调整以排除故障13,14,15,16,17,18,19。在此方面，CNBr活化的Sephadex珠通常是一个良好的起点，因为它们不仅相对便宜，而且在与多种抗体结合方面具有较好的灵活性。在本方案中，CNBr活化的Sephadex珠使用五种不同市售抗体（即M1、Y3、W6/32、L243和M5）均表现出相对良好的性能。除了CNBr活化的Sephadex珠外，Protein A、Protein G或A/G Sephadex 4 Fast Flow珠也易于操作，尽管相对更昂贵，但可获得类似的结果。另一个需要考虑的因素是抗体对Protein A或G的亲和力。此外，Sephadex磁珠也非常易于使用，但价格相对较高。无论非专业人员选择何种类型的珠子，都建议在实验关键步骤收集等分试样，并进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶分析，以监测抗体与珠子的结合效率，如图2所示。

影响MHC肽段分离成功与否的另一个重要因素是用于从磁珠上分离MHC-肽段复合物的酸性洗脱缓冲液的类型。已有报道使用的不同缓冲液包括0.1%、1%或10%三氟乙酸（TFA）、0.2%甲酸（FA）以及10%乙酸。其中1% TFA对所有测试的抗体均有效。该步骤还可通过针对用于捕获MHC肽段的MHC分子进行的蛋白质印迹（Western blotting）进行追踪，如图3所示。

所有含有乙腈（ACN）和/或三氟乙酸（TFA）的缓冲液均具有较强腐蚀性，若与塑料接触，可能导致样品被小分子或聚合物类物质（如增塑剂）污染。为避免此类问题，所有含有机溶剂和/或TFA的溶液均需每日新鲜配制，并储存于玻璃瓶中直至使用。大部分操作步骤在蛋白质低吸附塑料管（Protein LoBind塑料管）中进行。此类管材专为蛋白质组学设计，由最高品质的原生聚丙烯制成，不含生物杀灭剂、增塑剂和乳胶；同时采用优化的高抛光模具生产，且生产过程中未使用脱模剂。采取上述预防措施对于获得高质量的免疫肽组学数据至关重要。

抗体是分离MHC结合肽的一个重要限制因素。W6/32抗体能够分离由人类所有HLA-ABC I类分子呈递的肽段，是该领域中应用最广泛且最为成熟的抗体。在使用W6/32抗体时，对未明确特征的人类细胞系或生物样本进行高分辨率HLA分型并非必需，但为了某些特定应用并便于数据分析，仍建议进行分型48。HLA/MHC分型信息也可在多个细胞系和小鼠模型的公共数据库中获取49。除W6/32抗体外，本方案中经过测试和验证的其他四种抗体（M1、M5、Y3和L243）均可商业化获得。然而，以往免疫肽组学研究中报道的许多其他抗体尚未被研究领域广泛采用，且无法商业化获取，或仅能通过杂交瘤细胞培养获得，后者相对昂贵。

MHC结合肽分离的另一个重要限制是所需的起始材料量。所需材料量与细胞表面MHC分子的表达水平呈反比，后者可通过流式细胞术进行定量（图4A）。MHC分子高表达的细胞（例如树突状细胞和一般造血细胞）通常可获得高质量的免疫肽组学数据。专业实验室最低可使用5000万个细胞50，但对于非专业实验室，建议使用1亿至10亿个细胞。已有研究报道使用组织活检（<13 mg）41、异种移植42,43、尸检44,和血浆45,46样本，但这些样本对非专业实验室仍具挑战性。此外，对于已建立的细胞系，预期获得的MHC相关肽总数已有明确记录（本研究中，根据细胞系和所用抗体的不同，约为2000至10000条肽段），但该技术能够有效富集的天然呈递肽的绝对数量仍存在争议。事实上，先前研究表明，分离步骤的效率依赖于肽段本身，可能低至0.5%-2%51。免疫肽组学的其他局限性还包括方法的可重复性，以及NetMHCpan分析工具无法准确注释特征较少的MHC等位基因所结合的肽段。在这方面，相对新颖的数据非依赖性采集质谱方法7,32,52 ，以及新的肽段聚类和MHC肽结合预测算法31,34,53,54的进一步发展与应用，有望提高免疫肽组学中肽段注释的可重复性和准确性。免疫肽组学在质谱采集和MHC相关肽段的计算分析方面还面临其他局限性，相关内容在其他文献中已有综述1,6,55。

W尽管使用 W6/32 抗体从人源样本中分离 HLA-ABC 相关肽段的技术已较为成熟并被多个研究团队广泛应用，小鼠 MHC I 类和 II 类分子相关肽段的分离则相对较少建立。因此，亟需稳健的实验方案用于小鼠 MHC 配体的分离。本文提供了一种优化后的实验流程，可分别从小鼠 C57BL/6 和 BALB/c 来源的两种细胞系中分离 MHC I 类肽段和 MHC II 类肽段。该方案特别适用于分离 I 类分子 H2Kb- 和 H2Db-使用M1抗体检测相关肽段以及II类H2-IAd 和 H2-IEd使用M5抗体检测相关肽段。因此，本方案的推广和应用将有助于在多种小鼠模型中开展基础和转化免疫肽组学研究。

该方案可用于建立和标准化免疫肽组学工作流程，也可用于评估新方案的性能。例如，该方案可被调整并进一步优化，以在多种生物基质中进行免疫肽组学筛查，包括血液/血浆、新鲜或冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）样本。此外，该方案将促进免疫肽组学样品制备过程在实验室内部及不同实验室之间的可重复性，因此有望在基础研究和临床研究中得到广泛应用。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢皮埃尔·蒂博（Pierre Thibault）、埃里克·博尼尔（Eric Bonneil）、乔埃尔·拉努瓦（Joël Lanoix）、卡罗琳·科特（Caroline Côté）（蒙特利尔大学免疫与癌症研究所）以及安东尼·珀塞尔（Anthony Purcell）（蒙纳士大学）提出的宝贵意见。本研究获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé, FRQS）、科尔基金会（Cole Foundation）、圣心医院（CHU Sainte-Justine）、查尔斯-布朗诺基金会（Charles-Bruneau Foundations）、加拿大创新基金会（Canada Foundation for Innovation）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（#RGPIN-2020-05232）以及加拿大卫生研究院（CIHR）（#174924）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A20 细胞系ATCCTIB-208小鼠 B 淋巴母细胞
乙腈，LC/MS 级FisherScientificA955-4
抗人 HLA A、B、C（W6/32）- MHC I 类分子BioXcellBE0079
抗人/猴 HLA-DR（L243）- MHC II 类分子BioXcellBE0308
抗小鼠 H2（M1/42.3.9.8）- MHC I 类分子BioXcellBE0077
抗小鼠 H2-IAd/IEd（M5/114）- MHC II 类分子BioXcellBE00108
抗小鼠 H2Kb（Y3）- MHC I 类分子BioXcellBE0172
BupH 磷酸盐缓冲液包（PBS）ThermoFisher28372每包内容物溶于 500 mL 去离子水（FisherScientific，W64）中
CHAPS（3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐）EMDMilipore220201-10MG
CNBr 活化 SepharoseCytivia# 17-0430-01
EL4 细胞系ATCCTIB-39小鼠 T 淋巴母细胞
epTIPS LoRetention 吸头，1000 µL/EppendorfFisherScientific02-717-352使用低吸附材料可获得更佳结果
epTIPS LoRetention 吸头，200 µL/EppendorfFisherScientific02-717-351使用低吸附材料可获得更佳结果
甲酸，LC/MS 级FisherScientificA117-50
甘氨酸FisherScientificRDCG0250500
盐酸溶液FisherScientific60-007-11
JY 细胞系Sigma Aldrich94022533-1VLEB 病毒永生化 B 淋巴母细胞样细胞系
甲醇，LC/MS 级FisherScientificA456-4
Poly prep 层析柱（聚丙烯柱）Bio-Rad731-1550在实验方案中简称为聚丙烯柱
蛋白酶抑制剂ThermoFisherA32963每 10 mL 细胞裂解缓冲液中加入 1 粒
QifikitDakoK007811-8
碳酸氢钠Amresco# 0865-1kg
氯化钠FisherScientificMSX04201
固相萃取盘，超微量自旋柱 C18The nest groupSEMSS18V载样量 6–60 µg，最大体积 200 µL
三氟乙酸（TFA），LC-MS 级FisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
LoBind 管，1.5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090使用低吸附材料可获得更佳结果
LoBind 管，2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795使用低吸附材料可获得更佳结果
水，LC/MS 级FisherScientificW64

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MHC II

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