骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

摘要

线粒体是骨骼肌中具有高度表型可塑性的关键代谢细胞器。细胞质蛋白的输入是细胞器生物发生的关键途径，对线粒网状结构的扩展和线粒体功能的维持至关重要。因此，蛋白质输入可作为细胞健康状况的指标。

摘要

线粒体是决定细胞能量供应和整体健康状况的关键代谢与调控细胞器。在骨骼肌中，线粒体呈现出一系列复杂的形态，从小型的椭圆形细胞器到广泛的网状结构不等。长期以来，研究人员一直致力于探索线粒体网状结构如何响应不同刺激（如能量需求的变化）而扩展和发育。这种生长或生物发生过程中的一个关键环节是前体蛋白的导入，这些蛋白最初由细胞核基因组编码，在细胞质中合成，随后被转运至线粒体的不同亚区室。线粒体已进化出一套复杂的蛋白导入机制，涉及多种选择性的内膜和外膜通道，被称为蛋白导入机器（protein import machinery, PIM）。线粒体内的蛋白导入依赖于有效的膜电位以及通过氧化磷酸化产生的细胞器来源ATP。因此，该过程的测量可作为评估细胞器健康状况的指标。PIM在骨骼肌中还表现出高度的适应性可塑性，并与细胞的能量状态紧密关联。例如，运动训练已被证明可增强蛋白导入能力，而肌肉废用则会降低该能力，这与线粒体含量相关标志物的变化相一致。尽管蛋白导入是线粒体生物发生和扩增过程中的关键步骤，但在骨骼肌中对此过程的研究仍不广泛。因此，本文旨在介绍如何利用从骨骼肌中分离得到的完整且功能正常的线粒体来测定其蛋白导入能力，以促进对该方法的深入理解，并提升人们对这一通路在线粒体更新、运动、健康及疾病中重要性的认识。

引言

线粒体是存在于不同类型细胞中具有复杂形态的细胞器，其功能多样，对细胞健康至关重要。因此，线粒体不能再被简单地视为仅负责能量生产的细胞器。线粒体是关键的代谢调节因子、细胞命运的决定因素以及信号传导中心，其功能可作为反映整体细胞健康状况的有效指标。在骨骼肌细胞中，电子显微镜研究表明，存在地理分布不同的肌膜下（SS）和肌原纤维间（IMF）线粒体，这些线粒体具有一定程度的连接性^1,2,3,4，目前认为这种连接性具有高度动态性，并能适应骨骼肌活动水平的变化，以及年龄和疾病状态的影响。肌肉中线粒体的含量和功能可通过多种方法进行评估^5,6，传统的细胞器分离方法已被用于更深入地研究线粒体的呼吸能力和酶活性（Vmax），从而排除细胞微环境的影响^7,8。特别是，这些传统方法揭示了从肌膜下和肌原纤维间区域分离出的线粒体之间存在的细微生化差异，提示这些亚细胞区域在线粒体代谢功能上可能存在不同的生物学意义^8,

方案

本实验所使用的所有动物均饲养在约克大学的动物护理设施中。实验根据加拿大动物护理委员会的指南进行，并已获得约克大学动物护理委员会的批准（许可证号：2017-08）。

1. 骨骼肌中肌膜下和肌原纤维间线粒体的功能性分离

1. 试剂准备：
   1. 按照上述方法准备所有缓冲液和培养基 表 1.
   2. 将缓冲液调至 pH 7.4，并于 4℃ 保存 °C（最长2周），但nagrase蛋白酶除外。
   3. 制备新鲜的nagarse蛋白酶（表1每次。
2. 组织取出与剪碎
   注意：以下线粒体分离步骤的流程图已提供 图1.
   1. 用约 20 mL 缓冲液 1 填充一个玻璃闪烁瓶表1）并置于冰上。
   2. 在小鼠处于麻醉状态下，采集骨骼肌（如胫骨前肌、股四头肌、腓肠肌等），约500-1000 mg，并将肌肉组织置于含有预冷Buffer 1的闪烁瓶中。
      注意：气态异氟烷以 2.5% 浓度、0.4 L/min 的氧气流速用作麻醉剂₂/min。进行夹捏测试以确认动物无反应。
   3. 组织取材后，通过颈椎脱位处死动物。
   <....

结果

我们已充分证明，该方案是一种有效的检测方法，可用于测定前体蛋白进入功能完整分离的骨骼肌线粒体的导入速率。与未处理条件相比，典型的前体蛋白（如苹果酸脱氢酶（MDH））进入基质的导入过程对膜电位敏感，因为该过程可被呼吸链解偶联剂缬氨霉素所抑制(图2A)。当线粒体内膜和外膜在去垢剂Triton X-100存在下被溶解时，蛋白导入也会受到阻碍。该导入过程对外源性ATP的存在具有敏感性，ATP的作用是使前体蛋白解折叠，以便其跨膜转运，并且该过程受到呼吸速率和ATP供应速率的严格调控（数据未显示²⁰）。在肌原纤维间线粒体和肌膜下线粒体组分之间，其蛋白导入效率也存在明显差异，部分原因在于这两类线粒体中蛋白导入机制的表达水平不同，以及其呼吸速率的差异(图2B)。

骨骼肌中的线粒体是高度动态的细胞器，能够迅速响应能量需求的变化。在长期运动或电刺激诱导的收缩活动后，肌肉.......

讨论

线粒体在其合成和细胞内扩增过程中，独特地依赖于细胞核基因组和线粒体基因组的表达与协调。然而，细胞核基因组编码了线粒体蛋白质组的绝大部分（99%），这凸显了蛋白质导入机制在线粒体生物发生中的重要性。蛋白质导入还作为一种重要的信号事件发挥作用，因为导入失败可促进未折叠蛋白反应和/或线粒体自噬的启动^15,16,26。由于蛋白质导入依赖于多种功能性通道和分子伴侣的表达、完整的膜电位以及ATP的可利用性，因此对线粒体蛋白质导入的评估可为细胞器的健康状况和能量状态提供有价值的见解。

评估线粒体蛋白质导入能力需要采用标准的差速离心技术，从周围组织中分离出该细胞器。这一评估方法与评估线粒体酶活性的V_max类似，需在严格控制的时间和底物浓度条件下进行，并排除细胞胞质因素的干扰。本文所述的分离方法或其类似版本，多年来已被广泛用于评估线粒体呼吸和酶活性⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-甲硫氨酸	Perkin Elmer	NEG709A500UC	购买需要有效的放射性同位素许可证
ATP	Sigma	A7699
吸水纸；Whatman 3MM CHR 纸	Thermo Fisher	05-714-5
用于胶片的暗盒	Kodak	Kodak Xomatic
离心管	Thermo Fisher	3138-0050
氯仿	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
凝胶干燥仪	BioRad	Model 583
凝胶干燥试剂盒	Sigma 或 BioRad	Z377570-1PAK 或 OW-GDF-10	市面上有多家公司提供多种选择，此处仅列出少数示例。
甘油	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
高速离心机	Beckman Coulter	Avanti J-25 离心机
匀浆器	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
异戊醇，或 3-甲基丁醇	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	用 1000 µL 20 mM HEPES 稀释，配制成 1 mM 储存液
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT 质粒	-	-	由加拿大蒙特利尔麦吉尔大学 G. C. Shore 博士惠赠
pGEM4Z/hTom40 质粒	-	-	由澳大利亚墨尔本拉筹伯大学 M. T. Ryan 博士惠赠
pGMDH 质粒	-	-	由华盛顿大学医学院 A. Strauss 博士惠赠
苯酚	Sigma	P4557
苯酚:氯仿:异戊醇	Sigma	P3803	也可按提供的比例自行配制
磷屏	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
兔网织红细胞裂解液	Promega	L4960	避免反复冻融；收到后立即分装；氨基酸也随试剂盒提供
RNAsin	Promega	N2311
高速离心机转子	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	注意：吞食或吸入有害，需佩戴口罩。
乙酸钠	Bioshop	SAA 304
碳酸钠	VWR	BDH9284
水杨酸钠	Millipore Sigma	106601
山梨醇	Sigma	S6021
SP6 RNA 聚合酶	Promega	P1085
分光光度计	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
亚精胺	Sigma	S-2626
蔗糖	BioShop	SUC507
T7 RNA 聚合酶	Promega	P2075
台式离心机	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
三氯乙酸	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-巯基乙醇	Sigma	M6250-100ML