需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

2.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63055

⸱

2022年1月7日

 ,  , 
1Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Science, York University

本文内容

摘要

线粒体是骨骼肌中具有高度表型可塑性的关键代谢细胞器。细胞质蛋白的输入是细胞器生物发生的关键途径，对线粒网状结构的扩展和线粒体功能的维持至关重要。因此，蛋白质输入可作为细胞健康状况的指标。

摘要

线粒体是决定细胞能量供应和整体健康状况的关键代谢与调控细胞器。在骨骼肌中，线粒体呈现出一系列复杂的形态，从小型的椭圆形细胞器到广泛的网状结构不等。长期以来，研究人员一直致力于探索线粒体网状结构如何响应不同刺激（如能量需求的变化）而扩展和发育。这种生长或生物发生过程中的一个关键环节是前体蛋白的导入，这些蛋白最初由细胞核基因组编码，在细胞质中合成，随后被转运至线粒体的不同亚区室。线粒体已进化出一套复杂的蛋白导入机制，涉及多种选择性的内膜和外膜通道，被称为蛋白导入机器（protein import machinery, PIM）。线粒体内的蛋白导入依赖于有效的膜电位以及通过氧化磷酸化产生的细胞器来源ATP。因此，该过程的测量可作为评估细胞器健康状况的指标。PIM在骨骼肌中还表现出高度的适应性可塑性，并与细胞的能量状态紧密关联。例如，运动训练已被证明可增强蛋白导入能力，而肌肉废用则会降低该能力，这与线粒体含量相关标志物的变化相一致。尽管蛋白导入是线粒体生物发生和扩增过程中的关键步骤，但在骨骼肌中对此过程的研究仍不广泛。因此，本文旨在介绍如何利用从骨骼肌中分离得到的完整且功能正常的线粒体来测定其蛋白导入能力，以促进对该方法的深入理解，并提升人们对这一通路在线粒体更新、运动、健康及疾病中重要性的认识。

引言

线粒体是存在于不同类型细胞中具有复杂形态的细胞器，其功能多样，对细胞健康至关重要。因此，线粒体不能再被简单地视为仅负责能量生产的细胞器。线粒体是关键的代谢调节因子、细胞命运的决定因素以及信号传导中心，其功能可作为反映整体细胞健康状况的有效指标。在骨骼肌细胞中，电子显微镜研究表明，存在地理分布不同的肌膜下（SS）和肌原纤维间（IMF）线粒体，这些线粒体具有一定程度的连接性1,2,3,4，目前认为这种连接性具有高度动态性，并能适应骨骼肌活动水平的变化，以及年龄和疾病状态的影响。肌肉中线粒体的含量和功能可通过多种方法进行评估5,6，传统的细胞器分离方法已被用于更深入地研究线粒体的呼吸能力和酶活性（Vmax），从而排除细胞微环境的影响7,8。特别是，这些传统方法揭示了从肌膜下和肌原纤维间区域分离出的线粒体之间存在的细微生化差异，提示这些亚细胞区域在线粒体代谢功能上可能存在不同的生物学意义8,9,10,11。

线粒体的生物发生具有独特性，需要细胞核DNA和线粒体DNA共同提供基因产物。然而，绝大多数线粒体蛋白由细胞核基因编码，因为线粒体DNA的转录仅能合成13种蛋白质。由于线粒体通常包含 >涉及多种代谢途径的1000种蛋白质，该细胞器的生物发生需要一种严格调控的机制，以将前体蛋白从细胞质选择性地输入并组装到线粒体的不同亚区室中，从而维持其正确的化学计量比和功能12,13. 定位于线粒体的核编码蛋白通常携带一段线粒体靶向序列（MTS），可将其靶向至该细胞器并促进其在亚区室中的定位。大多数定位于基质的蛋白含有可被切割的N端MTS，而定位于线粒体外膜或内膜的蛋白通常具有内部靶向结构域14. 蛋白质的导入过程由一组多样化的通道介导，为进入细胞器提供了多种途径13外膜转位酶（TOM）复合物将前体蛋白从细胞质转运至膜间隙，在此被内膜转位酶（TIM）复合物识别。TIM复合物负责将细胞核编码的前体蛋白转运至基质，基质中的蛋白酶会切除其N端的靶向先导序列。定位于外膜的蛋白质可通过TOM复合物直接插入外膜，而定位于内膜的蛋白质则由特定的TIM22蛋白介导插入。蛋白质在导入后，进一步由基质内的蛋白酶和分子伴侣进行加工修饰，并常组装形成更大的复合物，例如电子传递链中的各类复合体。

线粒体蛋白质的导入过程本身也可作为衡量线粒体健康状况的指标，因为该过程依赖于膜电位的存在以及以ATP形式提供的能量15。例如，当膜电位消散时，蛋白激酶PINK1无法被细胞器摄取，从而引发磷酸化信号，通过一种称为线粒体自噬（mitophagy）的途径启动细胞器的降解16,17。在类似情况下，当蛋白质导入受阻时，ATF5蛋白无法进入细胞器，随后会转位至细胞核，在其中作为转录因子促进未折叠蛋白反应（UPR）相关基因表达的上调18,19。因此，检测蛋白质导入效率可全面反映细胞器的健康状态，而基因表达的变化则可用于指示逆向信号向细胞核传递的程度。

尽管线粒体蛋白导入途径对于线粒体的生物发生及细胞整体健康具有重要意义，但在哺乳动物线粒体中的这一过程却鲜有深入研究。在本报告中，我们详细描述了测量前体蛋白导入骨骼肌线粒体所涉及的具体步骤，并提供了数据以说明该导入系统在肌肉活动变化和失用状态下的适应性响应，从而揭示蛋白导入在骨骼肌适应性可塑性中的重要作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本实验所使用的所有动物均饲养在约克大学的动物护理设施中。实验根据加拿大动物护理委员会的指南进行，并已获得约克大学动物护理委员会的批准（许可证号：2017-08）。

1. 骨骼肌中肌膜下和肌原纤维间线粒体的功能性分离

  1. 试剂准备：
    1. 按照上述方法准备所有缓冲液和培养基 表 1.
    2. 将缓冲液调至 pH 7.4，并于 4℃ 保存 °C（最长2周），但nagrase蛋白酶除外。
    3. 制备新鲜的nagarse蛋白酶（表1每次。
  2. 组织取出与剪碎
    注意：以下线粒体分离步骤的流程图已提供 图1.
    1. 用约 20 mL 缓冲液 1 填充一个玻璃闪烁瓶表1）并置于冰上。
    2. 在小鼠处于麻醉状态下，采集骨骼肌（如胫骨前肌、股四头肌、腓肠肌等），约500-1000 mg，并将肌肉组织置于含有预冷Buffer 1的闪烁瓶中。
      注意：气态异氟烷以 2.5% 浓度、0.4 L/min 的氧气流速用作麻醉剂2/min。进行夹捏测试以确认动物无反应。
    3. 组织取材后，通过颈椎脱位处死动物。
    4. 将表面皿置于冰上预冷。去除肌肉中的脂肪和结缔组织，在表面皿上将组织切碎至形成均匀的糊状物。
    5. 将切碎的组织置于预冷的50 mL塑料离心管中（参见 材料表）并记录精确重量。
    6. 将切碎的组织用缓冲液1 + ATP稀释10倍（表1).
    7. 使用8 mm双刀头匀浆器匀浆肌肉样本（参见 材料表) 以 9.8 Hz 的功率输出处理 10 秒，确保无可见的肌肉块残留。
    8. 将样品在800 x g 使用高速离心机离心10分钟（参见 材料表).
      注意：此步骤的目的是分离SS和IMF线粒体组分。上清液含有SS线粒体，而沉淀物含有IMF线粒体。
  3. SS线粒体分离
    1. 将上清液通过一层纱布过滤至另一组50 mL塑料离心管中，以去除任何大颗粒碎屑或污染物。
    2. 将上清液在 9,000 x g 4℃下离心10分钟 °使用高速离心机。
    3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 3.5 mL 缓冲液 1 + ATP 中。
      注意：使用 P1000 重悬，并小心操作。线粒体是脆弱的细胞器，操作应轻柔，避免枪头接触沉淀。
    4. 以 9,000 × g 离心样品 g 4°C 下离心 10 分钟 °C 使用高速离心机。
    5. 弃去上清液，除非需要进一步处理以分离不含细胞核、线粒体及其他细胞器的胞质组分。小心地将沉淀物重悬于约 95 µ重悬介质的 L（升）表1使用 P200 移液器。
      注意：与步骤1.3.3类似，避免用移液器枪头接触沉淀。重悬液的体积可根据沉淀物的大小进行调整。此为SS线粒体组分，可在冰上保存，直至完成IMF组分的分离。如需要，可通过在100,000 × g条件下离心上清液以分离不含细胞器的胞质组分。 g 在超速离心机中（参见 材料清单然后弃去沉淀。
  4. IMF线粒体分离
    1. 将步骤1.2.8中的沉淀物用缓冲液1加ATP稀释10倍。使用聚四氟乙烯（Teflon）研杵轻轻混合沉淀物与缓冲液，直至样品均匀一致。
    2. 使用8 mm双刀片匀浆器匀浆样品（参见 材料表9.8 Hz 功率输出下持续 10 秒。
    3. 以 800 x g 离心样品 g 4°C 下 10 分钟 °C，使用高速离心机。
    4. 弃去上清液，用缓冲液2将IMF线粒体沉淀物稀释10倍，并使用聚四氟乙烯研杵轻轻混匀至均匀悬浮。
    5. 加入25 µ组织每克至 10 mg/mL 的 nagarse 蛋白酶表1将离心管平放在冰上，并每隔一分钟轻轻左右摇动试管以混匀。
      注意：添加nagarse可通过有限消化肌原纤维来释放IMF线粒体。
    6. 5分钟后，加入20 mL缓冲液2（表1）以稀释蛋白酶nagarse至失活程度，从而终止消化反应。
    7. 立即在5,000 x g 4℃下离心5分钟 °使用高速离心机。
    8. 弃去上清液，用缓冲液2将沉淀物稀释10倍，并使用聚四氟乙烯研杵轻轻混匀重悬。
    9. 将样品以 800 x g 4℃下孵育15分钟 °C，以沉淀纤维状物质。
    10. 将上清液倒入一组新的50 mL塑料离心管中，注意不要扰动沉淀，沉淀可弃去。
    11. 将样品在 9,000 x g 4℃下离心10分钟 °C 步骤同 1.4.7。
    12. 弃去上清液，加入 3.5 mL 缓冲液 2，使用 P1000 移液器轻轻重悬沉淀。
    13. 将样品在 9,000 x g 4℃下离心10分钟 °C 同步骤 1.4.7。
    14. 弃去上清液，并用约 180 μL 溶液轻轻重悬沉淀 µ使用P200移液器将重悬于L重悬培养基中。
      ​注意：重悬介质的体积可根据沉淀物的大小进行调整。此为骨骼肌线粒体的IMF组分，可在冰上保存至用于导入实验。

2. 线粒体蛋白质导入

  1. 体外 转录
    注意：以下步骤概述了如何制备用于导入的放射性标记蛋白。所研究的导入途径可能决定靶蛋白的选择，例如，为评估进入线粒体基质的导入，通常使用鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT）和苹果酸脱氢酶（MDH），而Tom40通常用于指示外线粒体膜的导入。进行以下步骤需要编码目标蛋白的质粒DNA。质粒DNA的转录可在另一天线粒体分离之前完成，本实验获得的mRNA可储存并用于后续的翻译和导入实验。
    1. 线性化DNA：将40 µ微克质粒DNA（5 µ克/µL），5 µ10x 酶缓冲液 L 和 5 µL 限制性内切酶，37℃孵育 °30 分钟，37°C
      注意：所使用的限制性内切酶可能因质粒而异，这可能需要使用不同的酶缓冲液，且DNA的用量/体积可任意选择，因为模板量可根据实验条件相应放大或缩小。
    2. 使用酚和乙醇纯化并沉淀线性化DNA。后续所有步骤（2.1.3–2.1.15）均在无菌的1.5 mL离心管中进行，并使用台式离心机（参见 材料表用于离心步骤。
    3. 加入适量无菌 H2O，使最终体积达到400 µL. 然后，加入400 µL 的苯酚。
    4. 剧烈颠倒混匀约10秒，然后在17,000 x g 4℃下离心1分钟 °C. 吸取并保存上层相。
    5. 加入400 µL 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v:v:v）
    6. 剧烈颠倒混匀约10秒，于4℃、17,000 g离心1分钟 °C. 吸取并保存上层相。
    7. 加入 400 µ氯仿：异戊醇（24:1，v:v）L
    8. 剧烈振荡混匀约10秒，4℃下以17,000 g离心1分钟 °C. 吸取并保存上层相。
    9. 加入 40 µ3 M 醋酸钠（pH 7.0）的 L，加入 1 mL 95% 乙醇。
    10. 将无菌的 1.5 mL 离心管置于 -80 °将样品侧放在 -80°C 冰箱中 15 分钟。
    11. 将样品在 17,000 x g 4°C 下 10 分钟 °C.
    12. 弃去上清液，用 300 µ80%乙醇的L
    13. 将样品在17,000 x g 4℃下持续2分钟 °C.
    14. 弃去上清液，将沉淀物风干。待沉淀物完全干燥后，应呈现透明状。
    15. 将沉淀重悬于 20 µL 的无菌 H2O
    16. 使用分光光度计测量DNA浓度（参见 材料表）并确保 A260:280 比值高于1.8。
    17. 将 DNA 稀释至浓度为 0.8 µ克/µL 在无菌 H2O.
    18. 转录 DNA：将质粒 (0.8 µ克µL，60.8 µL），无菌 H2O (8.4 µL），10 mM NTP（5.2 µL），10 mM ATP（10.0 µL），1 mM M-7-G（11.6 µL），步骤 2.1.19 中提到的混合液（15.6 µL），RNAsin（5.2 µL）和适当的RNA聚合酶（4.8 µL）以形成 "一个反应体系" （总体积 = 121.6） µL），在聚合酶的最适温度（37℃）下孵育90分钟 °T7聚合酶的C；40 °SP6 聚合酶用 C
    19. 准备混合液时加入 200 µL 1 M HEPES（pH 7.9），100 µ1 M 醋酸镁，L2, 500 µ4 M KAc 的 L，100 µ20 mM 亚精胺，100 L µ0.5 M DTT 溶液，200 L µ升，无菌 H20.
      注意：只要保持试剂的指定比例，反应体系的体积可按需扩大或缩小。所使用的RNA聚合酶取决于所用质粒中的细菌启动子序列。
    20. 然后，使用苯酚和乙醇纯化并沉淀 mRNA，步骤同 2.1.2–2.1.15。将体积补至 400 µL，含无菌H2O（加入280） µL），并按照步骤 2.1.2–2.1.15 所述进行操作。将最终沉淀重悬于 20 µL 无菌 H2O.
    21. 使用分光光度计测定 mRNA 的浓度，确保 A260:280 比值约为2.0。
    22. 将 mRNA 稀释至 2.8 µ克/µL 在无菌 H2O，并在 -20℃ 保存 °50 摄氏度 µL 等分试样。
  2. 体外 翻译
    注意：目标DNA的体外转录翻译必须在蛋白导入实验当天进行。本实验需使用放射性标记的氨基酸，因此操作者必须具备放射性同位素使用许可，且所有操作与废弃物处理均须遵守所在机构的相关政策与要求。涉及放射性同位素安全防护的步骤已被省略或简要描述，因不同机构的具体规定可能存在差异。
    1. 准备足量的翻译反应混合液（表2) 以提供约 20 µ每个样品用于导入实验的线粒体需加入 L，并在翻译反应孔中加入相同体积。
    2. 在30℃下孵育反应30分钟 °C（时间可能因 mRNA 而异，25-60 分钟）。
    3. 记录 35根据所在机构的放射性安全要求使用 S-甲硫氨酸，并按照机构指南处理所有接触过放射性同位素的物品。
  3. 蛋白质导入
    注意：后续步骤需要使用 freshly isolated mitochondria。请参考线粒体分离方案。只要线粒体具有活性且功能完整，也可采用其他分离方法。后续步骤中所用的线粒体样品应重悬于上述重悬缓冲液中（表1线粒体样品的蛋白质浓度也必须在开始导入实验前进行测定。
    1. 翻译反应开始约15分钟后，分装90 µg 线粒体至无菌 1.5 mL 离心管中，30℃ 预孵育 °约 10 分钟，4 ℃
      注意：分装的线粒体量应多于实验实际使用量；仅 75 µg 实际上将会被使用。然而，过量分装并非必需。
    2. 在一组新的无菌 1.5 mL 离心管中，加入 75 µg 线粒体与 18 µL 的翻译反应体系中，30℃孵育 °C，孵育所需时间。
    3. 将翻译反应的剩余体积保持在冰上，以备后续使用。
      注意：蛋白导入是一个时间依赖性过程，因此建议首先开展时间进程实验，孵育时间可设定为1至60分钟。通常反应时间为30分钟。
    4. 在此期间，通过将1 g蔗糖与200 μL预冷的SEK缓冲液混合，制备蔗糖垫。 µ2.5 M KCl 溶液，10 L µL 1 M MgCl2, 100 µ1 M HEPES（pH 7.4）的 L，用无菌 H 将体积定容至 5 mL2O.
    5. 准备一组新的无菌 1.5 mL 离心管，与导入反应中的每根离心管一一对应。分装 600 µ将蔗糖垫液 L 加入各管中，置于冰上直至导入反应结束。
    6. 在适当的孵育时间后终止导入反应，将试管从30℃取出 °C，置于冰上，然后小心地将导入反应液转移至含有蔗糖垫的离心管顶部。
      注意：此步骤必须非常缓慢地进行，以确保线粒体不受损伤或破裂。蔗糖垫有助于减缓线粒体的沉降速度。 "缓冲垫" 其在后续离心步骤中沉降至管底的过程。
    7. 将样品与蔗糖垫在 17,000 x g 4°C 下 15 分钟 °C.
    8. 通过混合 25 mL 2.4 M 山梨醇、2 mL 1 M HEPES（pH 7.4）和 72 mL 双蒸水配制破碎缓冲液2O.
    9. 准备用于SDS-PAGE凝胶电泳的裂解缓冲液：将50 mL加热的甘油与11.5 g SDS、31.25 mL 1 M Tris（pH 6.8）混合，并用双蒸水定容至500 mL2O.
    10. 样品制备时，混合 475 µ升裂解缓冲液，含25 µL of β-巯基乙醇，用于后续步骤。
      注意：裂解缓冲液可预先配制并在室温下保存；然而，添加 β-巯基乙醇需新鲜配制。
    11. 使用 P1000 移液器小心移除上清液，切勿扰动沉淀。将上清液弃置于适当的放射性废物容器中。
    12. 对于外膜的导入，使用 Tom40 进行操作，将沉淀重悬于 50 µ加入新配制的0.1 M碳酸钠（pH 11.5）L，冰上孵育30分钟。
    13. 孵育结束后，以14,000 x g 4°C 下 5 分钟 °C. 此步骤仅针对外膜导入反应进行。
    14. 为进行 SDS-PAGE 电泳制备样品，加入 20 µ20 L 破碎缓冲液 µ毫升裂解缓冲液，以及 β-巯基乙醇并充分重悬。加入5 µ样品染料 L
    15. 通过混合3个组分来制备对照/翻译反应孔 µ步骤 2.3.3 中剩余翻译反应的 L 与 37 µ毫升裂解缓冲液和 5 µL 样品染料。充分混匀。
    16. 将样品在95℃下煮沸5分钟 °C，并以低速轻轻离心，避免线粒体沉淀。
    17. 将样品加入SDS聚丙烯酰胺凝胶中。
      注意：凝胶浓度及相应的电泳时间取决于所导入的蛋白质。例如，OCT 的分子量为 37 kDa，其成熟加工后的条带略小；因此，使用 12% 的凝胶可实现这些条带的良好分离。
    18. 电泳完成后，取出凝胶并将其放入双蒸水中2O.
    19. 在通风橱中，将凝胶放入5%三氯乙酸（TCA）中煮沸5分钟，并持续搅拌或移动凝胶以避免破裂。
      注意：TCA 有助于凝固凝胶以便观察；可在本生灯上的金属托盘中进行。使用足量 TCA 充分覆盖凝胶，约½ 完整。
    20. 移去凝胶并将其放回双蒸水中2O. 在约 50 rpm 的旋转平板上振荡 1 分钟。
    21. 在旋转平台上用 10 mM Tris 溶液洗涤凝胶，转速约为 50 rpm，持续 5 分钟，所用液体体积应足以充分覆盖凝胶，约½ 容器的
    22. 用1 M水杨酸在旋转板上孵育凝胶30分钟以沉淀蛋白质，再次使用足量水杨酸充分覆盖凝胶，约½ 所用容器的
    23. 按照步骤 2.3.24-2.3.31 所述方法对凝胶进行脱水处理。
      注意：这可以通过多种方式完成。可以使用凝胶干燥仪（参见 材料表) 提供了一种省时的选项（如下所述）；然而也可使用其他市售方法/试剂盒，这些方法可能更具成本效益，但耗时更长。凝胶干燥试剂盒可作为替代方案，无需加热或抽吸，而是将凝胶夹在玻璃纸片之间自然风干，以防止变形。
    24. 将一张大的吸水纸铺在凝胶干燥器的多孔板上。在凝胶放置区域放一张纸巾。
    25. 裁剪一张15 cm × 20 cm的滤纸，将其放置在纸巾上。
    26. 使用另一张15 cm x 20 cm的印迹纸从容器中舀出凝胶，并将其平整地放置在第一张印迹纸上。
    27. 裁剪一块稍大些的保鲜膜，约20 cm × 25 cm，将其平铺在凝胶上，确保保鲜膜下方无褶皱或气泡。
      注意：可能需要尝试几次，但必须确保无残留的气泡。
    28. 轻轻将凝胶干燥器的塑料盖板盖在包裹物上方，再次确保无气泡或褶皱。
    29. 打开泵/真空装置，确保塑料盖已形成密封。通过掀开塑料盖的一角来测试密封性，并等待其重新密封。
    30. 关闭凝胶干燥器并运行90分钟。将温度设置为从30开始 °C，逐渐达到80 °C，然后返回至30 °运行结束时的 C
    31. 脱水后，凝胶将固化并变得如纸般轻薄。用干燥过程中使用的塑料膜包裹凝胶。
    32. 将脱水后的凝胶放入暗盒中，并加入磷光成像膜（参见 材料清单），白色面朝向凝胶。曝光时间因情况而异，但通常为 24–48 小时以观察条带。
    33. 使用任何能够进行磷成像的合适成像仪，通过放射自显影技术进行可视化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们已充分证明，该方案是一种有效的检测方法，可用于测定前体蛋白进入功能完整分离的骨骼肌线粒体的导入速率。与未处理条件相比，典型的前体蛋白（如苹果酸脱氢酶（MDH））进入基质的导入过程对膜电位敏感，因为该过程可被呼吸链解偶联剂缬氨霉素所抑制(图2A)。当线粒体内膜和外膜在去垢剂Triton X-100存在下被溶解时，蛋白导入也会受到阻碍。该导入过程对外源性ATP的存在具有敏感性，ATP的作用是使前体蛋白解折叠，以便其跨膜转运，并且该过程受到呼吸速率和ATP供应速率的严格调控（数据未显示20）。在肌原纤维间线粒体和肌膜下线粒体组分之间，其蛋白导入效率也存在明显差异，部分原因在于这两类线粒体中蛋白导入机制的表达水平不同，以及其呼吸速率的差异(图2B)。

骨骼肌中的线粒体是高度动态的细胞器，能够迅速响应能量需求的变化。在长期运动或电刺激诱导的收缩活动后，肌肉...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

线粒体在其合成和细胞内扩增过程中，独特地依赖于细胞核基因组和线粒体基因组的表达与协调。然而，细胞核基因组编码了线粒体蛋白质组的绝大部分（99%），这凸显了蛋白质导入机制在线粒体生物发生中的重要性。蛋白质导入还作为一种重要的信号事件发挥作用，因为导入失败可促进未折叠蛋白反应和/或线粒体自噬的启动15,16,26。由于蛋白质导入依赖于多种功能性通道和分子伴侣的表达、完整的膜电位以及ATP的可利用性，因此对线粒体蛋白质导入的评估可为细胞器的健康状况和能量状态提供有价值的见解。

评估线粒体蛋白质导入能力需要采用标准的差速离心技术，从周围组织中分离出该细胞器。这一评估方法与评估线粒体酶活性的Vmax类似，需在严格控制的时间和底物浓度条件下进行，并排除细胞胞质因素的干扰。本文所述的分离方法或其类似版本，多年来已被广泛用于评估线粒体呼吸和酶活性8

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济方面的还是其他方面的。

致谢

作者谨此感谢麦吉尔大学的 G.C. Shore 博士、华盛顿医学院的 A. Strauss 博士以及拉筹伯大学的 M.T. Ryan 博士，他们最初提供了本研究所用的表达质粒。本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 D. A. Hood 提供的资金支持。D. A. Hood 还担任加拿大细胞生理学研究讲席教授。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2% BSASigmaA2153
35S-甲硫氨酸Perkin ElmerNEG709A500UC购买需要有效的放射性同位素许可证
ATPSigmaA7699
吸水纸；Whatman 3MM CHR 纸Thermo Fisher05-714-5
用于胶片的暗盒KodakKodak Xomatic
离心管Thermo Fisher3138-0050
氯仿Thermo FisherC298-4
DTTSigmaD9779-5G
EDTABioShopEDT002
EGTASigmaE4378
凝胶干燥仪BioRadModel 583
凝胶干燥试剂盒Sigma 或 BioRadZ377570-1PAK 或 OW-GDF-10市面上有多家公司提供多种选择，此处仅列出少数示例。
甘油Caledon Laboratory Chemicals5350-1-40
HEPESSigmaH3375
高速离心机Beckman CoulterAvanti J-25 离心机
匀浆器IKAT25 Digital Ultra Turrex
异戊醇，或 3-甲基丁醇SigmaI9392
KAcBioShopPOA301.500
KClSigmaP3911
M7GNew England BiolabS1404S用 1000 µL 20 mM HEPES 稀释，配制成 1 mM 储存液
MgClBioShopMAG510
MgSO4Thermo FisherM65-500
MOPSBioShopMOP001
NaClBioShopSOD001
NTPThermo FisherR0191
OCT 质粒--由加拿大蒙特利尔麦吉尔大学 G. C. Shore 博士惠赠
pGEM4Z/hTom40 质粒--由澳大利亚墨尔本拉筹伯大学 M. T. Ryan 博士惠赠
pGMDH 质粒--由华盛顿大学医学院 A. Strauss 博士惠赠
苯酚SigmaP4557
苯酚:氯仿:异戊醇SigmaP3803也可按提供的比例自行配制
磷屏FujifilmBAS-IP MS 2025
兔网织红细胞裂解液PromegaL4960避免反复冻融；收到后立即分装；氨基酸也随试剂盒提供
RNAsinPromegaN2311
高速离心机转子Beckman CoulterJA-25.50
SDSBioShopSDS001.500注意：吞食或吸入有害，需佩戴口罩。
乙酸钠BioshopSAA 304
碳酸钠VWRBDH9284
水杨酸钠Millipore Sigma106601
山梨醇SigmaS6021
SP6 RNA 聚合酶PromegaP1085
分光光度计Thermo FisherNanodrop 2000
亚精胺SigmaS-2626
蔗糖BioShopSUC507
T7 RNA 聚合酶PromegaP2075
台式离心机Thermo FisherAccuSpin Micro 17
三氯乙酸Thermo FisherA322-500
TrisBioShopTRS001
β-巯基乙醇SigmaM6250-100ML

参考文献

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83(2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182(2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

线粒体生物发生线粒体分离蛋白质转运机制SDS-PAGE 电泳线粒体膜电位氧化磷酸化放射自显影成像线粒体肌病
骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。